Identificación molecular de Cladosporium sp. aislado del A. angustifolia sintomático

100 mg de una mezcla de hifas y conidióforos fueron tomados del medio PDA conteniendo el hongo filamentoso. Las células fueron lisadas con perlas de vidrio-acidificadas (G-9268, 425-600 μm 0.5 mm de diámetro, Sigma-Aldrich Co., USA) en presencia de 300 μL del reactivo DNAzol (Thermofisher ^TM, USA). Los pasos siguientes fueron llevados a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ADN aislado fue lavado dos veces con una mezcla de fenol:cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1, v/v, Sigma-Aldrich Co., USA). Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo usando 1 μg de ADN disuelto en un volumen final de 50 μL. La identidad del microorganismo fue determinada por la amplificación del espaciador transcrito interno (ITS) usando los iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) y siguiendo las condiciones de PCR descritas por ^{White et al. (1990)}. El amplicón fue clonado en el vector TOPO TA (Thermofisher ^TM, USA) y fue secuenciado por triplicado en un aparato ABI PRISM 3700 (ABI, Foster City, CA). La proteína alergénica de C. herbarum (proteína de choque térmico 70, acceso S83210) fue amplificada por transcripción inversa a partir del ARN total del hongo, usando el reactivo TRIZOL (Thermofisher ^TM, USA) y la enzima SuperScritp II (Thermofisher ^TM, USA). Los ensayos de PCR fueron realizados con la enzima Platinum® ADN polimerasa de alta fidelidad (Thermofisher ^TM, USA) y los iniciadores GAGATCCTTCTTCTCGACGTCG y CCTTCTAATCGTTAACGCCATG. El protocolo de PCR para amplificar este ADNc constó de 94 °C por 5 min de desnaturalización inicial, seguida de 35 ciclos a 94 °C por 30 s, 57 °C por 30 s, 72 °C por 1 min y una extensión final de 72 °C por 4 min. El amplicón fue separado por electroforesis y visualizado en un gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio. Las secuencias fueron comparadas con las depositadas en la base de datos del NCBI (usando BLAST nucleotide) y la base MycoBank.

Pruebas de patogenicidad de Cladosporium sp. en tallos de A. angustifolia

Tallos jóvenes asintomáticos de Agave angustifolia fueron cortados y sumergidos en agua para evitar deshidratación durante el proceso experimental y se mantuvieron finalmente a 25 °C en fotoperiodo normal (12 horas de luz). Conidióforos del hongo se colectaron directamente con una aguja estéril y fueron inmediatamente inoculados en los tallos por penetración mecánica, con el objetivo de examinar los postulados de Koch. El proceso se realizó en una campana de flujo laminar. La apariencia de las manchas se observó durante 47 días.

Aislamiento de los ent-kaurenoides y su evaluación in vitro sobre Cladosporium sp.

500 g de raíces secas de Z. montagnifolia fueron extraídas con 2 L de etanol absoluto (J.T. Baker, USA) por 10 días a temperatura ambiente. El extracto etanólico crudo fue filtrado con papel Whatman grado 1 y subsecuentemente reducido a sequedad en un rotaevaporador (Buchi R200). La goma resultante fue recobrada y resuspendida en el mismo solvente para obtener soluciones madre de 100 mg mL^-1. Estas soluciones fueron directamente usadas para los métodos de dilución en agar y microdilución en caldo o se fraccionaron por HPLC para la obtención del ácido kaurenoico (ácido ent-16-kauren-19-oico) y el ácido grandiflorenico (ácido ent-kaur-9(11),16-dien-19-oico). La purificación semi-preparativa se llevó a cabo en un aparato Hewlett Packard 1050 acoplado a un detector de arreglo de diodos HP G1306A equipado con una columna Varian C₁₈ (250×4.5 mm D.I.; 5 μm tamaño de la partícula). Los metabolitos fueron colectados durante corridas continuas (100 μL de volumen de inyección) usando una fase móvil isocrática consistente de acetonitrilo (J.T. Baker, USA) al 70 % con 0.05 % de ácido acético (v/v) a un flujo de 1 mL min^-1 como lo describe previamente ^{Villa-Ruano et al. (2009)}. El tiempo de retención fue comparado con el de estándares puros disponibles en nuestro laboratorio. Los diterpenoides se resuspendieron en metanol (J.T. Baker, USA) para su posterior evaluación antifúngica. El método de difusión en agar se efectuó por disolución de distintas concentraciones (curvas dosisrespuesta de10-300 μg mL^-1) del extracto etanólico y/o diterpenoides puros en 10 mL de medio PDA (^{Valgas et al., 2007}). El hongo fitopatógeno fue inoculado por estriado masivo y estos experimentos fueron efectuados por quintuplicado. Las placas fueron visualizadas en un transiluminador de luz blanca. La obtención de los valores de la MIC se logró por el método de microdilución en caldo para hongos filamentosos propuesto por ^{Pfaller et al. (2000)} usando resazurina (Sigma-Aldrich Co., USA) como indicador de viabilidad celular. Las curvas de dosis respuesta (10-300 μg mL^-1) para obtener los valores de la MIC fueron efectuadas en quintuplicado. Las reacciones colorimétricas se midieron a 545 nm. Los valores de la MIC fueron adicionalmente validados por ANOVA-Tukey Test (p<0.01) usando el programa GraphPad 6.05.

