Candidatus Liberibacter asiaticus (CaLas), afecta las zonas productoras de cítricos en México (^{DGSV-SENASICA y Mora-Aguilera, 2012}); reduce 18.6 % el volumen de jugo y 17.3 % el peso de fruto de limón persa en Yucatán, México; lo que provoca pérdidas de producción de 2.4 t.ha^-1 (^{Flores-Sánchez, et al., 2015}). La infección inducida por HLB, altera la exportación de fotoasimilados, provocada por la retención de almidón, lo que genera la expresión de síntomas en el árbol (^{Kim et al., 2009}; ^{Koh et al., 2012}).

CaLas provoca cambios bioquímicos y estructurales en plantas de cítricos para evitar la diseminación de la bacteria, mediante la activación de proteínas de respuesta (^{Albrecht y Bowman, 2008}). Como respuesta a la infección de plantas de cítricos con HLB, el metabolismo de carbohidratos en el que interviene la α amilasa, es alterado (^{Albrecht y Bowman, 2008}; ^{Etxeberria et al., 2009}).

La fenilalanina amonio-liasa (PAL) interviene en respuesta al ataque de patógenos (^{Almario et al., 1994}). En cítricos, se ha observado que el flavedo posee la capacidad de responder al ataque por patógenos, mediante el aumento de los niveles de transcrito de la PAL así como de su actividad (^{Ballester et al., 2006}). La enzima peroxidasa (POD) protege a las plantas del daño causado por radicales libres o ROS generados por diferentes tipos de estrés, participa también en la lignificación de la pared celular y en la degradación del ácido indolacético (^{Robinson, 1991}). Se ha demostrado que los fenoles poseen una función importante en la defensa de las plantas frente a distintos factores bióticos y abióticos (^{Lu et al., 2015}). Éstas se pueden modificar por efectores que secretan las bacterias Ca. Liberibacter dentro del hospedante y que alteran genes relacionados con la defensa; CaLas codifica salicilato hidroxilasa como mecanismo para evadir la defensa de las plantas (^{Aritua et al., 2013}). ^{Mora-Aguilera et al., 2014}, señalan que el manejo del HLB debe considerar la susceptibilidad de las especies de cítricos y la carga del inóculo. Entender el comportamiento enzimático de árboles infectados con CaLas en diferentes especies permitiría desarrollar alternativas para la protección o defensa de la planta. El estudio se desarrolló con el objetivo de determinar diferencias en la actividad enzimática antioxidante y concentración de fenoles en tres especies de cítricos en Bustamante, Tamaulipas, México.

Las muestras se recolectaron en Felipe Ángeles, Bustamante, Tamaulipas. Se realizó un muestreo dirigido hacia árboles de 10 a 12 años de edad de limón mexicano (Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle), limón persa (Citrus latifolia Tanaka); y naranja dulce (Citrus sinensis (L.) Osbeck), bajo condiciones de temporal, en la etapa fenológica de amarre de fruto. Se tomaron muestras de dos árboles con síntomas por especie y uno sin síntomas. El material se recolectó en cada uno de los puntos cardinales del árbol (norte, sur, este y oeste), se tomaron tres repeticiones de cinco hojas por punto; y se conservaron en nitrógeno líquido.

Para la extracción de ADN se usó la técnica citada por ^{Almeyda-León et al. (2001)} modificada: se trituraron 100 mg de tejido en nitrógeno líquido, se adicionó 1 mL de solución de extracción 2 ME/CTAB precalentado a 65 °C. Se mezcló en vortex por 30 seg y se incubó a 65 °C por 45 min. Se agregó 500 μL de cloroformo alcohol isoamílico 24:1, se agitó la mezcla por inversión y se centrifugó a 12,000 rpm durante 10 min. Se recuperó la fase acuosa y se adicionó un volumen igual de cloroformo alcohol isoamílico 24:1, se repitió ciclo de centrifugado. Se recuperó la fase superior y se añadió 0.6 volumen de isopropanol para precipitar el ADN a -20 °C durante 24 h. Se centrifugó a 12,000 rpm por 20 min, se lavó la pastilla con etanol al 70 %, se centrifugó a 12,000 rpm por 15 min, se dejó secar la pastilla y se resuspendió en 50 μl de agua inyectable (Pisa). La presencia de la bacteria se determinó de acuerdo al protocolo de ^{SENASICA-SAGARPA, (2010)}, usado en la Estación Nacional de Epidemiología y Saneamiento Vegetal (SENASICA-ENECUSaV); en el estado de Querétaro, México.

