Adhesión bacteriana y sobrevivencia en las plantas

El primer paso para que ocurra una infección bacteriana en tejido vegetal es el contacto con el filoplano. La presencia y sobrevivencia de las bacterias en hojas o frutos puede ser influenciada por la rugosidad de la superficie y las tricomas, condiciones ambientales también son clave para la modulación de la estructura bacteriana (^{Wan-Ying et al., 2015}).

La temperatura, el pH, la humedad relativa y la presencia de agua líquida son factores ambientales que afectan el comportamiento y el tiempo de sobrevivencia de las bacterias en las plantas. Estos factores pueden ser decisivos para la activación microbiana y su crecimiento.

La movilidad en el filosfera, la capacidad del patógeno para lixiviar los nutrientes, y sus interacciones con otras microorganismos epifitos o fitopatógenos son factores adicionales relativos a la capacidad de las bacterias para unirse y proliferar en la planta (^{Aruscavage et al., 2006}). Por ejemplo, ^{Cooley et al. (2006)} reportaron que Wausteria paucula puede ayudar de forma activa a mejorar la sobrevivencia de E. coli O157:H7 en la rizosfera y en la cutícula de la hoja de la lechuga. Del mismo modo, Xanthomonas campestris pv. vitians, también sustenta a la sobrevivencia de E. coli O157:H7 en la lechuga (^{Aruscavage et al., 2008}).

La capacidad de la bacteria para unirse a la superficie del tejido vegetal es una característica importante que influye en su establecimiento en la planta. Por ejemplo, un estudio realizado por ^{Macarisin et al. (2012)} mostró que los constituyentes de la matriz extracelular tales como la fimbria (curli) junto con la celulosa pueden ser importantes en la adhesión de E. coli O157:H7 a las hojas de espinaca.

De acuerdo a los mecanismos de adhesión de E. coli,^{Franz et al. (2007}) y ^{Xicohténcatl-Cortés et al. (2009)}, sugieren que la bacteria utiliza varias vías para colonizar a las plantas. La bacteria patógena se adapta bien a la biosfera y puede llegar a la cavidad subestomatal y al mesófilo esponjoso para sobrevivir. En un estudio realizado por ^{Prigent-Combaret et al. (2000)} la cepa E. coli K-12 formó curli sobre cubreobjetos; lo que permitió a la bacteria unirse a una superficie limpia e inerte (vidrio).

Para colonizar los tejidos del hospedante, E. coli O157:H7 expresa intimina y otras adhesinas. Las adhesinas son un grupo de proteínas involucradas en la unión de E. coli tanto a superficies abióticas (plástico y acero), como a superficies vivas (^{McWilliams y Torres, 2014}).

Por otra parte, estas proteínas bacterianas localizadas en la membrana externa, como intimina y su receptor traslocado intimina (Tir), son necesarias para la adhesión entre la célula hospedera y E. coli para producir la lesión de "adhesión y borrado" (A/E). Estas bacterias A/E tienen una característica esencial; la formación de un pedestal rico en actina que le confiere la habilidad para mantener una estrecha unión. La intimina es codificada por el gen eaeA, de la membrana externa y es uno de los factores de virulencia más importante de E. coli. La intimina está implicada en el proceso de fijación de E. coli O157:H7 y por mucho tiempo fue considerada el único factor de colonización, antes de descubrir otras adhesinas como las fimbriales y afimbriales (^{Farfán y Torres, 2012}). La intimina se regula por el locus LEE (^{Kendall et al., 2007}). Su expresión se puede regular con el fin de responder a factores externos como la osmolaridad y pH (^{Torres et al., 2007}). En un estudio realizado por ^{Carey et al. (2009}) en lechuga, la regulación del gen eaeA de E. coli O157:H7 se redujo durante el almacenamiento a 15 °C, en comparación con el almacenamiento a 4 °C.

