El piñón (Jatropha curcas) es un arbusto perenne multipropósitos que pertenece a la familia Euphorbiaceae; se considera nativo de Centroamérica, particularmente de México (^{Openshaw, 2000}; ^{Pecina-Quintero et al., 2014}). Esta planta, se distribuye en regiones tropicales y subtropicales de Asia, África y América, en donde se cultiva con la finalidad de extraer aceite de sus semillas y producir biodiesel (^{Heller, 1996}; ^{Wang et al., 2008}). Jatropha curcas es resistente a la sequía y por su toxicidad se considera resistente y/o tolerante al ataque de plagas y enfermedades (^{Heller, 1996}; ^{Zamarripa-Colmenero et al., 2009}; ^{Biswas et al., 2010}).

La expansión global de J. curcas como cultivo, ha contribuido a la aparición de enfermedades de etiología desconocida, a pesar de la supuesta resistencia y/o tolerancia que se le atribuye (^{Machado y Pereira, 2012}; ^{Machado et al., 2014}). De acuerdo con la literatura, J. curcas es atacada por 42 hongos, cuatro bacterias y dos virus (^{Alonso y Lezcano, 2014}). Entre las enfermedades más comunes en plantaciones de J. curcas, están las causadas por hongos, tales como Colletotrichum gloeosporioides, C. capsici (antracnosis); Passalora jatrophigena, Cercospora jatrophicola, Pseudocercospora jatrophae (mancha foliar); Pseudoidium jatrophae (cenicilla); Phakopsora arthuriana (roya); Lasiodiplodia theobromae (muerte descendente); Fusarium solani (pudrición de la raíz); Macrophomina phaseolina (pudrición de corona y raíz); Rhizoctonia bataticola (pudrición de raíz); Botryosphaeria dothidea (cancro) y otros hongos (^{Kumar et al., 2011}; ^{Rao et al., 2011}; ^{Machado y Pereira, 2012}; ^{Ellison, 2015}).

En México, como resultado de investigaciones desarrolladas por diferentes instituciones se han reportado problemas ocasionados por fitopatógenos en J. curcas. ^{Valdéz-Rodríguez et al. (2011)} reportaron la presencia de Pythium aphanidermatum en plántulas y semillas cultivadas en Veracruz, mientras que ^{Espinoza et al. (2012)} encontraron a Alternaria alternata en inflorescencias con síntomas de necrosamiento en Sinaloa. Otras enfermedades de J. curcas que se han reportado en México son causadas por C. gloeosporioides, C. circinans, P. arthuriana, Pestalotiopsis sp., Fusarium sp., Lasiodiplodia sp., Pleurotus ostreatus, Ralstonia solanacearum (^{Valdez-Rodríguez et al., 2011}; ^{Espinoza et al., 2012}; ^{Nolasco-Guzmán et al., 2013}; ^{Quiroga-Madrigal et al., 2013}; ^{Salazar-Pinacho et al., 2016}).

En Yucatán, México, se observaron en algunas plantaciones de J. curcas desde el año 2012, síntomas de marchitez, necrosis, acortamiento de entrenudos y muerte de plantas. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue identificar el (los) agente (s) causal (es) de los síntomas en plantaciones de J. curcas.

Los muestreos se realizaron en dos plantaciones experimentales de J. curcas del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), ubicadas en el Campo Experimental Mocochá (21° 06’ N y 89° 26’ O, a 13 msnm) y Sitio Experimental Uxmal, en Yucatán (20° 25’ N y 89° 46’ O, a 50 msnm), respectivamente. Las dos plantaciones cuentan con 3,000 plantas, en las cuales se realizaron muestreos dirigidos en plantas con síntomas de necrosamiento de tejido vascular, marchitez, pudrición de raíz, muerte descendente y acortamiento de entrenudos. En cada plantación se muestreó al menos el 2 % de las plantas.

Las muestras con tejido infectado, se introdujeron en bolsas de papel estraza y se trasladaron al Laboratorio de Fitopatología del Instituto Tecnológico de Conkal para su estudio.

En laboratorio para el aislamiento de los hongos asociados a la pudrición de raíz y entrenudos, se realizaron cortes de 0.5 cm² del tejido enfermo, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 2 % durante 1 min, se lavaron con dos cambios de agua destilada estéril y se colocaron en papel absorbente estéril para eliminar el exceso de humedad. Posteriormente por separado, cada muestra se sembró en cajas Petri de 90 mm conteniendo medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), colocando cinco cortes por caja Petri. Éstas se incubaron a 28±1 °C hasta observar crecimiento de micelio. Finalmente, con una aguja estéril, porciones de micelio fueron transferidos individualmente a nuevas cajas Petri con PDA.

La identificación del agente causal del necrosamiento de tejido vascular, marchitez, pudrición de raíz, muerte descendente y acortamiento de entrenudos de J. curcas, se realizó por medio de la observación de preparaciones temporales y permanentes de hongos de acuerdo con la metodología de ^{Cristóbal-Alejo et al. (2013)}. La identificación a nivel de género y especie se hizo usando claves de ^{Barnett y Hunter (2006)} y ^{Leslie y Summerell (2006)}, respectivamente. Las preparaciones observadas con microscopio compuesto, se fotografiaron con una cámara Sony Cibershot.