Como resultado de la incubación del tejido necrótico en medio PDA, fue aislado un hongo filamentoso verde-marrón (entre otros aislados) con pequeños conidios terminales (Figura 1 A-B). Este hongo fue observado como el más dominante en todas las incubaciones efectuadas. La macroscopia y microscopia óptica del microorganismo sugirió su similitud con Cladosporium sp. (^{Bensch et al., 2012}). Las reacciones de PCR con el ADN genómico y los ADNc’s obtenidos a partir de transcripción inversa produjeron fragmentos de ~500 and ~800 pb (Figura 1 C). Los análisis de la secuencia del ITS en las bases de datos del NCBI y del MycoBank demostraron su homología (94 %) con el gen de ARN ribosomal 18S del aislado “olrim85” (ID: AY354234.1) de C. herbarum (Figura 2A). Mientras tanto, la secuencia codificante de la proteína alergénica tuvo un 99% de homología con la secuencia ID:X81860.1 de C. herbarum depositada en el NCBI (Figura 2B). Estos datos moleculares sugirieron fuertemente la identidad del hongo como C. herbarum.

Figura 1. Macroscopia y microscopia óptica de C. herbarum aislado de tallos sintomáticos de Agave. A, C. herbarum crecido en medio PDA. B, organización de las hifas y conidióforos de C. herbarum, la imagen fue grabada a 40X. C, identificación molecular de C. herbarum por la amplificación de un ADNc parcial proveniente de una HSP70 alergénica (~800 bp) y el ITS del gen RNA ribosomal 18S (~500bp). Los pesos moleculares aproximados son mostrados. 

Figura 2. Resultados de los alineamientos por BLAST entre la secuencia original (query) de C. herbarum y su homología con aquellas depositadas en la base de nucleótidos del NCBI (subject). A, secuencia ITS; B, secuencia HSP70. 

La inoculación del hongo en tallos asintomáticos de Agave exhibieron síntomas de necrosis desde el día 4 (Figura 3B). A pesar de que la penetración con la aguja estéril produjo un daño en los tallos (Figura 3A), la inoculación del hongo causó una evidente respuesta sistémica y un oscurecimiento de la vasculatura (Figura 3B). Dicha respuesta sistémica fue también percibida por manchas amarillas que circundaron las células necrosadas, las cuales fueron visibles desde el día 15 (Figura 3B). Interesantemente, las lesiones generadas únicamente por el daño mecánico fueron casi imperceptibles al día 47 (Figura 3A). Contrariamente, aquellas lesiones infectadas con el hongo se encontraron agravadas en el mismo periodo de tiempo (Figura 3B). Estos resultados sugieren fuertemente la susceptibilidad de estos tallos de Agave a la infección por C. herbarum. A pesar de que esta evidencia apoya el hecho de que C. herbarum está asociado a la generación de manchas necróticas, la participación de otros microorganismos oportunistas en la infección de cultivos de campos abiertos, no puede ser descartada.

Figura 3. Efecto del daño mecánico (A) y daño mecánico con la inoculación C. herbarum (B) en tallos jóvenes asintomáticos de Agave angustifolia. 

La actividad antifúngica in vitro de los extractos etanólicos de las raíces de Z. montagnifolia contra C. herbarum mostraron un claro efecto inhibitorio (Figura 4). El método de dilución en agar usando los ácidos ent-kaurenoico y grandiflorenico puros (usualmente los principales constituyentes de los extractos etanólicos de las raíces de la planta) permitió exhibir su participación en el efecto antifúngico observado (Figura 4). Como se muestra en la Figure 4, el hongo creció perfectamente en medio PDA puro (0 μg mL^-1), mientras que una evidente inhibición del crecimiento fue observada en relación al aumento de la concentración de cada componente evaluado (20-120 μg mL^-1). Estos experimentos semi-cuantitativos mostraron que el extracto etanólico conteniendo ambos diterpenos fue capaz de inhibir el crecimiento normal del hongo a menos de 0.5 mg mL^-1. Los ensayos ejecutados mediante el método de dilución en caldo condujeron a la obtención de los valores de la MIC. Estos valores reflejaron la concentración del agente antimicrobiano en la cual no hay signos de crecimiento. Los valores obtenidos fueron de 150.4±3.5, 100.3±2.1 y 80.7±1.4 μg mL^-1, para el extracto etanólico, el ácido ent-kaurenoico y el ácido grandiflorénico, respectivamente (Figura 5). Diferencias significativas (p<0.01) fueron observadas entre los tratamientos (Figura 5). De éste modo, el uso de los extractos etanólicos debería ser considerado como una alternativa económica para futuros ensayos in vivo, con el objetivo de determinar su posible aplicación en el control biológico de C. herbarum. La actividad antimicrobiana de los diterpenos evaluados ya ha sido propuesta y confirmada en diversas especies bacterianas y fúngicas (^{Villa-Ruano et al., 2016}). Este trabajo contribuye a la investigación de nuevas actividades antimicrobianas de extractos de plantas conteniendo ent-kaurenoides. Considerando que Z. montagnifolia puede ser localizada en la vegetación circundante de aquellas regiones, su viabilidad como un recurso para subsiguientes pruebas antifúngicas in vivo, debe ser contemplada.

Figura 4. Efecto de diferentes concentraciones del extracto etanólico (EE) de Z. montagnifolia, el ácido ent-kaurenoico (KA) y el ácido grandiflorénico (GF) en el crecimiento in vitro de C. herbarum. 

Figure 5. Comparación de los valores de la MIC de los extractos etanólicos de Z. montagnifolia (EE), el ácido ent-kaurenoico (KA) y el ácido grandiflorénico (GF) sobre el crecimiento in vitro de Cladosporium herbarum. Las barras indican la desviación estándar de 5 repeticiones (n=5) y letras diversas indican diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos por ANOVA-Tukey test.