SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.34 número3Mecanismos, aplicaciones y perspectivas del silenciamiento génico de virus en plantasHistopatología del proceso de infección de Colletotrichum truncatum en hojas de papaya y chícharo índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

Links relacionados

  • No hay artículos similaresSimilares en SciELO

Compartir


Revista mexicana de fitopatología

versión On-line ISSN 2007-8080versión impresa ISSN 0185-3309

Rev. mex. fitopatol vol.34 no.3 Texcoco sep. 2016

https://doi.org/10.18781/r.mex.fit.1604-1 

Notas Fitopatológicas

Detección de Iris yellow spot virus en cebolla cultivada en Tepalcingo, Morelos, México

Sergio Ramírez-Rojas1  * 

Katya Ornelas-Ocampo1 

Felipe de Jesús Osuna-Canizalez1 

Juan Carlos Bartolo-Reyes1 

Vicente Varela-Loza1 

Jesús Hernández-Romano2 

Daniel Leobardo Ochoa-Martínez3 

1Campo Experimental Zacatepec, INIFAP. Km. 0.5 Carretera Zacatepec-Galeana. C. P. 62780, Colonia Centro Zacatepec, Morelos, México.

2Universidad Politécnica del Estado de Morelos. Bulevard Cuahunahuac #566, C.P. 62550, Colonia Lomas del Texcal, Jiutepec, Morelos, México.

3Posgrado en Fitosanidad-Fitopatología. Colegio de Postgraduados, km 36.5 carretera México-Texcoco, Montecillo, Texcoco, C.P. 56230 México.


Resumen.

En el estado de Morelos recientemente se han observado enfermedades virales en cebolla (Allium cepa); una de ellas es la mancha amarilla causada por el Iris yellow spot virus perteneciente a la familia Bunyaviridae del género Tospovirus, el cual se trasmite a la cebolla por Thrips tabaci Lindeman (Thysanoptera: Thripidae). En el 2012 la incidencia de esta enfermedad fue de 100 % en las 2,500 ha cultivadas en la entidad con una severidad superior a 90 %. El objetivo de este trabajo fue detectar mediante RT-PCR en tiempo real y secuenciar la presencia de IYSV. Para su identificación se tomaron muestras de hojas de cebolla con manchas amarillentas alargadas, desde el trasplante hasta la cosecha en Tepalcingo, Morelos. La extracción de ARN total se realizó utilizando TRIzol® Reagent. La detección del virus se realizó con primers específicos al gen de la nucleoproteína de IYSV dando como resultado la amplificación de un producto específico mediante RT-PCR en tiempo real y una banda esperada de 896 pb la cual mediante secuenciación confirmó 99 % de identidad con el gen de la nucleoproteína de este virus. El IYSV fue detectado en plantas de cebolla en Tepalcingo, Morelos y su secuencia se registró en la base de datos del GenBank (JX946658).

Palabras clave: RT-PCR en tiempo real; Tospovirus; Thrips tabaci; Mancha amarilla de la cebolla

Abstract.

In Morelos state, recently have been observed viral diseases in onion (Allium cepa); one of them is caused by the Iris yellow spot virus (IYSV) which belong to the Bunyaviridae family and the Tospovirus gender and is transmitted by Thrips tabaci Lindeman (Thysanoptera: Thripidae) to onion plants. In 2012, there was a 100 % incidence of IYSV and severity of over 90 % on 2,500 ha of commercial crop. The objective of this research was to identify the presence of IYSV through real time RT-PCR and sequencing of the virus. To accomplish this, leaves were sampled from commercial fields at Tepalcingo, Morelos, from transplanting to harvest. Total RNA extraction was done with TRIzol® Reagent. Virus detection was done using specific primers for the nucleoprotein gen of IYSV giving as a result the amplification of a specific product through real-time RT-PCR, and an expected strip of 896 bp, which after sequencing confirmed 99 % identity with the nucleoprotein gen of the virus. The IYSV virus was detected in onion plants from Tepalcingo, Morelos and the sequence obtained was registered in the database of the GenBank (JX946658).