El sistema de secreción tipo III (SST3) es un factor de virulencia clave codificado en plásmidos grandes. Es una compleja nanomaquinaria que les permite a las bacterias secretar proteínas efectoras a traves de la membrana de las células eucariotas (^{Cornelis, 2006}). Así, ECEH O157:H7 coloniza la superficie de la hoja mediante sus flagelos y el SST3 (^{Xicohténcatl-Cortés et al., 2009}). También, ^{Shaw et al. (2008)} documentó que E. coli O157:H7 presenta el gen que codifica para T3SS propiciando su adhesión en hojas de espinaca y lechuga, así como los filamentos EspA que le permiten a la bacteria unirse a la cutícula vegetal.

Una vez que las bacterias se adhieren a una planta, inicia un proceso de reconocimiento en la superficie de la misma. Un estudio realizado por ^{Cooley et al. (2003)}, demostró la capacidad de E. coli para migrar desde el suelo inoculado con el patógeno hacia el tallo y superficies de Arabidopsis thaliana. En este experimento, después de un tiempo la bacteria pudo ser aislada de hojas y flores. Esto indica que la bacteria puede moverse con facilidad en toda la superficie de la planta bajo condiciones controladas. Sin embargo, algunos investigadores sugieren que bacterias patógenas como E. coli O157:H7 pueden sobrevivir por períodos cortos de tiempo en la superficie de la planta y podría pasar al tejido (^{Erickson, 2012}).

La exposición a condiciones de estrés permite a las bacterias sobrevivir bajo estas condiciones, e incluso mejorar su tolerancia. ^{Carey et al., (2009)} reportó que rpoS, que codifica para el factor sigma S relacionado con la respuesta al estrés en la fase estacionaria; y sodB (gen que codifica para la superóxido dismutasa B) fueron regulados positivamente a 4 °C y negativamente después de almacenamiento prolongado a 15 °C, cuando las bacterias se inocularon en lechuga. Muchos genes son controlados por rpoS y están relacionados con la resistencia a factores de estrés, tales como el pH, la temperatura o estrés oxidativo (^{Dodd y Aldsworth, 2002}).

La radiación ultravioleta (UV) es uno de los principales factores que limitan la sobrevivencia de la bacteria en la filósfera. No obstante, E. coli posee el gen rulAB que le confiere resistencia a la radiación UV (^{Brandl, 2006}), el cual confiere a la bacteria la capacidad para reparar DNA y para aumentar su tolerancia a los rayos UV (^{Feil et al, 2005}). Por lo tanto, E. coli tiene la capacidad de soportar la radiación UV.

Por otra parte, las biopelículas son comunidades bien estructuradas y organizados de células asociadas a la superficie dentro de una matriz de polímeros que contiene canales de agua abiertos (^{Donlan y Costerton, 2002}). Las biopelículas fueron descritas por primera vez a finales de 1600 por Anton van Leeuwenhoek (^{Donlan y Costerton, 2002}). Cuando Leeuwenhoek utilizó ácido acético para destruir la placa dental en su dentadura, observó que sólo murieron las bacterias que se movían libremente. Hasta hace relativamente poco tiempo (últimos 30 años) se le prestó mayor importancia a aquellos primeros hallazgos sobre comunidades bacterianas que habían sido ignorados, poniendo mayor atención a las propias bacterias.

En una biopelícula, los patógenos viven dentro de una matriz autoproducida. Esta matriz formada por polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos (^{Flemming y Wingender, 2010}) permite que las bacterias resistan durante períodos prolongados en la superficie de plantas, y les confiere una alta resistencia a agentes antimicrobianos. Las biopelículas por su naturaleza, pueden ser una fuente de contaminación secundaria, la cual puede albergar bacterias patógenas a plantas, a humanos así como simbiontes. Por lo tanto, las biopelículas son un componente básico para muchas interacciones planta-microorganismo.

E. coli presenta mecanismos bien documentados relacionados con la adhesión que le permiten unirse a las superficies. Sin embargo, aún hay mucho por estudiar acerca de los mecanismos de señalización y reconocimiento que le permiten al patógeno establecerse y sobrevivir en organismos no hospedantes. Además, aún no está claro cómo este patógeno logra adherirse a superficies abióticas como el acero, vidrio y poliestireno.

Interacción e internalización en plantas

^{Saldaña et al. (2011)} reportan que E. coli O157:H7 utiliza el sistema de secreción tipo III, efector específico T3SS, para abrir las células guarda de los estomas de hojas de espinaca. Esta acción permite la internalización de la bacteria al tejido vegetal.

Otros estudios han demostrado que E. coli O157:H7 puede internarse dentro de las semillas y raíces, y luego migrar a otros tejidos (^{Ávila-Quezada et al., 2010}). El movimiento puede ser desde las raíces hacia el follaje, como se demostró en un experimento realizado por ^{Solomon et al. (2002)} en lechuga. En este experimento el suelo contenía estiércol contaminado y después de dos días, la bacteria pudo ser aislada del tejido foliar de la lechuga.

La introducción de este patógeno humano en las primeras etapas de desarrollo de la planta ha sido documentado por ^{Jablasone et al. (2005)}. En este trabajo E. coli O157:H7 logró internarse en las plántulas. Los autores reportaron que la bacteria coloniza preferentemente las uniones de la raíz. Puesto que las uniones de raíz son sitios que liberan exudados, se convierten en posibles puertas para que las bacterias inicien el proceso de internalización. ^{Lugtenberg et al. (2001)} sugiere que en las zonas de unión en la raíz, las bacterias pueden tener más acceso a los nutrientes que otros sitios, y por lo tanto cuando las bacterias se mantienen por un largo periodo sobre las plantas, las posibilidades de ingresar a la plántula en desarrollo incrementan.

Muchos estudios han demostrado que E. coli O157:H7 es capaz de entrar por las aberturas naturales en la epidermis de la planta, tales como las cavidades sub-estomatales de las hojas (^{Brandl, 2008}; ^{Erickson, 2012}; ^{Kroupitski et al., 2009}). Una vez que las bacterias se encuentran dentro de la planta, y las células de guarda se cierran, las bacterias quedan protegidas de la mayoría de los sanitizantes superficiales (^{Gomes et al., 2009}). Por lo tanto, mientras un patógeno posee la capacidad de entrar en los tejidos vegetales, los riesgos a la salud humana están latentes (^{Deering et al., 2012}; ^{Warriner et al, 2003a}, ^b) puesto que el patógeno está protegido del proceso de lavado y de muchos desinfectantes industriales (^{Burnett y Beuchat, 2000}).

Las bacterias se encuentran generalmente en baja concentración en las hortalizas, pero, bajo las condiciones adecuadas, en pocas horas el número de células bacterianas puede multiplicarse a cientos de miles (^{Haas et al., 2014}). Por ejemplo, la población de E. coli O157:H7 incrementó exponencialmente después de su inoculación en tejido de manzanas, donde el inóculo de 2.5 x 10² UFC/herida, aumentó tres log en las primeras 48 horas después de la inoculación (^{Janisiewicz et al., 1999}).

Aunque se ha encontrado que E. coli O157:H7 puede internarse en diversas plantas, algunas veces la bacteria no tienen éxito al tratar de ingresar. Las propiedades químicas del hospedante, tales como la acidez y el contenido de aceite, azúcares y agua, son condicionantes para la colonización y la sobrevivencia de los microorganismos. Sin embargo, la acidez de algunas frutas y hortalizas frescas, no necesariamente afecta la sobrevivencia de las bacterias patógenas. También existen factores como el tipo de cepa o serotipo bacteriano, la ruta de contaminación, condiciones climáticas, el tipo de superficie y la edad de la planta, que en conjunto influyen en la probabilidad de internalización de los patógenos en la planta.

Adaptación a un nuevo entorno

Se ha descrito que los genes de especies Archaea están presentes en el genoma de E. coli O157:H7 cepa EDL933 (^{Faguy, 2003}), los cuales pueden conferir a la bacteria gran variedad de capacidades de adaptación a nuevos ambientes. Los genes nucleares como son los genes metabólicos pueden ser transferidos y mejorar la condición de la cepa bajo ciertas condiciones ambientales. Por ejemplo, pocas cepas de E. coli tiene la capacidad de fermentar glucosa, y la adquisición de estos genes puede mejorar la adaptación a nuevos ambiente (^{van-Overbeek et al., 2014}).

Un estudio realizado por ^{Szmolka y Nagy (2013)} sugiere que los patógenos de humanos pueden adquirir genes de otras especies bacterianas asociadas a plantas. Esta situación permite a nuevos fenotipos incrementar su persistencia en plantas y amplía el espectro de utilización de nutrientes disponibles en las plantas (^{van-Overbeek et al., 2014}). La aparición de nuevas características encriptadas en el genoma bacteriano, le ayudan a mejorar su condición física cuando se encuentran en frutas y hortalizas.

Brotes

Cuando E. coli O157:H7 se establece sobre frutas u hortalizas, no pierde su capacidad de ser virulenta a humanos. Esto se demuestra por todos los incidentes de este patógeno, asociados con el consumo de frutas y hortalizas contaminadas (^{Mukhopadhyay et al., 2014}). Esta bacteria fue reconocida por primera vez como un patógeno humano en 1982, asociada con productos cárnicos. Pero, en los siguientes diez años, ocurrieron casos asociados a una gran variedad de productos comestibles (^{Rangel et al., 2005}).

Los brotes causadas por E. coli O157:H7 son más comunes en el hemisferio occidental, pero sin duda no se limitan a esta parte del mundo, ya que uno de los casos más notables se produjo en Asia en 1996 (^{Michino et al., 1999}). Este brote fue provocado por el consumo de rábano blanco en la ciudad de Sakai, Osaka, Japón, donde se vieron afectados más de 6000 niños en edad escolar (^{Watanabe et al., 1996}). Aproximadamente 1000 de ellos fueron hospitalizados con síntomas gastrointestinales graves, y alrededor de 100 presentaron complicaciones de HUS (síndrome urémico hemolítico), lo que lamentablemente resultó en tres muertes.

Muchos brotes epidemiológicos se han registrado en Estados Unidos, Canadá e Inglaterra. En Estados Unidos son las frutas y hortalizas frescas el principal vehículo asociado a E. coli O157:H7, y representan el 34 % de todos los brotes de origen alimentario (^{Rangel et al., 2005}).

Un brote multiestatal asociado a espinaca se produjo en el 2006. Este, afectó a personas de 26 estados de Estados Unidos con 183 casos confirmados y tres muertes (^{Center for Disease Control and Prevention, 2006}). El mismo año, estudios epidemiológicos detectaron EHEC en espinacas (^{Center for Disease Control and Prevention, 2006}).

Recientemente el ^{Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en Estados Unidos (2014)} reportó un brote de E. coli STEC O157:H7 en 33 personas de cuatro estados, y asociado con el consumo de ensaladas "listas para consumo" (RTE). En los últimos 25 años muchos brotes se han ligado a la presencia de este patógeno en la superficie o internalizado en hortalizas y frutas. Por lo anterior, es importante preguntarse si esta bacteria patógena de siempre ha tenido la capacidad intrínseca para extender su vida en el medioambiente (suelo, agua, planta) sin perder su patogenicidad hacia el humano, o si esta capacidad ha sido desarrollada recientemente?

Fuentes de contaminación

Muchos trabajos de investigación identifican al abono a base de estiércol como la principal fuente de contaminación en el campo, seguido por agua de riego no tratada (^{Aruscavage et al., 2006}; ^{Castro-Ibáñez et al., 2015}; ^{Ceuppens et al., 2015}; ^{de Quadros et al., 2014}; ^{Erickson et al., 2010}; ^{Oliveira et al., 2012}). El estiércol utilizado como abono orgánico puede aumentar significativamente los niveles de coliformes totales, así como de E. coli (^{de Quadros et al., 2014}; ^{Machado et al., 2006}). También ^{Oliveira et al. (2012)} reportaron que patógenos como E. coli (VTEC) O157:H7 y patotipos de E. coli diarreogénicos se transmiten a través fertilizantes orgánicos y agua.

Por otra parte, muchos estudios han encontrado que las moscas (^{Talley et al., 2009}), artrópodos, aves, mamíferos silvestres y reptiles (^{Wright et al., 2013}) son otras fuentes importantes de transmisión de patógenos. Se ha demostrado que si las hortalizas se cultivan cerca de ganado, estos vectores pueden acarrear la contaminación fecal a las plantas (^{Doyle y Erickson, 2012}; ^{Fletcher et al., 2013}; ^{Wasala et al., 2013}). Además, las moscas pueden recoger E. coli O157:H7 del estiércol y depositarla en el filoplano de las plantas, donde puede posteriormente colonizar el tejido y multiplicarse (^{Talley et al., 2009}). A pesar de estos resultados, la diseminación de la bacteria por medio de las moscas requiere más investigación, debido a que otros autores reportan que E. coli O157:H7 solo puede sobrevivir de dos a cuatro días en la superficie de una hoja (^{Wasala et al., 2013}). Otros estudios reportan que este patógeno puede sobrevivir en el filoplano de hojas de espinaca durante 14 días (^{Mitra et al., 2009}). Estos autores afirman que la posibilidad de colonización bacteriana en la superficie de la hoja puede aumentar con el tiempo de exposición. Mientras que ^{Wasala et al. (2013)} sugieren que la probabilidad de colonización de la hoja, por la cepa ATCC4388, no se ve incrementada al aumentar el tiempo de exposición (tejido vegetal-bacteria).

Por otra parte, se ha documentado que la sobrevivencia de E. coli O157:H7 inoculada en el suelo mostró una relación inversa con la diversidad de la comunidad microbiana ya presente. Por lo tanto, la concentración de la bacteria puede variar mucho en el tiempo en este tipo de hábitat (^{van Elsas et al., 2011}).

Muchos estudios de contaminación fecal se han realizado en todo el mundo. Por ejemplo, estudios recientes en Sudamérica han registrado la calidad microbiológica de frutas y hortalizas. En un estudio en Venezuela, las fresas, guayabas y duraznos en pre y postcosecha se encontraron aparentemente dentro de los límites permisibles de calidad sanitaria (^{Gil et al., 2011}). Mientras que en un estudio en Brasil con 36 muestras de lechuga se detectaron coliformes fecales, aunque no se detectó E. coli O157:H7 (^{de Quadros et al., 2014}).

Estudios realizados en México han demostrado que los productos vegetales están comúnmente libres de E. coli. Estos estudios incluyeron chile chipotle (^{Ávila-Quezada et al., 2009}), manzana Starkimson, manzana Golden Delicious, durazno, pimiento California, chile jalapeño, chile serrano, tomate saladette, tomates y melón (^{Ávila-Quezada et al., 2008}), y el chile habanero (^{Lugo-Jiménez et al., 2010}).

Por otra parte, ^{Rivera et al. (2009)} reportaron la presencia de coliformes fecales en perejil, lechuga y rábano en el 36.8 % de las muestras analizadas. De estas muestras, el 24 % fueron positivos para E. coli. ^{Muñoz et al. (2013)} evaluaron la contaminación fecal en repollo, lechuga y espinacas, hortalizas que habitualmente están relacionadas con los brotes de E. coli. Los autores encontraron que la col y la espinaca son las hortalizas más contaminadas, y estas a menudo exceden los límites reglamentarios para coliformes fecales.

La presencia de coliformes fecales, sin detectar a E. coli en la misma muestra, sugiere que este indicador no siempre incluye a la bacteria, o no ha sido detectada debido a su capacidad para entrar a un estado latente (^{van Elsas et al., 2011}). Definitivamente, las hortalizas que no se consumen crudas, no deberían ser parte de la ruta de transmisión de este patógeno; sin embargo, la transferencia de la mano a la boca durante la manipulación y preparación de alimentos, es una posibilidad. Generalmente se piensa que los patógenos se eliminan mediante el proceso de lavado, pero se ha demostrado que un número significativo de bacterias pueden permanecer y persistir en frutas y hortalizas después de un lavado convencional (^{Ginestrea et al., 2005}). Por lo tanto se recomienda analizar los procesos de cosecha y en general el manejo en toda la cadena de producción (^{Berger et al., 2010}).

La deficiencia más recurrente de las personas que manipulan los alimentos es la falta de un adecuado lavado de manos (^{Ávila-Quezada et al., 2009}). Por otra parte, la eficacia de muchos desinfectantes para destruir microorganismos ha sido cuestionada en los últimos años, por lo que su uso frecuente no necesariamente constituye una práctica segura.

Cuando una hortaliza está expuesta a bacterias, éstas tienden a unirse a la superficie de la hortaliza. Una adhesión firme generalmente toma un par de horas. Sólo entonces, la adhesión se vuelve lo suficientemente fuerte como para resistir el lavado convencional, haciendo que su remoción sea mucho más difícil. La situación puede agravarse si la humedad persiste, ya que esta condición permite la síntesis de polímeros y por lo tanto la formación de biopeliculas (^{Avila-Quezada et al., 2010}; ^{Flemming y Wingender, 2010}).

Esfuerzos de prevención

Como ya se ha abordado, la presencia de E. coli O157:H7 en un alimento, prácticamente garantiza un brote de enfermedad. Las acciones diseñadas para prevenir la presencia de los patógenos en las frutas y hortalizas son más deseables que las acciones diseñadas para eliminar o inactivar a los patógenos. Por lo tanto, los métodos utilizados para garantizar la seguridad alimentaria deben basarse en la adopción de las Buenas Prácticas Agrícolas (BPA), Buenas Prácticas de Manejo (BPM) y en un Análisis de Peligros y Control de Puntos Críticos (HACCP). Incluso estas prácticas pueden no eliminar totalmente la contaminación microbiológica.

A nivel mundial, la mayoría de los casos de enfermedades entéricas se atribuyen al consumo de alimentos contaminados. Las fuentes de contaminación no siempre se identifican adecuadamente, por lo que a menudo permanecen como simples suposiciones. Algunas veces presuntamente declaradas por autoridades para minimizar una alarma pública. El hecho de que ocurra un brote vinculado al consumo de frutas o productos vegetales, indica que el brote es el resultado de un evento de contaminación ocasional, y puede ser muy difícil identificar su origen si no se cuenta con los registros adecuados que apoyen su rastreabilidad.

Un gran número de tratamientos antimicrobianos se han probado para controlar E. coli O157:H7 pero, es muy difícil lograr una reducción significativa de la contaminación bacteriana en hortalizas.

Futuros trabajos de investigación

Una serie de preguntas interesantes surgen de lo antes expuesto. Estas preguntas son: ¿Cómo los efectores bacterianos son entregados al interior de las células vegetales no hospedantes? ¿Cuál es la naturaleza de la ruta de comunicación entre el microorganismo patógeno y la célula vegetal? ¿De qué manera la regulación de proteínas induce la señalización y el reconocimiento?

Trabajos futuros abordarán estas preguntas con estudios de los sistemas biológicos por medio de postgenómica. Este enfoque permitiría entender la expresión genética y proteica durante el reconocimiento y la internalización de E. coli en las hortalizas. Una mejor comprensión de la interacción de este patógeno humano con las plantas generará información científica útil para el desarrollo de estrategias eficaces para minimizar el riesgo a la salud de consumidor.