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Revista mexicana de fitopatología

versión On-line ISSN 2007-8080versión impresa ISSN 0185-3309

Rev. mex. fitopatol vol.35 no.1 Texcoco ene. 2017

http://dx.doi.org/10.18781/r.mex.fit.1606-9 

Artículos de revisión

Extracción y purificación de dsRNAs largos de plantas infectadas con virus y hongos; aplicación en la detección e identificación de virus

R. A. Valverde1  * 

R. De La Torre-Almaraz2 

1Department of Plant Pathology & Crop Physiology, Louisiana State University Agricultural Center, Baton Rouge, LA 70803, USA.

2Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Mexico DF, Mexico.

Resumen.

Se utilizan varios métodos para realizar la extracción y purificación de ARN de doble cadena (dsRNA) largo de plantas y hongos. Los protocolos más utilizados consisten en la extracción de fenol y la unión selectiva de dsRNA a la celulosa. Los dsRNAs virales purificados de plantas y hongos se han analizado por electroforesis con gel y se han utilizado como herramienta complementaria para identificar virus. Asimismo, los dsRNAs se han utilizado como reactivos en PCR de transcriptasa reversa, clonación molecular, preparación de sondas y secuenciación de virus ARN. Se han descubierto muchos virus ARN y moléculas subvirales que infectan plantas y hongos utilizando protocolos de extracción de dsRNA. Las recientes mejoras a los métodos de extracción de dsRNA han aumentado la eficiencia y la rentabilidad. Se ha comprobado que el dsRNA viral se puede utilizar como reactivo inicial para la secuenciación de próxima generación de genomas virales.

Palabras clave: virus ARN; fitovirus; micovirus; detección de virus

Introducción

Existen varios métodos para la detección e identificación de fitovirus y micovirus que los investigadores y especialistas en diagnóstico pueden utilizar. Durante muchos años, los métodos serológicos y los ensayos biológicos fueron los más utilizados en combinación con la detección de ácido nucleótico viral. Hoy en día, los métodos basados en ácido nucleico para la detección de virus, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), junto con la secuenciación, son los que más se utilizan en el desarrollo de métodos de alto rendimiento, por su alta sensibilidad y adaptación (Bonham et al., 2014). Recientemente han surgido nuevas tecnologías para la detección e identificación de virus, como la secuenciación de próxima generación (NGS). La NGS es un método con gran potencial para la detección e identificación de fitovirus (Al Rwahnih et al., 2015; Bonham et al., 2014; Ho y Tzanetakis, 2013). En todo método basado en ácido nucleico para la detección de virus ARN se necesitan protocolos de extracción de ARN eficaces y prácticos. Hoy en día existen muchos métodos, incluidos los de kits comerciales, para extraer ARN de una sola cadena de una amplia variedad de tejidos biológicos. No obstante, en algunos casos, la inestabilidad del ARN de una sola cadena puede ser un factor que afecta la detección exitosa de los virus. La extracción, purificación y análisis de ARN de doble cadena largos (dsRNAs) (0.5-20.0 kb) por electroforesis proporciona una herramienta complementaria a los científicos que pretenden detectar e identificar virus en plantas (Dodds et al., 1984; 1988; Morris y Dodds, 1979; Valverde et al., 1990b), así como una fuente de ARN que se puede utilizar en otros métodos de detección e identificación basados en ácido nucleico de virus ARN.

El dsRNA largo ha sido reconocido como material genético en muchos virus de plantas, animales, hongos y bacteriófagos (Libonati et al., 1980). Algunas funciones biológicas del dsRNA incluyen la capacidad de inducir interferones e inhibir la síntesis proteica en las células eucariotas (Libonati et al., 1980). El DsRNA es resistente a las ribonucleasas (RNases) bajo condiciones de elevada fuerza iónica. En condiciones normales de ensayo (0.15 M NaCl, 0.015 M citrato de sodio, pH 7), el dsRNA es resistente a la RNase A pero no a las RNases de tipo pancreático (Libonati y Sorrentino, 1992). Otra propiedad única del dsRNA es que se une a la fibra de celulosa en buffers que contienen etanol. Lo óptimo es que el dsRNA se una a la fibra de celulosa en concentraciones de etanol de aproximadamente 16 % (Franklin, 1966; Morris y Dodds, 1979). La estabilidad relativamente alta del dsRNA y la disponibilidad de métodos de extracción hacen que el uso del dsRNA resulte práctico en la detección e identificación de virus ARN.