Keywords: Real time RT-PCR; Tospovirus; Thrips tabaci; Onion yellow spot

La cebolla es un cultivo de importancia económica del cual se cosechan anualmente 53 millones de toneladas de bulbos de los casi 3 millones de hectáreas sembradas en todo el mundo (Gent et al., 2006). En Latinoamérica, México es el mayor productor de cebolla con 77,328 t cosechadas en 7,400 ha; además, es el décimo exportador a nivel mundial (FAO, 2011). Es el quinto cultivo más importante de las hortalizas; en Morelos se cosecha 10 % de la superficie sembrada en el país, lo que lo convierte en el cuarto mayor productor a nivel nacional (SIAP, 2012).

Entre las enfermedades que afectan al cultivo se encuentran las de índole viral, especialmente el Iris yellow spot virus (IYSV) (Gent et al., 2006).

El IYSV infecta a varias especies del género Allium incluyendo a la cebolla (Allium cepa) causando la mancha amarilla de la cebolla. Este virus pertenece al género Tospovirus de la familia Bunyaviridae (Gent et al., 2006). Su presencia se ha detectado desde 1981 en Brasil y Estados Unidos (Cortês et al., 1998.). El IYSV se ha propagado a importantes regiones productoras de cebolla a nivel mundial (Bulajić et al., 2009; Córdoba et al., 2005; Du Toit et al., 2004; Gent et al., 2006; Gera et al., 2004; Nischwitz et al., 2007; Pozzer et al., 1999; Schwartz et al., 2002; Smith et al., 2006).

En México este virus se ha identificado en plantaciones y viveros de cebolla de Zacatecas (Velásquez y Reveles, 2011; Velásquez et al., 2016).

El IYSV es trasmitido por Thrips tabaci, principal plaga de este cultivo (Riley et al., 2011). Kritzma et al. (2001) encontraron una relación entre las poblaciones de T. tabaci y la incidencia de la infección de IYSV, y demostraron que las concentraciones más elevadas del virus están en el área cercana al cuello de la planta, el cual es el sitio de alimentación y protección de trips.

La incidencia de IYSV aumenta después de la iniciación de la formación del bulbo con un incremento de 40 % comparado con 3 % antes de esta etapa (Fichtner et al., 2004; Hammon 2004), y a menudo alcanza niveles de 50 a 60 % (Kritzman et al., 2001), en países como Brasil ha llegado a niveles de 100 % provocando pérdidas totales de producción tanto de semilla como de bulbos (Pozzer et al, 1999).

El daño causado por el virus propicia el secado del follaje y la detención del crecimiento de los bulbos. Por lo tanto, el principal impacto económico de esta enfermedad está asociado con la reducción del tamaño de bulbo y en consecuencia la disminución del rendimiento (Gent et al., 2004). Además, la infección hace más susceptible a la planta de cebolla a condiciones adversas como sequía, exceso de riego, temperaturas altas, daño de minadores y trips, entre otros (Velásquez et al., 2016).

En México, el cultivo de esta hortaliza se realiza en dos ciclos agrícolas, el más importante es el de otoño-invierno donde se obtiene 60 % de la producción total, pero los síntomas de IYSV han sido observados en los dos ciclos mencionados (Osuna y Ramírez, 2013). El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de IYSV, mediante RTPCR en tiempo real, en plantas de cebolla provenientes de Tepalcingo, Morelos.

