La enfermedad viral más importante del cultivo de cebolla Allium cepa es la mancha amarilla causada por Iris yellow spot virus (IYSV) (Bunyaviridae:Tospovirus) (^{Kritzman et al., 2001}) ya que ocasiona una importante disminución del tamaño del bulbo (^{Gent et al., 2004}). En hojas y tallos florales de cebolla el IYSV ocasiona manchas cloróticas de forma alargada o de diamante, color pajizo y aspecto seco, con ausencia o presencia de islas verdes en el centro de las lesiones (^{Gent et al., 2006}). El genoma de IYSV consiste de tres segmentos de ARN monocatenario de sentido negativo denominados grande (L), mediano (M) y pequeño (S) (^{Bag et al., 2009}; ^{Bag et al., 2010}). El segmento S contiene al gen N que codifica para la nucleoproteína de la cápside comúnmente utilizado para la identificación y clasificación de tospovirus debido a su grado de divergencia (^{Pappu et al., 2006}), además de estudios de distribución geográfica y diversidad genética (^{Iftikhar et al., 2014}). Este virus se encuentra ampliamente distribuido a nivel mundial (^{Gent et al., 2006}) y en México ha sido reportado desde 2012 en cultivos de cebolla del estado de Morelos causando la enfermedad conocida como “mancha amarilla” con una incidencia de 100% y severidad superior al 90% (^{Ramírez et al., 2016}). En esta entidad se han observado dos tipos de síntomas asociados a IYSV por lo que la presente investigación tuvo como objetivo describir los síntomas que ocasionan ambos aislamientos en Nicotiana benthamiana, conocer si hay diferencias en el segmento N del genoma y su relación filogenética con otros aislamientos. En el ciclo 2014-2015 se colectaron plantas de cebolla en los municipios de Ayala, Axochiapan, Emiliano Zapata, Jojutla, Puente de Ixtla, Tlaquiltenango, Xochitepec y Zacatepec en el estado de Morelos, México, con síntomas de “mancha amarilla” asociados a IYSV. El tejido foliar de cebolla se clasificó de acuerdo con la severidad de los síntomas observados, se congeló con nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Se inocularon mecánicamente (^{Mandal et al., 2006}) plantas de N. benthamiana con tejido foliar de cebolla positivo para Iris yellow spot virus por RT-PCR que mostraron síntomas típicos o severos. Como control negativo se utilizaron dos plantas de N. benthamiana frotadas únicamente con el amortiguador y el carborundum. Un grupo de cinco plantas inoculadas con cada uno de los aislamientos típicos o severos se mantuvieron en cámara bioclimática (temperatura media de 25 °C, 91% de humedad relativa (HR) promedio, 77% de HR mínima y 99% de HR máxima; con un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad) y otro grupo de plantas en invernadero (temperatura promedio de 25 °C, mínima y máxima de 13 y 39 °C, respectivamente; 50% de HR promedio, 27 y 71%, mínima y máxima, respectivamente). Las plantas se observaron cada tercer día durante tres semanas para registrar el período de incubación y tipo de síntomas. Se extrajo ARN total a partir 0.1 g de tejido foliar de plantas de cebolla colectadas en campo que presentaban síntomas asociados a IYSV y a partir de 0.25 g de hojas de N. benthamiana inoculadas mecánicamente, en este último caso, a los 10, 15 y 20 días post-inoculación (dpi) con TriReagent^® (Ambion^®) siguiendo el protocolo del fabricante. Se determinó la concentración y calidad del ARN en un Nanodrop^® (Thermo Fisher Scientific, Inc) y su integridad mediante electroforesis en un gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio (0.5 µg/ml). La síntesis de cDNA se realizó con M-MLV Reverse Transcriptase (Promega^®) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. La detección de IYSV en cebolla se realizó con los iniciadores IYSV917L e IYSV56U que amplifican un segmento de 896 pb correspondiente al gen N (^{Robène et al., 2006}). Como control de la reacción de PCR se amplificó una región del gen ribosomal 18S (^{Zamboni et al., 2008}). Con el propósito de determinar si existían diferencias en la secuencia de nucleótidos entre ambos aislamientos de IYSV inoculados en N. benthamiana, se diseñaron los iniciadores IYSV-KO4 (5’-CTTAACTA-ACACAAATACTG-3’) e IYSV-KO6 (5’-AGA-GCAATCGAGGTATAAAAC-3’) para amplificar el gen N con el programa Vector NTI™ Suite 8.0 con base en la secuencia AF001387 de IYSV depositada en el GenBank. Las secuencias obtenidas fueron editadas con los programas Chromas Lite 2.0 y Vector NTI™ Suite 8.0 y depositadas en la base de datos del GenBank (KX434621-434623, KX443600-443604, KX443598 y KX443599). El alineamiento múltiple se llevó a cabo con ClustalW y el análisis filogenético se realizó por el método Neighbor-joining (2000 repeticiones) con el programa MEGA6 (^{Tamura et al., 2013}). Se colectaron 78 plantas de cebolla que mostraron síntomas de “mancha amarilla” asociados a IYSV en 14 localidades de los ocho municipios muestreados. Las plantas colectadas fueron de seis variedades de cebolla: Stratus (33.3%), Carta Blanca (24.4%), Florentina (10.2%), Cirrus (6.4%), Cal 214 (6.4%) y Joya (2.6%); el 16.7% restante de las muestras no fue posible identificar la variedad. Las plantas se dividieron en dos grupos con base en los síntomas que mostraban: a) síntomas típicos, consistentes en manchas secas amarillas a blanquecinas con halo clorótico y forma alargada (Figura 1B) y b) síntomas severos, en los cuales se observaban manchas blancas con o sin halo clorótico, alargadas, de aspecto seco que en muchos casos cubrían la lámina foliar (Figura 1C). Se seleccionaron cuatro aislamientos típicos y cinco aislamientos severos para su análisis.