En muchas plantas y hongos infectados con virus ARN se pueden encontrar dsRNAs como parte de: 1) segmentos genómicos virales dsRNA; 2) formas replicativas e intermediarios replicativos de virus ARN de una sola (Buck, 1999; Horiuchi y Fukuhara, 2004; Jackson et al., 1971; Libonati et al., 1980; Nuss y Koltin, 1990; Zelcer et al., 1981); 3) ARNs subgenómicos virales (sgRNAs) (Condit y Fraenkel-Conrat, 1979; Osman y Buck 1990); 4) virus satélite (Klein y Reichman, 1970; Hillman et al., 2000; Valverde y Dodds, 1986); 5) ARNs satélite (Demler y de Zoeten, 1989; Liu et al., 2015); y 6) ARNs de interferencia defectuosa (Burgyan et al., 1989; Hillman et al., 2000). También se ha reportado detección serológica de dsRNAs de plantas y hongos infectados por virus. Como antisuero contra el ácido poliinosínico-policitidílico (polyi:c) se ha utilizado un análogo sintético de ARN de doble cadena de plantas infectadas con el Virus del mosaico del pepino (CMV) y el Virus de la tristeza de los cítricos (CTV), y Penicillium chrysogenum infectada con el Virus Penicillium chrysogenum, aplicando técnicas serológicas (Aramburu et al., 1991). Estas técnicas mostraron similar sensibilidad en la detección de dsRNA como separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción argéntica. Se han detectado DsRNAs del Virus del mosaico del caupí y el Virus del mosaico de la caña de azúcar en extractos de tejido infectado utilizando un microscopio electrónico (Derrick et al., 1994). Se han producido anticuerpos monoclonales para dsRNA y se han utilizado para detectar el Virus de la roseta del maní en cacahuate (Schonborn et al., 1991). Sin embargo, las técnicas basadas en métodos serológicos requieren la producción de anticuerpos específicos, un procedimiento más costoso y prolongado que la visualización directa del dsRNA por electroforesis o detección por RT-PCR.

Virus ARN de plantas y hongos

Los virus que contienen genomas de ssRNA constituyen más del 90 % de todos los fitovirus conocidos. Durante su replicación en células huésped, los virus ssRNA producen formas replicativas de doble cadena (RF), que consisten en moléculas de ARN de bases completamente apareadas de ARN genómico e intermediarios replicativos (Buck, 1999). Se ha observado que esto ocurre en plantas infectadas con el Virus del mosaico del tabaco (TMV), el Virus de la mancha anular del tabaco (Buck 1999; Derrick, 1978; German y de Zoeten, 1975; Jackson et al., 1971; Zelcer et al., 1981) y el endornavirus de Oryza sativa (Horiuchi y Fukuhara, 2004), entre otros. Muchos de los virus ARN generan ARNs subgenómicos (sgRNAs) que expresan marcos internos abiertos de lectura. Estos sgRNAs son sintetizados, ya sea a partir de cadenas negativas prematuramente terminadas o, más comúnmente, por un proceso interno en los moldes de la cadena negativa en secuencias específicas del promotor (Miller and Koev, 2000). Se han detectado dsRNAs subgenómicos en plantas infectadas con numerosos virus ARN, y en hongos infectados con micovirus ARN (Condit y Fraenkel-Conrat, 1979; Kwon et al., 2007; Osman y Buck, 1990). Los fitovirus con genomas de dsRNA incluyen miembros de las familias Reoviridae, Partitiviridae, Amalgaviridae, Totiviridae y Chrysoviridae, y sus dsRNA genómicos son fácilmente detectables en tejidos vegetales (Antoniw et al., 1986; Chen et al., 2016; Karan et al., 1994; Li et al., 2013; Quito et al., 2011; Sabanadzovic et al., 2009; 2011; Wei et al., 2003). Con excepción de Reoviridae, las otras cuatro familias contienen fitovirus que no producen síntomas visibles y a éstos se les denomina virus persistentes. En cambio, los virus agudos producen síntomas y causan enfermedades de importancia económica en las plantas (Roossinck, 2010).

