Identificación morfológica y molecular

Nueve microorganismos: cinco aislados de hongos fitopatógenicos, dos de hongos antagonistas y dos de bacterias antagonistas, usados en este estudio, fueron identificados hasta género con la ayuda de claves taxonómicas, de acuerdo a sus caracteres morfológicos, así como observados en un microscopio óptico (Carl Zeiss, Jena, Germany) (^{Dugan, 2006}; ^{Watanabe, 2010}). Subsecuentemente, fueron identificados molecularmente en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, CINVESTAV, Campus Irapuato, Guanajuato, México.

Para identificar los aislados de hongos por sus caracteres moleculares, se extrajo su ADN genómico (ADNg). Por lo tanto, un explante de cada hongo purificado se colocó y cultivó en una caja de Petri con PDA cubierto con celofán estéril para facilitar la recolecta de la biomasa fúngica e incubado a 26 °C por 7 d. El micelio se recolectó en un mortero de porcelana, junto con un amortiguador [200 mM Tris-HCl a pH = 8, 250 Mm NaCl, 25 mM EDTA, 0.5 % SDS] para la extracción de ADNg de hongos filamentosos a 70 °C, congelado con nitrógeno líquido y macerado, siguiendo el protocolo descrito por ^{Raeder and Broda (1985)}. El ADNg obtenido de los hongos, fue examinado por electroforesis en un gel de agarosa al 1 %, el cual se utilizó para amplificar el gen 18S del ADN ribosomal (ADNr) y el Espaciador Transcrito Interno (ITS, por sus siglas en inglés), usando los iniciadores universales ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), donde los fragmentos esperados fueron de aproximadamente 600 a 710 pb (^{White et al., 1990}). Las condiciones de amplificación fueron divididas en varios pasos: un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, un segundo paso comprendiendo 30 ciclos, incluyendo una desnaturalización a 94 °C por 30 s, un paso de alineamiento a 60 °C por 30 s, un paso de extensión a 72 °C por 45 s y cuando se completaron los ciclos, una extensión final a 72 °C por 10 min.

Para las bacterias antagonistas, se tomó un explante de la colonia purificada de 72 h de crecimiento, para la extracción del ADNg descrita por ^{Heddi et al. (1999)}. El ADNg obtenido, se examinó por electroforesis en un gel de agarosa al 1 %, el cual se utilizó para amplificar el gen del 16S del ADNr por PCR, usando los iniciadores universales EU(F) (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') y EU(R) (5'-TACCTTGTTACGACTTCACC-3'). Las condiciones de amplificación se dividieron en varios pasos: un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, un segundo paso comprenidendo 35 ciclos incluyendo una desnaturalización a 94 °C por 30 s, un paso de alineamiento a 53 °C por 45 s, un paso de extensión a 72 °C por 45 s y cuando los ciclos se completaron, una extensión final a 72 °C por 10 min (^{Heddi et al., 1999}).

Los productos de PCR de ambos taxones de microorganismos, se examinaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 %. Subsecuentemente, fueron secuenciados por la compañía Macrogen (Rockville, Maryland, EUA). Las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos del NCBI usando el algoritmo de BLAST (^{Altschul et al., 1990}), para verificar el porcentaje de identidad y que correspondíeran a las especies identificadas. Las secuencias de nucleótidos obtenidas, no han sido depositadas en el NCBI.

Preparación del inóculo

El inóculo se preparó mediante una suspensión de esporas fúngicas y bacterias, respectivamente, en agua peptonada estéril que contenía cloruro de sodio al 0.85 % y peptona al 0.1 % en microtubos de 2 mL. La concentración de esporas se estimó usando una cámara de Neubauer (Neubauer Improved bright-line, Marienfield, Alemania) y las bacterias se cuantificaron por la técnica de diluciones seriadas y conteo de colonias en placa. Ambas suspensiones se almacenaron a 0 °C hasta su uso. La concentración de la suspensiones donde los círculos de papel filtro fueron sumergidas para la evaluación de la actividad antagónica in vitro, fluctuó de 1.0 × 10⁷ a 9.5 × 10⁷ esporas de hongos o UFC-bacteria por mililitro.