Figura 1 Síntomas asociados a Iris yellow spot virus en cebolla. A. Planta asintomática (Pa). B. Síntoma típico (St). C. Síntoma severo (Ss). D. Productos de PCR obtenidos con los iniciadores IYSV917L e IYSV56U que amplifican un segmento del gen N de IYSV. -: control negativo. MP: Marcador de peso molecular 100 pb. 

Los iniciadores IYSV917L e IYSV56U amplificaron el fragmento esperado de ~ 900 pb en todos los aislamientos típicos, mientras que en el caso de los aislamientos severos se tuvo un amplicón de ~500 pb (Figura 1D) y ambos tuvieron 99% de identidad con la nucleoproteína de la cápside del segmento N de IYSV reportadas en el GenBank. Estos resultados muestran que los amplicones de 900 y 500 pb están asociados a aislamientos típicos o severos de IYSV, respectivamente. La severidad de los síntomas ocasionados por los aislamientos típicos y severos de IYSV en N. benthamiana fue diferente según la condición ambiental en la que se mantuvieron las plantas después de la inoculación independientemente de la fuente de inóculo. En cámara bioclimática, a los 7 dpi los síntomas ocasionados por cuatro de los cinco aislamientos severos fueron sistémicos, consistentes en necrosis de nervaduras, constricción de peciolos, lesiones necróticas foliares rodeadas por un halo café oscuro, clorosis y marchitamiento. A los 22 dpi se observó una marchitez severa similar a la reportada por ^{Bag et al. (2012)} (Figura 2B). En el caso de los asilamientos típicos, uno ocasionó lesiones cloróticas y necróticas con necrosis de venas y peciolos, dos más causaron lesiones cloróticas y necróticas sin la afectación de venas y peciolos; el cuarto aislamiento no ocasionó síntomas. Por otro lado, en invernadero cuatro aislamientos severos y dos típicos ocasionaron una infección sistémica a los 10 dpi consistente en clorosis y arrugamiento de hojas. Un aislamiento típico y uno severo causaron más lesiones cloróticas en las hojas (Figura 2B). El hecho de que no todos los aislamientos típicos o severos produjeran los mismos síntomas (o incluso que alguno no causara alteraciones visibles) en esta fecha de evaluación puede atribuirse al proceso de inoculación mecánica pues se sabe que existen problemas para la transmisión mecánica de IYSV (^{Bag y Pappu, 2009}). A pesar de la inconsistencia en los síntomas iniciales observados, en invernadero todas las plantas inoculadas mostraron marchitez a los 30-35 dpi independientemente del aislamiento. Por otro lado, en un estudio realizado con variantes de Tobacco mosaic virus inoculadas en Nicotiana tabacum se encontraron diferencias en síntomas asociadas a la temperatura (^{Scholthof, 2008}). Se sabe que de manera natural el ambiente puede contribuir al incremento o disminución de la frecuencia de poblaciones de virus (^{García et al., 2001}). En el caso de IYSV no se precisan condiciones ambientales que determinen variación en síntomas. No obstante, se ha relacionado la divergencia genética entre aislamientos, la gama de hospedantes y la respuesta de éstos a una adaptación ambiental (^{Pozzer et al., 1999}).