Se ha descubierto que todos los principales taxones de hongos contienen virus. Aunque casi la mayoría de los micovirus que se han descrito a la fecha tienen genomas de dsRNA, existen algunos con genomas de ssRNA, y se ha reportado uno con genoma de ssDNA (Ghabrial et al., 2015). En la literatura existen muchas referencias sobre la presencia de dsRNAs virales en hongos (Azzam y Gonsalves, 1999; Castillo et al., 2011; Day et al., 1977; Delye y Corio-Costet, 1998; Dickinson y Pryor, 1989; Herrero et al., 2009; Khalifa y Pearson, 2014; Kim et al., 2005; Kondo et al., 2016; Li et al., 2014; Shamoun et al., 2008); sin embargo, parece que en la mayoría de los casos estos virus no afectan el fenotipo del huésped (Enebak et al., 1994; Reyes et al., 2003). Solo en algunos casos se les ha asociado con variaciones fenotípicas y genotípicas (Castanho et al., 1978; Ghabrial et al., 2015; Wei et al., 2003). La capacidad de algunos virus de inducir hipovirulencia se ha utilizado en el control biológico de sus huéspedes fúngicos, que son patogénicos para las plantas (Nuss y Koltin, 1990). Los ejemplos más conocidos de hipovirulencia inducida por micovirus son las cepas del virus del cancro del castaño Cryphonectria parasitica (Choi y Nuss, 1992; Day et al., 1977; Lee et al., 2006). Los métodos de extracción y purificación de dsRNA han sido fundamentales para el descubrimiento, la detección y la caracterización de micovirus (Nuss y Koltin, 1990).

Virus satélite, ARNs satélite, ARN de interferencia defectuosa y viroides

Agentes satélite y subvirales dependen de un virus auxiliar para replicarse. Los virus satélite codifican su propia proteína de la cápside, dentro de la cual empaqueta su ARN. Los ARN satélite no codifican proteínas de la cápside, sino que están empacados en una proteína codificada por el virus auxiliar. El tamaño de la mayoría de los satélites asociados con los fitovirus y los micovirus varía de 2.0 a 0.4 kb (Hillman et al., 2000; Kaper y Diaz-Ruiz, 1977; Demler y de Zoeten, 1989; Valverde y Dodds, 1987). Los ARN de interferencia defectuosa (DIs) son ARN que resultan a causa de errores en la replicación del virus (Pathak y Nagy, 2009). Los virus ARN satélite, los ARN satélite y los ARN DIs pueden atenuar o aumentar los síntomas causados por su virus progenitor (Pathak y Nagy, 2009; Habili y Kaper, 1981). Algunos virus satélite y ARN asociados con fitovirus acumulan cantidades relativamente grandes de dsRNA (Diaz-Ruiz y Kaper, 1977; Dodds et al., 1984; Habili y Kaper, 1981; Valverde y Dodds, 1986; 1987). En los hongos, los satélites dsRNA se han asociado con diversos virus dsRNA (Liu et al., 2015; Romanos et al., 1981), y se han reportado dsRNAs satélite en Sclerotinia sclerotiorum (Liu et al., 2015). También se identificaron un ARN satélite de Ophiostoma novo-ulmi Mitovirus 3a en aislamientos hipovirulentos de Sclerotinia homoeocarpa (Deng y Boland, 2004), y un satélite y ARN DIs de Cryphonectria hypovirus 3-Grand Haven 2 (Hillman et al., 2000).

Los viroides son algunos de los agentes infecciosos más pequeños que se conocen. Están formados por moléculas de ARN circulares no codificadas que forman estructuras altamente apareadas en forma de varilla y llegan a causar enfermedades económicamente importantes en muchos cultivos a nivel mundial (Kovalskaya y Hammond, 2014). Se ha descrito un viroide derivado de dsRNAs (Carbonell, et al., 2008).

Extracción y purificación de DsRNA

En los últimos 50 años, en la literatura se han reportado varios métodos para la extracción de dsRNA largos de plantas, animales y tejidos fúngicos infectados por virus (Akin et al., 1998; Balijja et al., 2008; Castillo et al., 2011; Delye y CorioCostet, 1998; DePaulo y Powell, 1995; Diaz-Ruiz y Kaper, 1978; Franklin, 1966; Morris y Dodds, 1979, Morris et al., 1983; Okada et al., 2015; Tzanetakis y Martin, 2008; Valverde et al., 1990) (Cuadro 1). La mayoría de estos métodos se basan en cromatografía de celulosa, algunos en degradación enzimática o precipitación con cloruro de litio. Recientemente, Atsumi et al., (2015) desarrollaron un novedoso método para aislar dsRNA utilizando una proteína recombinante de unión al dsRNA.

Cuadro 1. Componentes principales de algunos protocolos de extracción de dsRNA. 

En 1979, Morris y Dodds desarrollaron un procedimiento para el aislamiento y análisis de dsRNA que ha sido muy utilizado en la detección, identificación y caracterización de fitovirus. El procedimiento consiste en la absorción selectiva de dsRNA en celulosa de fibra en bajas concentraciones de etanol y elución con un búfer libre de etanol. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático con un resumen de los pasos que se siguen en este método. Aunque el método se desarrolló hace más de 40 años, sigue utilizándose hoy en día, con algunas modificaciones y mejoras (Khankhum et al., 2016; Valverde et al., 1990).