Evaluación del antagonismo In vitro

Las confrontaciones in vitro de T. asperellum contra hongos fitopatogénicos, se realizaron usando la técnica de cultivo dual (cajas de Petri, 90 × 15 mm) con PDA, que consistió en colocar en un lado de la caja, un círculo de papel filtro de 6 mm de diámetro, impregnado con una suspensión de conidias y micelio del inóculo del patógeno y en el lado opuesto de la caja de Petri, se colocó otro círculo de papel filtro con el micelio y/o conidias del antagonista. Se realizaron diez repeticiones por triplicado para cada evaluación. También se consideraron diez testigos (cajas de Petri) por triplicado, tanto de los fitopatógenos como de los antagonistas, crecidos por separado. Las cajas de Petri inoculadas, se incubaron a 28 °C por 15 d en una cámara ambiental (Precision Scientific, Model 6LM, Winchester, EUA). El crecimiento radial de las colonias de hongos se midió cada 24 h para ambos microorganismos patógenos y antagonistas. El halo de inhibición, entre las colonias de fitopatógenos y antagonistas en confrontación, se midió hacia los puntos cardinales de la caja Petri a los 14 d post-incubación (^{Aquino-Martínez et al., 2008}).

Se evaluó el tiempo cuando las colonias patógeno-antagonista entraron en contacto, la inhibición del crecimiento radial de la colonia y el tipo de antagonismo de acuerdo con la escala de Bell (^{Bell et al., 1982}). Donde la actividad antagónica se midió en cinco niveles, siendo el nivel uno de la escala cuando el antagonista sobrecreció completamente al patógeno y llenó por completo la superficie del medio de cultivo, y el nivel cinco fue cuando el patógeno sobrecreció por completo al antagonista y llenó por completo la superficie del medio de cultivo. El antagonismo de T. asperellum se evaluó registrando las siguientes variables: crecimiento radial del antagonista (CRA), crecimiento radial del patógeno (CRP) y el porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR). El PICR se determinó al sexto día de post-incubación usando la fórmula propuesta por ^{Ezziyyani et al. (2004)}, PRGI = [(R1 - R2) / R1] × 100, donde R1 fue el crecimiento radial de la colonia testigo (patógeno) y R2 el crecimiento radial de la colonia del patógeno en la confrontación in vitro.

La confrontación in vitro de las especies de Bacillus contra patógenos se realizó colocando un círculo de papel filtro de 6 mm de diámetro del patógeno en el centro de la caja de Petri, que contenía PDA, mientras la bacteria se inoculó en los puntos cardinales de la caja de Petri, usando círculos de papel filtro de 6 mm de diámetro con el inóculo. Se realizaron diez repeticiones (cajas de Petri) por triplicado, para cada evaluación in vitro bacteria-hongo. Cada uno de los los tratamientos testigo de hongos fitopatógenos se sembraron por separado, e incubados a 28 °C por 14 d. Se midió diariamente, el crecimiento radial del patógeno en la confrontación, hacia la colonia del antagonista y en los testigos se midió el crecimiento radial desde el centro de la caja de Petri hacia los puntos cardinales.

Análisis estadístico

Ambos bioensayos se realizaron por triplicado, con diez cajas de Petri por cada repetición, para cada evaluación in vitro de bacteria-hongo, usando un diseño completamente al azar, con cinco tratamientos: dos aislados de hongos antagonistas y dos aislados de bacterias antagonistas, confrontados contra cinco patógenos, además de 1 control, donde cada tratamiento fue un microorganismo antagonista con 30 cajas de Petri (ej., un total de 600). Los datos del PICR y halo de inhibición se analizaron usando el Statistical Analysis System versión 9.0 (^{SAS, 2002}), para el análisis de varianza (ANVA) y las medias fueron separadas usando la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

Patógenos y antagonistas identificados

Los hongos fitopatógenos identificados morfológicamente y de las secuencias de los productos de PCR fueron: Fusarium oxysporum cepa LCF32, Botrytis cinerea cepa G409, Penicillium crustosum cepa 06CK005, Aspergillus nidulans cepa UOA/HCPF, Alternaria alternata cepa HMY 2-1, los cuales tuvieron un 99-100 % de identidad, excepto P. crustosum, que mostró un 78 % de identidad, y una máxima similitud con las máximas puntuaciones y las claves taxonómicas, correspondiendo a cada cepa y de acuerdo con las secuencias disponibles en la base de datos del GenBank (NCBI), obtenidas por el algoritmo de BLAST (^{Altschul et al., 1990}). Así mismo, los datos de la secuenciación mostraron que los aislados de los hongos y bacterias antagonistas identificados fueron: Trichoderma asperellum TC1 cepa LAHC-FFPK-M16- y Trichoderma asperellum TC2 cepa BHU-BOT-RYRL16, Bacillus methylotrophicus cepa IS04, Bacillus amyloliquefaciens cepa Abk-2, tuvieron 99-100 % de identidad y las máximas puntuaciones, al ser comparadas con las secuencias del GenBank, obtenidas por el algoritmo de BLAST en la base de datos del NCBI (^{Altschul et al., 1990}).

Actividad antagónica

I in vitro . El crecimiento radial de los cinco hongos fitopatogénicos evaluados, se redujo significativamente al ser evaluado in vitro contra T. asperellum TC1 y TC2, donde ambos hongos antagonistas mostraron una eficiencia significativa al inhibir el crecimiento de los hongos fitopatógenos a los 6-8 d post-evaluación (Cuadro 1, Figura 1). Las cajas de Petri de los testigos de ambos aislados de T. asperellum, fueron completamente cubiertas por el crecimiento de los hongos al tercer día de post-inoculación. Mientras tanto, al sexto día post-inoculación, ambos aislados TCI y TC2, entraron en contacto con F. oxysporum, B. cinerea, P. crustosum, and A. Alternata, excepto con A. nidulans. Los valores más altos de PICR se mostraron en B. fabae con ambos aislados de T. asperellum TC1 y TC2 con 71.6 y 69.8 %, respectivamente (Cuadro 1), mientras que los valores más bajos se observaron en P. crustosum y F. oxysporum con 52.3 y 43.3 %, respectivamente (Cuadro 1).

Cuadro 1 Crecimiento radial in vitro de hongos fitopatógenos, al ser inhibidos por especies de Bacillus a los 14 d post-inoculación y por especies de Trichoderma a los seis días de incubación. 

Las letras en la misma columna, indican diferencias significativas en los tratamientos donde las medias seguidas por la misma letra, no son significativamente diferentes (ANVA) de acuerdo con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05).

La actividad antagónica se midió de acuerdo con la escala de Bell et al. (1982) donde: (1) el antagonista (Trichoderma) sobrecrece completamente la colonia del patógeno y cubre completamente la superficie del medio, y (2) el antagonista (Trichoderma) sobrecrece dos tercios de la superficie del medio. DE = Desviación estándar.

Figura 1 Micoparasitismo de Trichoderma asperellum TC1 (a1-a5) y Trichoderma asperellum TC2 (b1-b5), y halos de inhibición de Bacillus amyloliquefaciens (c1-c5) al ser confrontado in vitro contra Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Penicillium crustosum, Alternaria alternata y Aspergillus nidulans, respectivamente, a los 14 d post-inoculación. 

En las evaluaciones in vitro contra A. nidulans, se observaron halos de inhibición de 2.6 y 4.5 mm con los aislados de T. asperellum TC1 y TC2, respectivamente (Cuadro 2, Figura 1), esto puede deberse a la producción de compuestos volátiles que inhibieron el crecimiento de Trichoderma spp., aún así, ambos aislados fueron eficientes en reducir el crecimiento de los hongos fitopatógenos al sexto día de post-inoculación (^{Duffy et al., 2003}; ^{Harman, 2006}; ^{Zeilinger and Omann, 2007}; ^{Vinale et al., 2008}). Al respecto, ^{Cooney et al. (2001)}, mencionan que T. harzianum produce el antibiótico 6-pentil-α-pirone, el cual tiene un efecto dual en la inhibición del crecimiento del patógeno y también puede regular los genes por la biosíntesis de tricotecenos y micotoxinas con actividad antimicrobiana de amplio espectro. Asimismo, ^{Gajera and Vakharia (2010)} reportaron una alta inhibición del crecimiento de A. niger causada por T. viride y T. harzianum durante un estudio realizado in vitro. Además de tener la habilidad para producir enzimas que degradan la pared celular tales como la quitinasa, β-1,3 glucanasa y proteasa en el medio de cultivo durante el antagonismo in vitro. Por otra parte, el antagonista o sus antibióticos purificados, pueden reducir la producción de deoxinivalenol por debajo del 80 % y los genes antagónicos están regulados por la presencia del patógeno (^{Duffy et al., 2003}). Por lo tanto, la eficiencia de Trichoderma spp. para inhibir hongos fitopatógenos puede deberse a su competencia por espacio y nutrientes, producción de antibióticos (compuestos volátiles y no volátiles), micoparasitismo e inactivación de las enzimas de los patógenos (^{Ezziyyani et al., 2004}).