La identificación molecular de los hongos se basó en un análisis de la secuencia de regiones del ADN específicas (^{Seifert et al., 2007}). Para la extracción de ADN se utilizó el Kit ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM y la integración del ADN se verificó con una electroforesis en gel de agarosa al 1.2 %. Se utilizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional, para la amplificación de las regiones internas ITS1 e ITS2 entre los genes ribosomales (rADN) 18S-5.8S y 28S con los iniciadores ITS1 e ITS4 (^{Manter y Vivanco, 2007}). La mezcla de reacción consistió en iniciadores ITS1 e ITS4 (1 mM), MgCI₂ (3 mM), dNTP (0.2 mM), Taq DNA polimerasa (2.5 unidades), y ADN (100 ng) para un volumen final de 50 μL. La amplificación se realizó en un Termociclador (TECHNE^®-312, Minnesota, EE.UU.), bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial de 2 min a 95 °C, seguido de 30 ciclos (desnaturalización a 94 °C por 1 min, alineación a 54 °C por 30 s y una extensión de 1min a72 °C) con una extensión final de5 min a 72 °C (^{White et al., 1990}).

Los productos finales de la amplificación, se visualizaron en gel de agarosa al 2 % (Ultra Pure^TM). Los fragmentos amplificados se enviaron a la empresa Macrogen (EE.UU.) para su secuenciación. Las secuencias obtenidas se analizaron y compararon con las depositadas en el banco de genes de NCBI (National Center for Biotechnology Information) con ayuda del programa BLASTn. Las secuencias se depositaron en la base de datos del GenBank para obtener su número de acceso.

Se implementaron los postulados de Koch para confirmar la patogenicidad de los aislados fúngicos que se obtuvieron consistentemente a partir de los tejidos sintomáticos de plantas de J. curcas. Para el hongo aislado de plantas con síntomas de necrosamiento de tejido vascular, marchitez y pudrición de raíz, se desinfestaron semillas de J. curcas con hipoclorito de sodio al 1 % durante 2 min, se lavaron con dos cambios de agua destilada estéril y se sembraron en vasos de poliestireno de 1 L de capacidad que contenían suelo estéril. Después de la germinación de las semillas, se seleccionaron 20 plantas de 40 días de edad, a las que se le realizaron incisiones de 2 mm de profundidad en la base del cuello o base de las plantas, y posteriormente, se inocularon por aspersión de esporas a concentración de 1 x 10⁶ mL^-1. La misma cantidad de plantas se consideraron como testigos en las cuales solo se realizaron incisiones y se asperjó agua destilada estéril. Las incisiones en todas las plantas se cubrieron con papel Parafilm^® y se mantuvieron en invernadero hasta la aparición de síntomas. Para el hongo aislado de plantas con muerte descendente y acortamiento de entrenudos se siguió la misma metodología que el caso anterior, con la diferencia que la inoculación del hongo se realizó a 15 cm sobre el cuello o base de la planta.

De plantas de J. curcas con raíces necrosadas, marchitez y necrosamiento de tejido vascular, se aisló e identificó a Fusarium solani (Figura 1A, B y C). Estos síntomas, también fueron observados por ^{Sharma et al. (2001)}, ^{Wu y Yu (2011)}, ^{Machado y Pereira (2012)}, y ^{Machado et al. (2012)}. Fusarium solani es el agente causal de los síntomas de pudrición de la raíz en plantaciones de J. curcas en China (^{Wu et al., 2011}), cuyo teleomorfo fue identificado como Nectria haematococca y de acuerdo con la revisión de literatura, este el primer reporte en plantaciones de J. curcas localizadas en México. Fusarium solani presentó micelio algodonoso, septado de color crema con cambios de coloración de azul-verde; microconidios unicelulares, ovoidesarriñonados con 2.7-8.9 μm de largo por 2-4 μm de ancho, producidos en conidióforos individuales o en pares y largos; macroconidios en forma de canoa o media luna, con un diámetro 9.1-38.9 μm por 2.2-4.4 μm con 1-4 septos, paredes gruesas, cilíndricas, superficie dorsal y ventral paralela en toda su longitud, célula apical roma y redondeada con una muesca en la base; clamidosporas globosas, solas y en pares, con diámetros de 6.2-11.1 μm (Figura 1D y E ). Estas características morfológicas coinciden con las descritas por ^{Barnett y Hunter (2006)} y ^{Leslie y Summerell (2006)} para el caso de F. solani.

Figura 1. Síntomas inducidos en Jatropha curcas por Fusarium solani y características microscópicas de Fusarium solani. (A) Plantas con síntomas de marchitez. (B) Necrosamiento del sistema radical. (C) Reproducción de síntomas de marchitez en plántulas. (D) Microconidios y macroconidios. (E) Formación de clamidosporas. 