Figura 1. Diagrama esquemático de los pasos para la extracción y purificación de dsRNA. (Modificado de Valverde et al., 1990). STE: Sodio, Tris y búfer EDTA (100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, pH 8.0 y 1 mM EDTA); SDS: Dodecilsulfato sódico. 

El primer paso en la extracción de dsRNA consiste en homogeneizar por molienda tejido infectado fresco utilizando nitrógeno líquido; la molienda suele hacerse con mortero y mano. Sin embargo, también se han utilizado con buenos resultados extractos de savia, micelios fúngicos frescos o liofilizados, esporas secas y tejido deshidratado de plantas con un buffer (incluyendo tejidos infectados con hongos biotrofos) (Morris et al., 1983; Khankhum et al., 2015; Kousik et al., 1994; Valverde et al, 1990). Otros métodos prácticos y eficientes para el macerado del tejido incluyen batidoras de laboratorio, homogeneizadores de tejido, etcétera. El tejido deshidratado infectado con virus puede almacenarse por largos periodos de tiempo, en espacios pequeños y utilizarse como fuente de inóculo para ensayos posteriores, y porque permite también el intercambio de muestras entre laboratorios. Además, los hongos biotrofos que infectan tejidos vegetales suelen almacenarse en depósitos como especímenes prensados y desecados, de los cuales se pueden obtener muestras para comprobar la presencia de micovirus (Khankhum et al., 2015). En el caso de plantas, se utiliza tejido foliar en la mayoría de las extracciones. Sin embargo, se recomienda el uso de tejidos de corteza, tallo o vaina para algunos virus del floema. Para los hongos se pueden utilizar micelios o esporas. En toda extracción de dsRNA se recomiendan controles negativos. El segundo paso incluye la extracción total del ácido nucleico utilizando fenol saturado con un buffer. Con algunos tejidos vegetales y virus en particular es posible utilizar un buffer en lugar de fenol. No obstante, con los extractos fenólicos normalmente se obtienen muestras más limpias. El tercer paso incluye la unión del dsRNA a la celulosa de fibra. La celulosa que utilizaron Morris y Dodds (1979) y Franklin (1966) en sus primeros estudios fue Whatman CF-11 (Whatman Inc., Clifton, NJ, USA). Dado que esta celulosa desapareció del mercado, para la purificación de dsRNA se han utilizado otros tipos de celulosa, como Cellex-N1 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), que han dado algunos buenos resultados (Okada et al., 2015; Valverde et al., 1990). Khankum et al., (2015) utilizaron celulosa de fibra (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) para extraer dsRNAs de plantas y hongos infectados con virus. Esta celulosa se puede conseguir fácilmente en cualquier parte del mundo y es una buena opción para sustituir a la celulosa CF-11. Después de ser sometidas a precipitación en etanol, las muestras tienen que ser tratadas con DNase para eliminar la posibilidad de que el DNA huésped se contamine. El ARN ribosómico huésped podría interferir en la detección electroforética de los dsRNAs de 1.0 a 0.5 kb. Por lo tanto, cuando los dsRNAs objetivo están dentro de este rango, se recomienda la digestión con nucleasa S1. Después de esto, se puede realizar el análisis de los dsRNAs en geles de poliacrilamida al 6 %, lo cual proporciona un alto poder de resolución en los dsRNAs subgenómicos, o, de manera más simple, se pueden utilizar geles de agarosa al 1.2-1.5 %. Tradicionalmente, el bromuro de etidio ha sido la tinción preferida, aunque también se ha utilizado la tinción de nitrato de plata. Más recientemente, se ha vuelto más común la tinción con Gel RedTM (Huang et al., 2010). GelRed no implica riesgos para la salud como los riesgos asociados con el bromuro de etidio y tiene mayor sensibilidad. En otras fuentes se ha publicado información detallada y datos que muestran algunas de las aplicaciones de la metodología que desarrollaron Morris y Dodds (1979) (Dodds et al., 1984; 1988; Valverde et al., 1986; 1990b).

Inicialmente, los protocolos de extracción de dsRNA se enfocaban en el análisis electroforético y la evaluación de los patrones de bandas para detectar los virus y, en algunos casos, identificarlos. Aunque todavía sigue utilizándose el análisis de dsRNAs virales mediante electroforesis con gel, hoy en día la mayoría de las aplicaciones se hacen en RT-PCR, clonación molecular, secuenciación, ensamblado genómico e identificación de virus.