Se realizó la extracción de RNA total a cinco plantas de cebolla en la fase de formación de bulbo con síntomas atribuidos a IYSV, como se observa en la Figura 1, utilizando TRIzol® Reagent (Invitrogen). La síntesis de cDNA se llevó a cabo con 1 μg de RNA total con el paquete QuantiTect Reverse Transcription kit® (QIAGEN) utilizando los iniciadores IYSV-465c e IYSV-239f, específicos para la detección de IYSV (Pappu et al., 2008). La reacción de PCR en tiempo real se realizó con el paquete QuantiFast® SYBR® Green PCR (QIAGEN) con 10 ng de cDNA. Cada muestra se analizó por triplicado. El programa de PCR en tiempo real consistió de un paso inicial a 95 °C durante10 min, seguido de 40 ciclos con tres pasos: 95 °C 10 s, 61 °C 15 s, 72 °C 10 s. La ganancia de optimización fue registrada entre los 72 y 95 °C para la curva de disociación. La secuenciación parcial del gen N de la nucleoproteína se realizó utilizando los iniciadores IYSV917L e IYSV56U (Robène-Soustrade et al., 2006). El programa CLC Sequence Viewer 6.7 se utilizó para realizar el análisis filogenético entre la secuencia parcial del gen de la nucleoproteína de IYSV identificada en Tepalcingo, Morelos, con otras muestras reportadas en las bases de datos del GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information). El análisis se realizó con el algoritmo UPGMA con 100 replicaciones.

Los síntomas encontrados en los cultivos de cebolla relacionados con IYSV fueron manchas cloróticas, amarillentas o blancas, secas y alargadas. Las hojas maduras con los síntomas antes descritos presentaban manchas alargadas de diferentes tamaños, las cuales ocuparon hasta 70 % de su superficie (Figura1).

Figura 1. Síntomas asociados a la infección por Iris yellow spot virus en plantas de cebolla: a) y b) manchas cloróticas al inicio de la infección; c) manchas alargadas de color pajizo; d) coalescencia de lesiones principalmente en la base de las hojas. 

Para confirmar la presencia del IYSV, se hizo PCR en tiempo real en plantas con síntomas, obteniéndose una amplificación específica (Figura 2A). El análisis de disociación mostró un solo pico correspondiente a la amplificación de un fragmento del gen de la nucleocápside del virus (Figura 2B), lo cual demuestra que la amplificación fue específica para esta prueba.

Figura 2. Detección de Iris yellow spot virus (IYSV) por PCR en tiempo real. A. Amplificación de un fragmento del gen de la nucleocápside del virus, a partir de lesiones en hojas de cebolla. B. Curva de disociación específica de la amplificación del gen de la nucleocápside del mismo virus. 

La secuencia del gen de la nucleocápside del IYSV detectado en las plantas de cebolla, fue registrada en GenBank con el número de acceso JX946658. Mediante el análisis de homología se confirmó 99 % de identidad con secuencias previamente reportadas del gen de la nucleoproteína de IYSV. El análisis filogenético mostró que el aislamiento del virus en Tepalcingo, Morelos (JX946658) tiene mayor similitud con los reportados en Europa y Asía. El análisis muestra que no existe una asociación entre la secuencia del virus y su origen geográfico lo que limita su rastreabilidad (Figura 3). De manera natural los genomas virales de RNA presentan alta tasa de mutación durante el proceso de replicación (Elena et al., 2008). Sin embargo, hasta ahora el análisis global de IYSV muestra un flujo de genes restringido debido al confinamiento geográfico dando como resultado dos genotipos, IYSV-NL e IYSV-BR, siendo el primero hasta ahora el único presente en América, mientras que el segundo se encuentra principalmente en aislamientos asiáticos (Iftikhar et al., 2014).

Figura 3. Relaciones filogenéticas de las secuencias registradas de Iris yellow spot virus en el GeneBank de diferentes partes del mundo, con respecto a la secuencia obtenida en plantas de cebolla de Morelos, México (JX946658_IYSV_MEX). 

De acuerdo con Pappu et al. (2008), se ha comprobado que la técnica de RT-PCR en tiempo real es una técnica rápida y altamente confiable para detectar la presencia de IYSV en cebolla.

Conclusiones

Se comprobó la presencia de IYSV en plantas de cebolla cultivadas en Tepalcingo, Morelos mediante RT-PCR en tiempo real.

Agradecimientos

A los productores de cebolla de Morelos, México y al proyecto apoyado por FOMIX MOR-2010-01 clave 148902.