El extracto crudo para cuantificación de proteínas totales, fenilalanina amonio liasa, peroxidasa y α-amilasa, se tomó de ^{Díaz et al. (2010)}, modificado: se colocó 1 g de muestra macerada en nitrógeno líquido, en una solución tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 7. Las muestras se centrifugaron a 12,000 rpm durante 20 minutos a una temperatura de 4 ° C, posteriormente se colectó el sobrenadante y se almacenó a -20 °C. Para la extracción de fenoles se utilizó la metodología B usada por ^{Kähkönen et al. (1999)} con algunas modificaciones; se colocaron 250 mg de la muestra macerada en un tubo eppendorf de 2 mL y se agregó 1 mL de metanol al 80 %, se agitó en vortex por un minuto, se centrifugó a 10,000 rpm por 15 minutos. El sobrenadante se recuperó en un tubo eppendorf ámbar de 1.5 mL. Se re extrajo con 500 μL de metanol absoluto, repitiendo el proceso; y se conservó a -20 °C hasta su uso.

La concentración de proteínas se determinó según la técnica de ^{Bradford (1976)}, la cual consistió en mezclar 1 mL de reactivo de Bradford con 100 μL de extracto crudo. Los valores de absorbancia de proteínas totales se determinaron a una λ=595 nm en un thermo spectronic Biomate 3. El contenido de proteínas se expresó en mg de proteínas por mg de tejido fresco. La curva patrón se obtuvo con albúmina de suero bovino según ^{García y Vázquez (1998)}.

La determinación de la actividad fenilalanina amonio-liasa (PAL) se realizó de acuerdo a la técnica descrita por ^{Rodríguez-Pedroso et al., (2006)}. Se usó como referencia el coeficiente de extinción molar de 0.0174 M^-1cm^-1 para calcular la actividad enzimática (^{Trotel-Aziz et al., 2008}).

La actividad peroxidasa se determinó mediante la metodología usada por ^{Ruttimann et al., (1992)}. La actividad de la enzima se expresó como milimoles de rojo de fenol oxidado por gramo de tejido fresco por minuto (Yedidia et al., 1999).

Para la cuantificación de α amilasa se utilizó el protocolo de ^{SIGMA-ALDRICH, (2015)}. La curva patrón se realizó con varias concentraciones de maltosa. La actividad α amilasa se definió como μmol.min^-1 de maltosa liberados por μg de proteína (^{Menéndez et al., 2006}).

El contenido de fenoles totales se determinó por el método Folin-Ciocalteu (^{Singleton et al., 1999}). Se preparó una mezcla con 200 μL del extracto metanólico, 100 μL del reactivo de Folin-Ciocalteu; y 200 μL de carbonato de sodio al 20 %. Se agitó y se dejó reposar durante 30 min. Transcurrido este tiempo se midió la absorbancia de fenoles totales a una λ=760 nm. Se realizó una curva patrón con diferentes concentraciones de ácido gálico.

Se utilizó el programa estadístico SAS ver. 9.0 para realizar un análisis de contrastes entre los árboles con diagnóstico positivo y negativo a CaLas. Las variables analizadas fueron: proteínas totales, PAL, POD, α-amilasa; y fenoles totales.

Los árboles con síntomas muestreados presentaron un amarillamiento general de la copa y apariencia deshidratada; en las hojas se observaron moteados asimétricos menos visibles. Las muestras sintomáticas fueron positivas a CaLas y las muestras asintomáticas fueron negativas. Para la detección de CaLam todas las muestras fueron negativas.