Detección e identificación de virus

En muchos casos, particularmente con los virus ARN que infectan plantas que contienen grandes cantidades de compuestos fenólicos y carbohidratos, es difícil para los expertos en diagnóstico y los investigadores obtener preparaciones puras de ARN o de virus que puedan ser utilizadas en la identificación o caracterización. Una opción es purificar dsRNAs que puedan ser utilizados en la preparación de sondas, RT-PCR, clonación molecular y secuenciación.

En general, las diferentes familias de virus RNA que infectan plantas u hongos producen patrones característicos de bandas electroforéticas de dsRNA que los diferencian (Dodds et al., 1984; Valverde et al., 1986). Se han reportado perfiles electroforéticos de dsRNA en miembros de las familias Closteroviridae (Dodds y Bar-Joseph, 1983), Potyviridae (Valverde et al., 1986), Bromoviridae (Valverde y Glascock, 1991), Endornaviridae (Fukuhara et al., 2006) y de los géneros Comovirus (Valverde et al., 1995), Tobamovirus, Potexvirus, y Carlavirus (Valverde et al., 1986). Como se mencionó anteriormente, los perfiles de dsRNA generalmente constan de una (en el caso de los virus monopartitas), dos (bipartita) o más (multipartita) bandas genómicas de longitud completa (o RF) y varias otras bandas que corresponden a las formas subgenómicas replicativas de los virus RNA (Condit y Fraenkel-Conrat, 1979; Osman y Buck, 1990). En las Figuras 2 y 3 se muestran perfiles de dsRNA de diferentes fitovirus resueltos en geles de poliacrilamida y agarosa. En el caso de los micovirus, los perfiles electroforéticos de dsRNA no se han evaluado extensamente como una herramienta para diferenciarlos entre familias y géneros. No obstante, igual que en el caso de los micovirus RNA, los perfiles electroforéticos varían dependiendo de la especie del virus, y son comunes las infecciones mixtas (Figura 4).

Figura 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (6%) de dsRNA extraído de plantas infectadas con diferentes virus. Carril 1, Virus de la papa X; carril 2, Virus del mosaico del pepino; carril 3, Virus del mosaico verde suave del tabaco; carril 4, Virus de la necrosis del tabaco; carril 5, Virus del mosaico de la alfalfa

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa (1.2 %) de dsRNAs extraídos de plantas infectadas con diferentes virus. Carril 1, Peso molecular de la escalera de ADN; carril 2, Virus de la necrosis del tabaco; carril 3, Virus del mosaico del pasto y virus satélite; carril 4, Virus del moteado del helecho japonés; carril 5, infección mixta Virus del mosaico del tabaco (TMV), Virus del mosaico de la alfalfa y Virus del mosaico del pepino; carril 6, Virus del mosaico del pepino (CMV); carril 7, TMV; carril 8, Virus del mosaico verde suave del tomate

Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa (1.2 %) de dsRNAs extraídos de hongos. Carril 1, Penicillium digitatum (naranja); carril 2, tizón del maíz; carril 3, Penicillium digitatum (mandarina); carril 4, virus aislado de Diaporthe phaseolorum B; carril 5, totivirus no identificado de un aislado de Diaphorthe phaseolorum C; carril 6, Virus Penicillium chrysogenum; carril 7, virus no identificado de Penicillium stoloniferum; y carril 8, peso molecular 1 kb de una escalera de ADN. 

La extracción y los análisis electroforéticos de dsRNA se han utilizado extensamente para estudiar importantes virus como el Virus citrus tristeza (CTV) (Dodds y Bar-Joseph, 1983; Dodds et al., 1993) y el virus de C. parasitica, agente causante del cancro del castaño (Casthano et al., 1978; Day et al., 1977; Hansen et al., 1985; Lee et al., 2006). En la literatura existen numerosos ejemplos del uso de dsRNA viral para detectar, identificar y estudiar los virus, los satélites y los DIs que infectan plantas (Aboughanem-Sabanadzovic et al., 2016; De la Torre, et al., 2014; 2016; Demler y Zoeten, 1989; Dodds, 1982; Falk et al., 1979; Okada et al., 2011; Valverde y Dodds, 1986; Valverde et al., 1986; Valverde et al., 1995; Ward et al, 2009) y hongos (Azzam y Gonsalves, 1999; Deng y Boland, 2004; Kousik et al., 1994; Feldman et al 2012; Pecina et al., 2000; Shamoun et al, 2008).

En las plantas, las infecciones mixtas virales no son fácilmente detectables y, en consecuencia, se hacen diagnósticos inadecuados. Una ventaja del análisis de dsRNAs es que, a diferencia de otras técnicas de diagnóstico de virus, no es específica y, por tanto, se pueden visualizar las infecciones virales mixtas (Figura 5). En los hongos, las infecciones mixtas de micovirus comúnmente se detectan mediante el análisis electroforético de sus dsRNAs (Chu et al., 2004; Herrero et al., 2012; Kousik et al., 1994). Otra ventaja de esta técnica es que en algunos casos se pueden diferenciar las cepas del mismo virus por la movibilidad o el número de fragmentos de dsRNA después de la electroforesis en gel. Esto se ha observado con varias cepas del satélite del Virus del mosaico del tabaco (Valverde and Dodds, 1987). Además, los perfiles electroforéticos en gel de dsRNA viral se han utilizado para diferenciar cepas del Virus del mosaico del tomate (Valverde et al., 1986), CMV (Valverde et al., 1990a), y CTV (Dodds et al., 1987). No obstante, en las plantas, los miembros de las familias virales Potyviridae y Luteoviridae generan bajas cantidades de RF y dsRNAs subgenómicos (Creamer and Falk, 1989; Dale et al., 1986; Valverde et al., 1986), lo cual hace que su detección mediante análisis electroforéticos resulte impráctica.

Figura 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida (6 %) que muestra dsRNAs extraídos de plantas con infecciones virales mixtas. Carril 1, Virus X de la papa (PVX), Virus del mosaico del pepino (CMV) y RNA satélite; carril 2, Virus latente del diente de león (DLV), CMV y RNA satélite; y carril 3, Virus del mosaico del tabaco (TMV) y CMV. Las bandas de DsRNA están marcadas con letras de acuerdo con el virus al que pertenecen; a, PVX; b, CMV, c, RNA satélite; d, DLV, y e, TMV. 

Sondas moleculares

Se han producido sondas radioactivas y no radioactivas utilizando dsRNA para generar y etiquetar ARN y cDNAs (Enebak et al., 1994; Jelkmann et al., 1989; Jordan y Dodds, 1983; Rosner et al., 1983; Valverde y Dodds, 1986; Valverde et al., 1994; Valverde et al., 1990b). Jordan y Dodds utilizaron TMV dsRNA para preparar sondas marcadas radiactivamente con P32, que utilizaron con buenos resultados en experimentos de hibridación molecular. También se han preparado sondas mediante etiquetado directo de ARN utilizando dsRNA como materia prima (Valverde et al., 1994). Estas sondas no radiactivas se utilizaron para detectar (Oryza sativa endornavirus), Physalis mottle virus, Pepper cryptic virus 1, y micovirus no identificados del patógeno del cancro del tallo de la soya (Diaporthe phaseolorum). Se han utilizado extractos de dsRNA que son transferidos a las membranas para detectar el Virus del enanismo clorótico del camote (SPCSV) en (Pio-Ribeiro et al., 1996), Fiji virus (Karan et al., 1994), el Virus satélite del mosaico del tabaco (Valverde y Dodds, 1986), y un hipovirus 12 kb de C. parasitica (Enebak et al., 1994) en ensayos Northern de hibridación.

PCR en transcripción reversa, clonación y secuenciación

Los dsRNAs se han utilizado para clonar y secuenciar fitovirus y micovirus de ARN (Aboughanem-Sabanadzovic et al., 2016; Antoniw et al., 1986; Bar-Joseph et al., 1983; Enebak et al., 1994; Herrero et al., 2009; Khalifa y Pearson, 2014; Kim et al., 2005; Okada et al. 2011; Rott y Jelkmann, 2001; Jelkmann et al., 1989; Valverde y Sabanadzovic, 2009; Valverde y Sabanadzovic; Valverde et al. 1986; 1990; 2011; Zhang y Rowhani, 2000). Se han creado iniciadores según el tipo de virus para detectar mediante RT-PCR la mayoría de los fitovirus y los micovirus reportados a la fecha. Después de someterlo a desnaturalización por calor, el dsRNA viral purificado se ha utilizado extensamente como molde para la transcripción reversa de PCR (RT-PCR) en pruebas con fitovirus (Rott and Jelkmann, 2001; Sabanadzovic y Valverde, 2011; Valverde y Sabanadzovic, 2009; Valverde et al., 2011; Tzanetakis et al 2005). Winter et al. (1992) y Hoyer et al. (1996) caracterizaron el Virus del enanismo del camote utilizando un reactivo para la RT-PCR, la clonación y el etiquetado. Zhang y Rowhani (2000) desarrollaron un método rápido de clonación de cDNA a partir de moldes de dsRNA para caracterizar parcialmente virus de uva. Se obtuvieron clones de cDNA al azar de CTV mediante el uso de dsRNA de tejido de corteza de cítricos purificado y desnaturalizado (Albiach-Marti et al., 2010). La clonación molecular de fitovirus se ha realizado a partir de pequeñas cantidades de dsRNA viral después de purificarlo en gel (Jelkmann et al., 1989). Utilizando dsRNA extraído aplicando el método de De Paulo y Powell (1995), Kunta et al. (2007), se realizó la RT-PCR y fue posible detectar, clonar y secuenciar el genoma completo del viroide de los cítricos. De manera similar, De la Torre et al. (2009; 2015) detectaron viroides en durazno y aguacate utilizando dsRNA extraído con el método de Valverde et al., (1990), después de realizar la RT-PCR. Este método ha sido particularmente útil cuando se hacen pruebas en plantas que se sabe que producen ARN de baja calidad.

Se ha sugerido la extracción y purificación de dsRNA como un método para aumentar las secuencias virales en la preparación de muestras de NGS (Wu et al., 2015). En un estudio metagenómico de virus en muestras ambientales, Roossinck (2012) utilizó muestras concentradas con dsRNA viral y detectó altos niveles de virus persistentes en plantas. El ensamble De novo comparando con secuencias de genomas de virus disponibles en la base de datos del NCBI ha permitido identificar nuevas especies de endornavirus y micovirus (Espach et al., 2012; Jo et al., 2015; Khalifa et al., 2016). Utilizando dsRNAs virales, en combinación con secuenciación profunda, los investigadoress han podido obtener secuencias genómicas completas de fitovirus y micovirus (Al Rwahnih et al., 2011; Candresse et al., 2013; Coetzee et al., 2010; Deker y Parker, 2014; Espach et al., 2012; Quito-Avila et al., 2011; Magae, 2012), e identificar elementos que semejan virus en poblaciones microbianas acuáticas (Nerva et al., 2016). La secuenciación profunda de una sola vid reveló un viroma dominado por micovirus (Al Rwahnih et al., 2011).

Estudios de campo

Estudios de campo de virus ARN en plantas y hongos se han realizado mediante la extracción de dsRNAs, analizándolos en geles de agarosa o poliacrilamida y utilizándolos en RT-PCR y secuenciación. Los dsRNAs, aislados de 44 vides de un viñedo infectado en Sudáfrica, se utilizaron en un análisis de secuenciación profunda, a fin de realizar un censo de la población viral (Al Rwahnih et al., 2011). En estudios de campo de virus de hongos asociados con la planta parásita (Cuscuta cuspidata) y su planta huésped (Ambrosia psilostachya) en el hábitat de una pradera de hierbas altas en Oklahoma, los investigadores extrajeron dsRNA para detectar micovirus (Feldman et al., 2012). Los virus que se detectaron fueron caracterizados utilizando PCR de transcripción reversa y análisis de secuencia. Se llevó a cabo un estudio de campo de endornavirus en especies de plantas silvestres del sur de Luisiana utilizando una combinación de extracción de dsRNA y RT-PCR (Rodrigues de Souto et al., 2015). De 140 especies pertenecientes a 58 familias de plantas, se encontraron siete infectadas con supuestos endornavirus. En México, Piedra et al., (2005) realizaron estudios de campo para identificar el virus que infecta la maleza Leonotis nepetifolia (Lamiaceae), comúnmente presente cerca de los campos de cultivo. Utilizando extracción de dsRNA como una herramienta complementaria, los autores identificaron infecciones del Virus del mosaico de la alfalfa (AMV), CMV, ARN satélite de CMV y TMV en dicha especie de plantas. En un estudio de campo de virus que infectan el árbol del tabaco, en el sur de California, se realizaron análisis electroforéticos de dsRNA viral para la detección de virus (Valverde y Dodds, 1986). Mediante extracción de dsRNA y análisis electroforéticos, Herrero et al., 2009 realizaron un estudio de micovirus en una colección de 103 aislamientos pertenecientes a 53 especies diferentes de hongos endofíticos de pastos, y detectaron dsRNA en 12 aislamientos.