Cuadro 2 Halo de inhibición entre las colonias de hongos fitopatógenos y las especies antagónicas de Bacillus a los 14 d post-inoculación y aislados de Trichoderma asperellum a los 6 d de incubación. 

Las letras en la misma columna, indicant diferencias significativas en los tratamientos donde las medias seguidas por la misma letra, no son significativamente diferentes (ANVA) de acuerdo con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). DE = Desviación estándar.

Además, un halo de inhibición se observó en el aislado T. asperellum TC2 cuando se evaluó in vitro contra P. crustosum (Cuadro 2), esto puede ser debido a la producción de patulina, un metabolito secundario producido por este fitopatógeno (^{Leelasuphakul et al., 2008}).

La inhibición del crecimiento de las colonias de hongos patogénicos, inducida por B. methylotrophicus y B. amyloliquefaciens, fue significativamente diferente, donde el mayor efecto se observó en B. cinerea con PICRs de 69 y 63.5 %, respectivamente, A. alternata mostró PICRs de 66 y 64.1 %, respectivamente; donde las menores reducciones del crecimiento se registraron para F. oxysporum, P. crustosum y A. nidulans (Cuadro 1). Estos resultados son similares a los obtenidos por ^{Madhaiyan et al. (2010)} y ^{Zhang et al. (2012)} quienes encontraron una alta capacidad de algunas cepas de Bacillus de las mismas especies para inhibir el crecimiento de diversos hongos fitopatógenos, lo cual es debido a la producción de compuestos volátiles y antibióticos pertenecientes a la familia de las iturinas y subtilinas, que actuan en la pared celular de los hongos. También, la producción de enzimas hidrofílicas para destriuir los polisacáridos, ácidos nucléicos y lípidos, los cuales son usados como fuente de energía y que podrían estar involucrados.

Bacillus amyloliquefaciens y B. methylotrophicus indujeron un halo de inhibición de la colonia del patógeno a los 14 d post-incubación (Cuadro 2). Las medias por antagonista, mostraron que B. methylotrophicus tuvo mayor actividad antagónica que B. amyloliquefaciens, ya que el promedio de los halos de inhibición fue significativo, de 4.95 a 13.15 mm y 4.15 a 8.45 mm, respectivamente, en las colonias de hongos fitopatógenos (Cuadro 2). Los mayores halos de inhibición producidos por B. amyloliquefaciens y B. methylotrophicus se observaron con B. cinerea con 8.45 y 13.25 mm, respectivamente (Cuadro 2). Bacillus methylotrophicus mostró los mayores efectos antagónicos contra fitopatógenos, que puede deberse a la producción de antibióticos y/o compuestos orgánicos volátiles como cianuro de hidrógeno, el cual inhibe el crecimiento de hongos fitopatógenos y ejerce efectos nocivos en el crecimiento in vitro de varios fitopatógenos, estos compuestos pueden tener efectos directos e indirectos en la actividad de enzimas fúngicas específicas (^{Wheatley, 2002}; ^{Duffy et al., 2003}; ^{Correa et al., 2009}; ^{Zhang et al., 2012}), así como también lo reportado por ^{Madhaiyan et al. (2010)} y ^{Zhang et al. (2012)}, quienes encontraron que las cepas de B. methylotrophicus tienen una alta actividad antagónica contra una gran diversidad de hongos fitopatógenos.

De acuerdo con ^{Guillén-Cruz et al. (2006)}, B. amyloliquefaciens fue el más eficiente contra Phytophthora spp. al ser evaluado in vitro, además de tener un efecto antagonista e inducir el crecimiento vegetal. Al respecto, ^{Souto et al. (2004)} mencionan que la cepa de B. amyloliquefaciens adiciona péptidos y lipopéptidos al medio de cultivo, tales como fungicina, iturina, bacilomicina, entre otros, teniendo propiedades antifúngicas al ser confrontada in vitro contra hongos fitopatógenos tales como Fusarium, Rhizoctonia y Sclerotinia.

Ambos antagonistas, bacterias y hongos, inhibieron significativamente el crecimiento in vitro de F. oxysporum, B. cinerea, P. crustosum, A. alternata, y A. nidulans, donde B. methylotrophicus y T. asperellum TC1, fueron los más eficientes, lo cual sugiere la presencia de compuestos bioactivos. Por lo tanto, pueden ser considerados como agentes de control biológico viables. Por lo que, es importante llevar a cabo más estudios para identificar esos compuestos bioactivos y la forma en que suprimen el crecimiento de los patógenos.