Figura 2 A. Productos de PCR obtenidos con los iniciadores IYSV-KO4 e IYSV-KO6 que amplifican el gen N + UTR5’ provenientes de aislamientos típicos y severos de IYSV. MP: Marcador de peso molecular 1 kb (Promega), -: control negativo planta asintomática. B. Síntomas en plantas y hojas de N. benthamiana inoculadas mecánicamente con dos aislamientos de Iris yellow spot virus mantenidas en dos condiciones ambientales. 

En todos los aislamientos típicos y severos analizados en la presente investigación mediante RT-PCR usando los iniciadores IYSV-KO4 e IYSV-KO6, se obtuvo el fragmento esperado de 1,100 pb que incluye el gen N + UTR5’ (Figura 2A). La comparación de las secuencias obtenidas en ambos aislamientos no mostró diferencias entre ellas, resultados similares reportados por ^{Bag et al. (2012)}. De acuerdo con ^{García et al., (2001)} las cepas virales se consideran como un conjunto de aislamientos que mantienen propiedades similares como son el rango de hospedantes, capacidad de transmisión y similitud de secuencias de nucleótidos, entre otras. En México el TSWV es el único tospovirus caracterizado biológica y molecularmente. ^{González (2014)} estudió tres aislamientos mexicanos de TSWV y encontró que la diferencia en la severidad podría estar asociada a cambios en los aminoácidos de las proteínas NSm, NSs y de las regiones intergénicas (IGR). Esto podría explicarse debido a que la proteína NSs de tospovirus actúa como un supresor del silenciamiento génico (^{Ocampo et al., 2016}) por lo que sería necesario analizar otros genes en estudios de caracterización molecular. Las secuencias obtenidas con los iniciadores IYSV-KO4 e IYSV-KO6 de los aislamientos típicos y severos analizados (Figura 2B) tuvieron de 98 a 99% de identidad con la nucleoproteína de la cápside del gen N de IYSV. El análisis in silico de las secuencias obtenidas (Datos no mostrados) con IYSV-KO4 e IYSV-KO6 de ambos aislamientos mediante RFLP con HinfI, mostró un patrón de restricción que incluye un fragmento mayor de 308 pb correspondiente con el genotipo IYSV_BR asociado con aislamientos de Asia (^{Iftikhar et al., 2014}). Por otro lado, se encontró que aislamientos de IYSV del estado de Zacatecas correspondieron al genotipo IYSV_NL relacionado con aislamientos de Norteamérica (^{Velásquez-Valle et al., 2016}). Asimismo, en Zacatecas y Michoacán se ha reportado la presencia de lesiones cloróticas en hojas con pequeñas islas verdes en el centro (^{Velásquez-Valle et al., 2016}; ^{Ávila et al., 2017}), mientras que en Morelos no se tiene registro de este tipo de síntoma (^{Ramírez-Rojas et al., 2016}). Estos resultados sugieren la existencia de variantes de IYSV en México que difieren biológica y molecularmente. Con respecto al análisis filogenético, los aislamientos de Morelos mostraron mayor similitud con los reportados en Canadá, Estados Unidos y Nueva Zelanda y no con los asiáticos donde se concentra principalmente el genotipo IYSV_BR.^{Iftikhar et al. (2014)} mencionan en su estudio que existen excepciones donde los genotipos IYSV_BR se agrupan con los IYSV_NL y viceversa; sin embargo, tales resultados podrían proporcionar información sobre el movimiento del virus entre países (^{Smith et al., 2006}). A su vez, los aislamientos típicos y severos se concentran en un clado que se divide en tres grupos: grupo I formado principalmente con aislamientos severos, mientras que el II y III por aislamientos moderados (Datos no mostrados). Por su parte, ^{Abad et al. (2003)} y ^{Bag et al. (2012)} estudiaron aislamientos procedentes de distintos estados del oeste de Estados Unidos; en el primer caso se encontró mayor diversidad genética entre aislamientos agrupándose con otros procedentes de diversos países, mientras que en el segundo estudio los aislamientos se agruparon dentro en un mismo clado. Con base en lo anterior, la formación de distintos grupos de aislamientos de IYSV que se generan de Zacatecas y Morelos sugiere una mayor diversidad genética de este virus en el país (^{Smith et al., 2006}). Esta diversidad puede influir en la eficiencia de transmisión del virus por trips vectores, gama de malezas hospedantes, severidad e incidencia de plantas con síntomas y, en general, en el progreso espacio-temporal de la enfermedad en ambas entidades (^{Ávila et al., 2017}).

En conclusión se tiene que los aislamientos típicos y severos de Iris yellow spot virus analizados en el presente estudio tuvieron la capacidad de infectar N. benthamiana y desarrollar síntomas similares con diferente severidad en dos condiciones ambientales. En el análisis del gen N no se encontraron cambios de secuencia de nucleótidos entre ambos aislamientos.