Enfermedades de plantas de etiología desconocida

Existen varios ejemplos de enfermedades de plantas de importancia económica de etiología desconocida en las que el agente causal fue elucidado utilizando dsRNA. El agente causal de la palidosis, una enfermedad de la fresa cuya etiología se desconocía anteriormente, fue identificado como un luteovirus utilizando dsRNA purificado (Tzanetakis et al., 2004; 2005). De manera similar, se determinó que la enfermedad de etiología desconocida que afecta la hoja del helecho de cuero era causada por una especie nueva de fitovirus. See utilizó dsRNA para clonar y secuenciar el virus que posteriormente se denominó Virus del moteado del helecho japonés (Valverde y Sabanadzovic, 2009). En un principio, mediante la detección de dsRNAs, se descubrió que la enfermedad de las venas grandes de la lechuga era causada por un virus (Mirkov y Dodds, 1985). En México no se conocía el agente causal de la enfermedad de la hoja del tomate (Physalis ixocarpa), que consiste en manchas amarillentas en las hojas; fue hasta 2003 cuando mediante análisis de dsRNA se confirmó que era AMV (De la Torre et al., 2003).

Virus persistentes en plantas

Los virus persistentes en plantas, que suelen estar presentes en plantas asintomáticas, tienen perfiles de bandas de dsRNA que podrían confundirse con los perfiles de virus agudos causantes de enfermedades (Roossinck, 2010; Valverde y Dodds, 1986; Valverde et al., 1990). Los virus persistentes en plantas reportados a la fecha pertenecen a las familias Amalgaviridae, Chrysoviridae, Endornaviridae, Totiviridae y Partitiviridae, que incluyen miembros que infectan plantas y hongos. No existe evidencia de que estos virus causen enfermedades en las plantas. La caracterización molecular de muchos de los virus persistentes en plantas se ha realizado a partir de material genómico o purificando RF dsRNA (Fukuhara, 1999; Pfeiffer, 1998; Okada, et al., 2011; 2013; Sabanadzovic y Valverde, 2011; Sabanadzovic et al., 2016; Sabanadzovic et al., 2010; Sabanadzovic et al., 2009). Utilizando una combinación de análisis electroforéticos de dsRNA viral y RT-PCR, Khankhum et al. (2015) se demostró que dos endornavirus tenían patrones diferenciales de infección entre los dos centros de domesticación del frijol común (Phaseolus vulgaris). La presencia de virus persistentes en algunos grupos de cultivos y especies de plantas silvestres destaca la importancia de incluir muestras de plantas asintomáticas (supuestamente sanas) cuando se aplique la técnica dsRNA para detectar e identificar virus agudos. En la Figura 6 se muestran los perfiles de dsRNA de tres virus persistentes y extractos de ácido nucleico de dos plantas sanas.

Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa (1.2 %) de dsRNAs extraídos de plantas asintomáticas. Carril 1, Phaseolus vulgaris sana; carril 2, Capsicum annuum sana; carriles 3-5 plantas infectadas con virus persistentes; carril 3, Persea americana infectada con un supuesto chrysovirus; carril 4, Solanum lycopersicum infectado con el Virus sureño del tomate; carril 5 Capsicum annuum infectado con endornavirus del pimiento; carril 6 escalera de ADN. 

Conclusión

Aunque el protocolo basado en celulosa para la extracción y purificación de dsRNA viral de plantas y hongos infectados con virus RNA se ha utilizado por más de 40 años, sigue siendo una herramienta práctica para los especialistas en diagnóstico y los investigadores en el estudio, detección e identificación de virus. Dada la simplicidad y versatilidad de la técnica, combinada con modificaciones que han mejorado la producción y la calidad del dsRNA, y disminuido los costos globales, hace que resulte práctica en los laboratorios con pocos recursos. Como se señaló anteriormente, en un principio esta técnica se aplicó en el análisis electroforético de dsRNAs virales y el uso de los patrones de bandas (perfiles electroforéticos) para detectar, y en algunos casos, identificar los virus. Sin embargo, hoy en día, se pone mayor énfasis en el uso de dsRNA viral para RT-PCR, clonación y secuenciación para la identificación de virus. Es posible que los métodos de extracción de dsRNAs virales lleguen a utilizarse en la implementación de NGS para la detección e identificación de virus. Esto ha sido demostrado con el uso de dsRNAs para realizar la secuenciación completa de genomas de RNA de plantas y hongos, e identificar elementos que semejan virus en poblaciones microbianas acuáticas utilizando NGS (Nerva et al., 2016), análisis de secuenciación profunda de virus que afectan a la vid (Al Rwahnih et al., 2011; Coetzee et al., 2010), y un estudio metagenómico de muestras ambientales (Roossinck, 2012).

Agradecimientos

Queremos agradecer el apoyo parcial de RAV mediante la subvención para la investigación No. US-4725-4 F de BARD del Fondo Binacional Estados Unidos-Israel de Investigación y Desarrollo Agrícolas, y al Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura de USDA.

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Recibido: 30 de Junio de 2016; Aprobado: 09 de Agosto de 2016

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