Los resultados de la búsqueda de homología por BLASTn con secuencias de nucleótidos reportadas en NBCI, mostró un 99 % de similaridad con la secuencia del hongo F. solani (No. de acceso U733636). La secuencia de nucleótidos, se depositó en la base de datos del GenBank con número de acceso KY013237.

En plantas de J. curcas inoculadas con F. solani, se observaron síntomas de marchitez a los siete días posteriores a la inoculación (dpi). Posteriormente se observó una pérdida de turgencia de las plantas y clorosis en hojas, las cuales gradualmente se tornaron cafés (Figura 1C). A los 13 dpi, se extrajeron las raíces y se observó necrosis en el sistema vascular, de los síntomas observados se aisló a F. solani. Las plantas testigo no mostraron ningún síntoma. Los síntomas observados coincidieron con los reportados por ^{Wu et al. (2011)} en plantaciones de J. curcas en China, quienes encontraron que después de 2 meses de inocular plántulas de J. curcas, éstas mostraron síntomas de pudrición de raíz, clorosis en hojas, caída de hojas, raíces necrosadas y podridas. Síntomas similares, también fueron reportados por ^{Herrera-Parra et al. (2011)} en plantas de Thevetia peruviana con marchitez; por ^{Hasan et al. (2014)} en plantas de Hibiscus sabdariffa con síntomas de pudrición de raíz y marchitamiento.

En plantas de J. curcas con síntomas de muerte descendente y tallos con acortamiento de entrenudos, se aisló e identificó a Fusarium equiseti (Figura 2A, B, D y E). Existen otros reportes de F. equiseti pero como agente causal de “damping-off “, pudrición de raíz y marchitez en Pinus halepensis, H. sabdariffa y Panax quiquefolius (^{Punja et al., 2007}; ^{Hasan et al., 2014}; ^{Lazreg et al., 2014}), así como inductor de necrosis floral y caída de frutos jóvenes en Carica papaya (^{Vásquez et al., 2012}). Sin embargo, este es el primer reporte de muerte descendente y acortamiento de entrenudos en tallos de J. curcas.

Este hongo en medio de cultivo PDA se caracterizó por presentar crecimiento micelial abundante, inicialmente de color blanco a amarillo pálido hasta cambiar a café; microconidios ovales de 5380 x 4.0-4.5 μm, con una célula pie pedicelada, y clamidosporas de 7-9 μm en cadena y en conglomerados (Figura 2F). Se observó la formación de esporodoquios inicialmente de color naranja y posteriormente café oscuro. En los esporodoquios, se observaron abundantes macroconidios desarrollados en monofiálides o en conidióforos ramificados dorsoventralmente curvos, usualmente con cinco a siete septos marcados, con una longitud de 25120 μm, con pared gruesa que en su parte ventral se arquea ligeramente y en la parte dorsal se arquea abruptamente, con una célula basal en forma de pie y la parte apical filamentosa (Figura 2G). Las características morfológicas mencionadas anteriormente, coincidieron con las descritas por ^{Barnett y Hunter (2006)} y ^{Leslie y Summerell (2006)} para F. equiseti.

Figura 2. Síntomas inducidos en Jatropha curcas por Fusarium equiseti y características macroscópicas y microscópicas de Fusarium equiseti. (A) Acortamiento de entrenudos en ramas. (B) Muerte descendente de ramas. (C) Planta testigo sin síntomas. (D) Planta inoculada con muerte descendente. (E) Corte de tallo necrosado. (F) Crecimiento en medio de cultivo PDA. (G) Macroconidios. 

Los resultados de la secuenciación, muestra que la secuencia de nucleótidos tuvo 100 % de similaridad con la especie de hongo F. equiseti (No. de acceso KJ412501) reportada en NCBI. La secuencia de nucleótidos, también se depositó en la base de datos del GenBank con número de acceso KY012795.

En plantas de J. curcas inoculadas con F. equiseti se observaron síntomas de necrosamiento y muerte descendente de tallos a los 20 dpi (Figura 2D y E), de los cuales se re-aisló a F. equiseti; mientras que en las plantas testigo no se observaron síntomas (Figura 2C).

De acuerdo con ^{Machado y Pereira (2012)}, en áreas con estaciones secas prolongadas, se ha observado una mayor incidencia de la pudrición de raíz y cuello en J. curcas. Por lo que se cree que el estrés hídrico es la condición ambiental principal que predispone a las plantas a esta enfermedad, dicha condición se observó durante los muestreos que se hicieron en las plantaciones de J. curcas en Yucatán.

En este trabajo se reporta por primera vez a F. solani como agente causal de marchitez y necrosamiento de tejido vascular, y a F. equiseti como inductor de acortamiento de entrenudos y muerte descendente de J. curcas en Yucatán, México. Esta enfermedad puede convertirse en un problema serio para el cultivo de J. curcas en México, debido a la falta de estrategias de control y monitoreo, por lo que se deben hacer más estudios encaminados a conocer las condiciones ambientales que favorecen la enfermedad, así como diseñar estrategias para el manejo integrado de ésta.