El análisis de contrastes entre árboles positivos y negativos mostró diferencias significativas entre especies (P<0.0001). La concentración de proteínas para limón mexicano mostró una media de 6.1 mg de proteínas por g de tejido fresco para árboles infectados, mientras que para negativos fue 5.46 mg de proteínas por g de tejido fresco con una significancia de P=0.0238. En naranja dulce hay una diferencia significativa de P=0.0002 con una media de 5.27 y 6.37 mg de proteínas por g de tejido fresco en árboles positivos y negativos respectivamente (Cuadro 1; Figura 1). La determinación de proteínas totales en la planta permite detectar cambios ocasionados por diferentes tipos de estrés biótico y abiótico (^{Casado, 2004}), tal como se muestra en este estudio al encontrar diferencias en la concentración de proteínas entre árboles positivos y negativos a CaLas.

Cuadro 1. Análisis de contrastes entre árboles con diagnóstico negativo y positivo a Ca. Liberibacter asiaticus en el estado de Tamaulipas. 

Figura 1. Comparación de medias de Proteínas totales (1A), fenilalanina amonio liasa (PAL) (1B), peroxidasa (1C), α-amilasa (1D) y fenoles totales (1E), para las fuentes de variación de localidad, especie y orientación de ramas evaluadas en árboles sanos y positivos a Ca. Liberibacter asiaticus. 

La determinación de PAL no mostró diferencias significativas entre especies, sin embargo se observó mayor concentración de PAL en limón persa y limón mexicano (21.75, 16.09 U.mg de proteína^-1), para árboles negativos; por el contrario naranja dulce presentó mayor concentración en los infectados por CaLas (17.98 U.mg de proteína^-1) (Cuadro 1; Figura 1). Los resultados de éste estudio coinciden con ^{Chenyang et al. (2001)} quienes mencionan que la actividad enzimática de la PAL es modificada por factores bióticos y abióticos en la planta; ya que a pesar de no tener diferencias significativas se pudo observar mayor concentración de PAL en naranja dulce afectada por HLB. Los resultados en limón persa y mexicano coinciden con lo señalado por ^{Martinelli et al. (2016)} quienes indican que la regulación de la PAL disminuyó a causa de la infección de CaLas en dos especies de cítricos, una considerada moderadamente tolerante, limón Volkameriana (Citrus × volkameriana); y la otra altamente susceptible, naranja Navel.

Los niveles de actividad peroxidasa presentaron diferencia significativa para limón persa (P=0.0341). Se observó mayor concentración de la enzima en árboles no infectados con CaLas con medias de 1.96 U.mg de proteína^-1 para limón persa y naranja dulce, y para limón mexicano de 1.53, U.mg de proteína^-1 (Cuadro 1; Figura 1). En la presente investigación se observó mayor actividad enzimática de la peroxidasa de los cítricos en árboles negativos; no obstante, se observaron síntomas de acorchamiento de nervaduras centrales y secundarias de las hojas infectadas con HLB, producto de la lignificación inducida por ésta enzima como menciona ^{Robinson (1991)}.

En la cuantificación enzimática de α-amilasa se presentaron diferencias significativas entre especies y entre árboles positivos y negativos de naranja dulce (P<0.0001). En árboles negativos de limón persa y limón mexicano se observó mayor concentración de α-amilasa (1.31, 0.99 U.mg de proteína^-1), respectivamente; en árboles positivos la mayor concentración se detectó en limón persa (1.26 U.mg de proteína^-1) (Cuadro 1; Figura 1). En el estudio de ^{Martinelli et al. (2016)}, la α-amilasa se expresó en limón Volkameriana (Citrus × volkameriana), señalada como moderadamente tolerante, y la β-amilasa en naranja Navel, material altamente susceptible. En el presente estudio, el estrés ocasionado al árbol provocó que la actividad α-amilasa aumentara en limón persa seguido por naranja dulce.

Los niveles de concentración de fenoles totales se presentaron en un rango mínimo de 18.5 mg de ácido gálico por g de peso fresco registrado para las muestras infectadas con CaLas de limón persa. Naranja dulce presentó el valor máximo, 21.10 mg de ácido gálico por g de peso fresco, en árboles negativos. En el análisis de contrastes la determinación de fenoles totales no se observaron diferencias significativas entre especies (P=0.5045) (Cuadro 1; Figura 1). Coincidiendo con Yedidia et al., 1999, quienes señalan que al reprimirse la actividad de la peroxidasa, también disminuye la producción de compuestos fenólicos, los resultados no muestran una diferencia significativa en la actividad peroxidasa, ni en compuestos fenoles.