Literatura citada

Bulajić, A., Djekić, I., Jović, J., Krnjajić, S., Vučurović, A., and Krstić, B. 2009. Incidence and distribution of Iris yellow spot virus on onion in Serbia. Plant Dis. 93:976-982. http://dx.doi.org/10.1094/pdis-93-10-0976 [ Links ]

Córdoba, S.; L. Martínez P.; R. M. Muñoz G.; M. L. Lerma T.; C. J. G. 2005. Iris yellow spot virus (IYSV): A new virus disease in the spanish onions. Bol. San. Veg. Plagas, 31: 425-430. http://dx.doi.org/10.1094/pd-89-1243a [ Links ]

Cortês, I., Livieratos, I. C., Derks, A., Peters, D., and Kormelink, R. 1998. Molecular and serological characterization of iris yellow spot virus, a new and distinct tospovirus species. Phytopathology 88:1276-1282. http://dx.doi.org/10.1094/phyto.1998.88.12.1276 [ Links ]

Du Toit, L. J., Pappu, H. R., Druffel, K. L., Pelter, G. Q. 2004. Iris yellow spot virus in onion bulb and seed crops in Washington. Plant Dis. 88:222. http://dx.doi.org/10.1094/pdis.2004.88.2.222a [ Links ]

Elena, S. F., Agudelo R. P., Carrasco P., Codoner F. M., Martin S., Torres B. C., and Sanjuán R. (2008). Experimental evolution of plant RNA viruses. Heredity, 100(5), 478-483. http://dx.doi.org/10.1038/sj.hdy.6801088 [ Links ]

Fichtner, S. M., Gent, D. H., Schwartz, H. F., Cranshaw, W. S., Mahaffey, L., and Khosla, R. 2004. Geospatial relationships of Iris yellow spot virus and thrips to onion production in Colorado. Pages 149-151 in: Proc. Natl. Allium Res. Conf., Grand Junction, CO. Colorado State University, Fort Collins. http://dx.doi.org/10.1094/php-2010-0820-01-rs [ Links ]

Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), FAOSTAT consultado en el año 2011. Disponible en línea: http://faostat.fao.org/Links ]

Gent, D. H., Du Toit, L. J., Fichtner, S. F., Krishna Mohan, S., Pappu, H. R. and Schwartz, H. F. 2006. Iris yellow spot virus: an emerging threat to onion bulb and seed production. Plant Dis. 90:1468-1480. http://dx.doi.org/10.1094/pd-90-1468 [ Links ]

Gent, D. H., Schwartz, H. F., and Khosla, R. 2004. Distribution and incidence of Iris yellow spot virus in Colorado and its relation to onion plant population and yield. Plant Dis. 88:446-452. http://dx.doi.org/10.1094/pdis.2004.88.5.446 [ Links ]

Gera, A., Cohen, J., Salomon, R. and Raccah, B. 2004. Iris Yellow Spot Tospovirus detected in Onion (Allium cepa) in Israel. Plant Dis. 82:127. http://dx.doi.org/10.1094/pdis.1998.82.1.127b [ Links ]

Hammon, R. 2004. Managing Thrips in western Colorado onions. Page 107 in: Proc. 2004 Natl. Allium Res. Conf., Grand Junction, CO. Colorado State University, Fort Collins. Disponible en línea: http://www.colostate.edu/Orgs/VegNet/Resources/2009%20Straw%20Mulch.pdfLinks ]

Iftikhar, R., Ramesh S. V., Bag S., Ashfaq M., and Pappu, H. R. 2014. Global analysis of population structure, spatial and temporal dynamics of genetic diversity, and evolutionary lineages of Iris yellow spot virus (Tospovirus: Bunyaviridae). Gene, 547(1), 111-118. http://dx.doi.org/10.1016/j.gene.2014.06.036 [ Links ]

Kritzman, A., Lampel, M., Racaah, B., and Gera, A. 2001. Distribution and transmission of Iris yellow spot virus. Plant Dis. 85:838-842. http://dx.doi.org/10.1094/pdis.2001.85.8.838 [ Links ]

