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La roya del cafeto es causada por el hongo Hemileia vastatrix, un patógeno biotrófico que afecta hojas de Coffea y se considera la enfermedad más importante en el cultivo a nivel mundial. Este hongo causa defoliación y reduce el rendimiento de los cafetos (Avelino et al., 2015). La severidad de las recientes epidemias de la roya en Centroamérica y México ha ocasionado pérdidas del 40 al 50% en el rendimiento del cultivo (Cressey, 2013). De acuerdo a la Organización Internacional del Café (OIC, 2015), los factores económicos (descapitalización de productores) y agronómicos (falta de manejo del cultivo) han contribuido a alcanzar dichas pérdidas.
En respuesta a la crisis cafetalera debida a la roya de cafeto, en Centroamérica se implementaron acciones a corto plazo; sin embargo, las principales estrategias para su manejo se enfocan especialmente hacia el control químico y el uso de variedades resistentes (Zambolim et al., 1997; Avelino et al., 2015 y Escamilla, 2016).
El control químico se considera poco promisorio para la cafeticultura mexicana, por tratarse de un cultivo de importancia social, además de considerar el sector de productores orgánicos. El control biológico representa una alternativa, potenciando el uso de microorganismos que provengan del mismo ambiente de acción del fitopatógeno.
Dentro de las estrategias de control biológico de los fitopatógenos, una de las opciones es el uso de micoparásitos, hongos que tienen la capacidad de sobrevivir a expensas de otro hongo (Boosalis, 1964) afectando las estructuras reproductivas del patógeno, lo cual limita su desarrollo y diseminación (Barros et al., 1999).
Diferentes micoparásitos han sido reportados sobre fitopatógenos, entre ellos, Trichoderma sp. y Penicillium vermiculatum sobre Rhizoctonia solanii (Rolz et al., 2013); Calcarisporium parasiticum, asi como Physalospora spp., y Trichoderma spp. sobre Armilaria mellea (Boosalis, 1964) y otros hongos como Sclerotinia spp. (Hoyos et al., 2008), Rhizoctonia solani, Phytophthora nicotianae, P. capsici y Pythium aphanidermatum, sobre Penicillium sp. y Fusarium sp. (Sandoval y López, 2001). Dentro del grupo de las royas, las principales relaciones micoparasíticas reportadas son: Cladosporium tenuissimum sobre Uromyces apendiculatus (Assante et al., 2004); Cladosporium uredinicola sobre Puccinia puta (Barros et al., 1999); Simplicillium lanosoniveum afectando a Phakopsora pachyrizi (Gauthier et al., 2014) y Verticillium lecanii en Puccinia recóndita (Spencer y Atkey, 1981).
Dada la importancia de la enfermedad de la roya de café, se han realizado diferentes estudios para determinar las especies con micoparasitismo asociados a H. vastatrix (Carrión, 1988; Carrión y Rico, 2002; Mahfud et al., 2006; Rolz, 2013 y Haddad et al., 2014); sin embargo, la mayoría de ellos sólo registró la presencia de micoparásitos de la roya del café y no su potencial como posibles agentes de control biológico de la enfermedad.
Con base en los antecedentes descritos, en el presente trabajo se plantearon los objetivos de aislar e identificar micoparásitos de pústulas de H. vastatrix, así como evaluar su potencial de control de la enfermedad in vitro.
Materiales y métodos
Sitios de colecta. En un perfil altitudinal en el estado de Veracruz, se seleccionaron tres localidades productoras de café: Matlaluca, del municipio de Zentla (con altitud de 650 msnm, temperatura media anual de 22 °C y 1300 mm de precipitación anual); El Ocote (con altitud de 1030 msnm, temperatura media anual de 19.8 °C y 1682 mm de precipitación anual) y Tlavictepan (1250 msnm, temperatura media anual de 17.2 °C y 1967 mm de precipitación anual), del municipio de Huatusco (Cuadro 1).
Cuadro 1 Descripción de los sitios de colecta de micoparásitos de roya del cafeto.
| Localidad | Coordenadas | Altitud (msnm) |
Temperatura media anual (°C) |
Precipitación media anual (mm) |
Sistema de producción |
Variedad |
| Matlaluca | 19°07´56´´ 96°46´30´´ |
650 | 22 | 1300 | Policultivo Tradicional |
Typica, Bourbon |
| El Ocote | 19°07´56´´ 96°53´30´´ |
1030 | 19.8 | 1682 | Policultivo comercial |
Costa Rica, Colombia, Typica |
| Tlavictepan | 19°09´40´´ 96°56´34´´ |
1250 | 17.2 | 1967 | Policultivo comercial |
Costa
Rica, Colombia, Typica |
Nota. Según la clasificación de Nolasco y Toledo (1996), se define como sistema de Policultivo comercial al que utiliza diferentes combinaciones de árboles del bosque y frutales introducidas, incluyendo control de arvenses y poda selectiva de cafetos y sin manejo fitosanitario, mientras que el Policultivo comercial utiliza especies comerciales de sombra, realizando labores generales y particulares en los cultivos
Muestreo de material vegetativo. En cada localidad se recorrieron cinco parcelas de una hectárea, en cada una se realizaron muestreos dirigidos a plantas con síntomas de roya y con signos de posibles micoparásitos en las pústulas. El periodo de colecta fue de diciembre de 2014 a enero de 2015 y en cada parcela se colectaron 40 hojas en diferentes cafetos. Las hojas se envolvieron con papel absorbente estéril y se colocaron dentro de bolsas plásticas debidamente etiquetadas. Se trasladaron al laboratorio de Biodiversidad y Sistemática de Hongos del Instituto de Ecología, A. C. para su preparación y análisis.
Aislamiento de micoparásitos. En laboratorio, de cada hoja colectada se seleccionaron seis pústulas de roya con presencia de signos de posibles micoparásitos. Bajo un microscopio estereoscópico (Leica® Heerbrug, Suiza) y con la ayuda de una aguja hipodérmica se tomaron porciones de micelio de los hongos asociados a las pústulas de roya y se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo agar avena con antibiótico (Cloranfenicol® Toluca, México) al 1%. Los cultivos se mantuvieron a 24+1°C por diez días y se purificaron por punta de hifa.
Identificación taxonómica. La caracterización morfométrica de los aislamientos puros se realizó mediante la elaboración de preparaciones temporales y permanentes de los aislamientos, y su posterior observación en un microscopio compuesto (Leica, DM550®, Heerbrug, Suiza) y el software Leica Aplication Suite Educational Zoom (LAS EZ) versión 3.0. La identificación a género consideró la presencia y dimensiones de fiálides y conidios (n=30), y se describieron con ayuda de las claves taxonómicas especializadas: Barranco (2004), Barnet and Lilly (1958), Domsch et al., (1980), Hirose et al., (2011), Hoog (1974), Zare et al. (2000), Zare y Gams, 2001.
Evaluación del potencial micoparasítico de microorganismos aislados. Tres aislamientos (Lecanicillium sp.-TlaP4, Simplicillium sp.-MaP2 y Calcarisporium sp.-OcP2) se seleccionaron para evaluar su potencial como microorganismo micoparásito de H. vastatrix; el criterio de selección fue la tasa de crecimiento de los aislamientos. Los aislamientos se incubaron en Papa Dextrosa Agar (PDA) por 10 días, posteriormente se realizó una suspensión de esporas a una concentración de 5x106 esporas ml-1, a cada suspensión se le adicionó una alícuota de Tween 20® al 0.01%.
La prueba in vitro para evaluar el micoparasitismo se realizó de acuerdo a la metodología propuesta por Eskes et al. (1991), con adaptaciones. Hojas de Coffea arabica de la variedad bourbón con síntomas y signos de roya anaranjada, se colectaron en campo y se conservaron en bolsas de polipapel para su análisis en laboratorio. Bajo microscopio estereoscópico se analizaron las pústulas para seleccionar sólo aquellas que no presentaron microorganismos micoparásitos. Cinco discos foliares de 1.5 cm de diámetro, con la presencia de al menos una pústula de roya, se colocaron en una placa Petri con agar agua; cada disco se consideró como una repetición de cinco. Se asperjó 1 ml de la suspensión de esporas previamente preparada con cada una de las cepas y al grupo testigo se le asperjó agua destilada estéril. Los tratamientos fueron establecidos bajo un diseño completamente al azar y se mantuvieron a fotoperiodos de 12 h luz y 12 h obscuridad, a 24 °C.
Para determinar el porcentaje de micoparasitismo en las pústulas de roya, de cada disco foliar se realizó un raspado de las lesiones esporulantes y se suspendió en 1 ml de agua destilada adicionándole 100 µl de Tween 80 al 0.01%. De la dilución obtenida se tomaron 100 µl y se observaron bajo microscopio para contabilizar el número de uredosporas parasitadas y no parasitadas en la muestra. Las evaluaciones se realizaron cada 24 horas por un periodo de cinco días.
Análisis estadístico. El porcentaje de parasitismo en las uredosporas evaluadas cada 24 horas se analizaron a través de un análisis de varianza y una prueba de separación de medias de Tukey con ayuda del programa Statistica versión 6.0.
Resultados y discusión
Aislamiento de micoparásitos. Se obtuvieron un total de 23 aislamientos de micoparásitos de los diferentes sitios de muestreo. El mayor número (10) se obtuvo de la zona altitudinal media (El Ocote, 1030 msnm), y el menor número (6) de la zona altitudinal baja con mayor temperatura y precipitación respecto a los otros sitios de muestreo (Zentla, 650 msnm), considerando que las condiciones climáticas son factores que determinan el desarrollo de los hongos, los resultados difieren de lo reportado por Martins et al., (2015), que reporta mayor incidencia de micoparásitos sobre H. vastatrix en la estación seca del año, quien también sugiere que el micoparásito Lecanicillium lecanii podría ser más persitente a bajas temperaturas. Esto también difiere de lo reportado por Bagyaraj et al., (2015) que encontró mayor población de bacterias y hongos en sistemas de rusticanos, por lo que en este caso se reporta mayor diversidad en condiciones de policultivo comercial donde la sombra es menos diversa que en el sitio de zona baja.
Se identificaron cuatro géneros de hongos: Calcarisporium sp. (4), Lecanicillium spp. (7), Simplicillium spp. (8), Sporothrix sp. (4), siendo los más abundantes Simplicillium spp. y Lecanicillium spp.
Descripción microscópica de los géneros.
Lecanicillium spp. Presentó hifas septadas, hialinas; con fiálides (15-23 x 0.5-1.2 µm) ordenadas en grupos de tres a cinco por verticilo (Zare y Gams, 2001), y no en pares o solitarias como lo señaló Cañedo y Ames (2004), además fueron ligeramente más anchas en la base. Los conidios fueron elípticos (de 5-7x1-2 µm) y emergiendo en el extremo superior de la fiálide (Figura 1 A); generalmente se observaron en cabezuelas (Barranco, 2004).
Figura 1 Micoparásitos encontrados en pústulas de Roya del Cafeto (Hemileia vastatrix) y sus características morfológicas en Avena-Agar. Dónde: Lecanicillium sp. (A-40X); Calcarisporium sp. (B-40X); Simplicillium sp. (C-40X) y Sporothrix sp. (D-40X). Barra: 10 µm
Calcarisporium sp. Presentó hifas hialinas y septadas, las cuales sostienen conidióforos cortos (Figura 1 B) y sobre ellos, fiálides verticiladas que miden 4-6 x 1-2 µm. Una característica que distingue a este género es la forma de las fiálides, las cuales se observaron anchas en la base y terminan en pequeños dentículos en el ápice (Hirose et al., 2011). Las fiálides simples se forman directamente de la hifa (Barnet, 1958). Los conidios son ovoides con medidas de 3-5x1.3-1.8 µm.
Simplicilllium spp. Presentó hifas hialinas, delgadas y septadas; los conidioforos (15-35x0.8-1µm) emergiendo solitarios (Zare et al., 2000) en forma perpendicular a las hifas y adelgazan hacia la punta (Molina et al., 2012). Las hifas generalmente se observaron entrelazadas (Figura 1 C). Los conidios (1-3 µm) fueron circulares y en ocasiones elípticos, con esporulación abundante y disposición en cabezas mucoides (Domsch et al., 1980).
Sporothrix sp. Presentó hifas vegetativas hialinas, con septos cortos y dentículos (Figura 1 D); no se observaron conidióforos a los 10 días, los conidios se observaron sobre los dentículos de las hifas (Hoog, 1974); se observó abundante esporulación en medio Agar-Avena.
Micoparasitismo in vitro sobre H. vastatrix. Cuarenta y ocho horas posteriores a la inoculación de tratamientos, se obtuvieron diferencias estadísticas significativas (P=0.05) entre tratamientos (Cuadro 2). Los mayores porcentajes de micoparasitismo observados durante las primeras 72 horas corresponden a los aislamientos de Simplicillium sp., y Calcarisporium sp., mientras que a las 96 y 120 h posteriores a la inoculación, los mayores porcentajes correspondieron a Simplicillium sp. y Lecanicillium sp. (Cuadro 2).
Cuadro 2 Evaluación del porcentaje de parasitismo de tres microorganismos sobre pústulas de roya de café (Hemileia vastatrix) en condiciones in vitro.
| Tratamiento | Horas después de la inoculación | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | |
| Testigo | 0.00+0a | 0.00+b | 0.00+c | 0.00+c | 0.00+0c |
| Calcarisporium sp. | 0.00+0a | 20.87+13ab | 41.02+13ab | 50.12+0.7b | 51.60+10b |
| Lecanicillium sp. | 2.68+2 a | 9.85+6b | 17.49+16bc | 49.19+13b | 68.10+12b |
| Simplicillium sp. | 0.89+2 a | 42.73+9az | 51.19+16az | 83.48+3az | 88.86+11az |
z=Medias +Desviación estándar, los valores con la misma letra en las columnas no difieren estadísticamente (Tukey p=0.05)
El género Simplicillium se reporta como parte de los hongos asociados a roya del café en Puerto Rico y México (James et al., 2016). Las especies de este género han sido registradas principalmente en asociación con H. vastatrix (Zare y Gams, 2001), mientras que su potencial como agente de control biológico de otras enfermedades ha sido poco estudiado. Ha sido registrado en asociación con hongos fitopatógenos como Alternaria brassicicola, Sclerotium rolfsii y Rhizoctonia solani (Shyang et al., 2017), también con nematodos (Gams y Zare, 2003) y áfidos (Shyang et al., 2017).
El género Lecanicillium ha sido ampliamente estudiado, documentándose como agente de control biológico de mildius y uredinales (Alavo, 2015). Mahfund et al. (2006) señala que los efectos de dos especies de este género pueden actuar desde la decoloración de uredosporas, formación de micelio blanco sobre ellas o necrosamiento, dependiendo el tiempo de aplicación. Esto sugiere que el porcentaje de parasitismo de Lecanicillium sp., varía entre especies y aislamientos (Arriola et al., 1998).
Finalmente, en estudios previos se ha señalado el parasitismo de Calcarisporium sp., sobre roya del cafeto de manera natural (Carrión y Rico, 2002).
Conclusiones
Los géneros Lecanicillium sp., Calcarisporium sp., Sporothrix sp. y Simplicillium sp. fueron aislados de pústulas de roya de cafeto en los municipios de Huatusco y Zentla, en el estado de Veracruz, México.
Los mayores porcentajes de micoparasitismo en las pruebas in vitro se obtuvieron con las cepas de Simplicillium sp. (88.86%) y Lecanicillium sp. (68.10%), a las 120 horas posteriores a la inoculación.