Nischwitz, C., Pappu. H. R., Mullis, S. W., Sparks A. N., Langston, D. R., Csinos A. S. and Gitaiti, R. D. 2007. Phylogenetic Analysis of Iris yellow spot virus Isolates from Onion (Allium cepa) in Georgia (USA) and Peru. J. Phytopathology 155, 531-535. http://dx.doi.org/10.1111/j.1439-0434.2007.01272.x [ Links ]

Osuna C. F.J. y Ramírez R. S. 2013. Manual para cultivar cebolla con fertirriego y riego por gravedad en el estado de Morelos. SAGARPA. INIFAP. CIRPAS. Campo Experimental Zacatepec. Libro Técnico No. 12. 155 p. Disponible en línea: https://www.researchgate.net/profile/Felipe_Osuna3/publication/279852442_Manual_para_cultivar_cebolla_con_fertirriego_y_riego_por_gravedad_en_el_estado_de_Morelos/links/559c166208ae898ed650fe32.pdfLinks ]

Pappu, H. R., Rosales, I. M., and Druffel, K. L. 2008. Serological and molecular assays for rapid and sensitive detection of Iris yellow spot virus infection of bulb and seed onion crops. Plant Dis. 92:588-594. http://dx.doi.org/10.1094/pdis-92-4-0588 [ Links ]

Pozzer, L., Bezerra, I. C., Kormelink, R., Prins, M., Peters, D., Resende, R. de O., and de Ávila, A. C. 1999. Characterization of a tospovirus isolate of Iris yellow spot virus associated with a disease in onion fields in Brazil. Plant Dis. 83:345-350. http://dx.doi.org/10.1094/pdis.1999.83.4.345 [ Links ]

Riley, D. G., Joseph, S. V., Srinivasan, R., and Diffie, S. (2011). Thrips vectors of tospoviruses. Journal of Integrated Pest Management, 2(1), 1-10. http://dx.doi.org/10.1603/ipm10020 [ Links ]

Robène, S. I., Hostachy B, Roux, C. M., Minatchy, J., Hédont, M., Pallas, R., Couteau, A., Cassam, N., Wuster, G., 2006. First report of Iris yellow spot virus in onion bulb and seed production fields in Reunion Island. Plant Pathology 55, 288. http://dx.doi.org/10.1111/j.1365-3059.2005.01262.x [ Links ]

Schwartz, H. F., Brown, W. M., Blunt, T., Gent, D. H. 2002. Iris yellow spot virus on onion in Colorado. Plant Dis. 86:560. http://dx.doi.org/10.1094/pdis.2002.86.5.560d [ Links ]

Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP). Cierre de la producción agrícola por cultivo. consultado en el año 2012. Disponible en línea: http://www.siap.gob.mx/index.php?option=com_wrapper&view=wrapper&Itemid=350Links ]

Smith, T. N., Wylie, S. J., Coutts, B. A., and Jones, R. A. C. 2006. Localized distribution of Iris yellow spot virus within leeks and its reliable large-scale detection. Plant Dis. 90:729-733. http://dx.doi.org/10.1094/pd-90-0729 [ Links ]

Velásquez V. R. y Reveles H. M., 2011. Detección del Iris yellow spot virus en el cultivo de cebolla en Zacatecas, México. Revista mexicana de ciencias agrícolas, 2(6), 971-978. Disponible en línea: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S2007-09342011000600013&script=sci_arttextLinks ]

Velásquez V. R., Reveles T. L. R., Salas M. S., Mauricio C. J. A., and Pappu, H. R. 2016. First Confirmed Report of Iris yellow spot virus in Onion Nurseries in Zacatecas, México. Plant Dis. http://dx.doi.org/10.1094/pdis-01-16-0061-pdn [ Links ]

Recibido: 01 de Abril de 2016; Aprobado: 15 de Junio de 2016

*Correspondencia: sergioinifap@yahoo.com.mx

Creative Commons License Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons