Artículos científicos

 

Aislamiento y Potencial Parasítico de un Aislamiento Nativo de Pochonia chlamydosporia en Contra de Nacobbus aberrans en Frijol

 

Isolation and Parasitic Potential of Pochonia chlamydosporia Against Nacobbus aberrans on Bean

 

Francisco Franco Navarro, Ignacio Cid del Prado Vera y María de la Luz Romero Tejeda

 

Programa de Fitopatología, Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo, km 36.5 Carr. México-Texcoco, Montecillo, Texcoco, Estado de México, CP 56230, México. Correspondencia: ffranco@colpos.mx

 

Recibido: Octubre 24, 2011
Aceptado: Abril 10, 2012

 

Resumen

Se tomaron muestras en suelos naturalmente infestados con Nacobbus aberrans dentro del municipio Pozo de Gamboa, estado de Zacatecas, México, y se obtuvo un aislamiento nativo del hongo nematófago Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia. Se realizaron pruebas para determinar su potencial como agente de control biológico del nematodo: primero su capacidad de colonización de raíces, tanto de plantas empleadas en esquemas de rotación como de diferentes variedades de frijol, y posteriormente su capacidad para parasitar huevos de N. aberrans in vitro. También se probó su efectividad como biocontrolador del nematodo bajo condiciones de invernadero. El aislamiento nativo colonizó el 100 % de raíces de las plantas probadas y de las variedades de frijol utilizadas; el parasitismo de huevos fue del 82 %. En invernadero, las plantas de frijol inoculadas con dos dosis diferentes del aislamiento nativo (7,500 y 15,000 clamidosporas g^-1 de suelo) desarrollaron mayor follaje y peso de raíces que las plantas testigo y las tratadas con carbofuran 48 % (4 L ha^-1). El agallamiento de raíces y el número de nematodos dentro de las mismas fueron menores al aplicarse el hongo. Este es el primer reporte de P. chamydosporia en el estado de Zacatecas y de su uso como potencial agente de control biológico del nematodo falso nodulador en frijol.

Palabras clave: control biológico de nematodos, hongos nematófagos, nematodo falso nodulador, Phaseolus vulgaris.

 

Abstract

Naturally infested with Nacobbus aberrans soil samples were taken at Pozo de Gamboa municipality, Zacatecas state, Mexico, and native isolates of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia were obtained. Tests to evaluate their potential as a biological control agent against this nematode were done: first, their root colonization capacity was evaluated both from plants used in rotation schemes as well as of different bean varieties, and also their ability to parasitize N. aberrans eggs in vitro was tested. Additionally, tests were done to prove their effectiveness as a nematode biocontroller under greenhouse conditions. The native isolate colonized 100 % of the roots of the plants and the bean varieties tested; egg parasitism was 82 %. Greenhouse bean plants inoculated with two different doses of the native isolate (7,500 and 15,000 chlamydospores g^-1 of soil) showed more foliage and root weight than the control plants and those treated with 48 % carbofuran (4 L ha^-1). Root galling and nematode numbers inside them were lower after fungus application. This is the first report of P. chamydosporia in Zacatecas state and its use as a potential biological control agent for false root-knot nematode in beans.

Keywords: biological control of nematodes, nematophagous fungi, false root-knot nematode, Phaseolus vulgaris.

 

El hongo Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y Gams (= Verticillium chlamydosporium) es un parásito facultativo de huevos de nematodos ampliamente distribuido. Se encuentra en suelo donde puede sobrevivir alimentándose de materia orgánica, pero también puede crecer y desarrollarse en las masas de huevos depositadas por la hembra de los nematodos agalladores. Además, este hongo tiene la capacidad de colonizar el rizoplano y la rizósfera (Bourne et al., 1994; De Leij y Kerry, 1991; Hirsch et al., 2001), ser endófito de raíz (Bordallo et al., 2002; López et al., 2002) e incluso reducir la colonización y daño por parte de hongos fitopatógenos (Monfort et al., 2005) en varios cultivos de importancia económica, ello sin causar lesiones o afectar su crecimiento. El hecho de que pueda colonizar raíces y aplicarse al suelo en forma de suspensión de clamidosporas o bien, en sustrato sólido previamente colonizado, le permite al hongo multiplicarse cerca de las hembras en desarrollo, invadir la masa de huevos e infectar estos últimos reduciendo eventualmente las poblaciones de los nematodos (Bourne et al., 1996; De Leij y Kerry, 1991; Vianene y Abawi, 2000) y en consecuencia el impacto negativo de éstos en sus plantas hospedantes. Por tal motivo, P. chlamydosporia ha sido reconocido a nivel mundial como un potencial agente de control biológico de nematodos formadores de quistes (Kerry et al., 1984), nematodos agalladores (Atkins et al., 2003b; De Leij et al., 1993; Ebadia et al., 2009; Hidalgo et al., 2000; Kerry e Hidalgo, 2004; Sorribas et al., 2003), e incluso de Rotylenchulus reniformis (Wang et al., 2005). Este hongo ha sido aislado en México, principalmente en zonas donde se cultiva jitomate y algunas áreas naturales del trópico mexicano (Flores et al., 2008; Franco et al., 2009), y ha probado ser un potencial agente de control biológico del nematodo falso nodulador Nacobbus aberrans (Thorne) Thorne y Allen, en jitomate y chile (Flores et al., 2008; Franco et al., 2009; Pérez et al., 2007, 2011).

Nacobbus aberrans sensu Sher es una de las especies de nematodos fitopatógenos de mayor importancia en México, debido al daño y las pérdidas que ocasiona en varias plantas cultivadas como chile (Capsicum annum L.), jitomate (Solanum lycopersicum L.) y frijol (Phaseolus vulgaris L.) (Cristóbal et al., 2001a). En el caso del frijol, alimento fundamental en la dieta de la población mexicana, se ha estimado que las pérdidas debidas al nematodo pueden alcanzar un 36 % del valor de la producción, principalmente en variedades como Negro Puebla y Canario (Manzanilla et al., 2002). Las estrategias de control del nematodo, incluida la aplicación de nematicidas, no han sido satisfactorias; además, el uso de nematicidas tiene un costo elevado, no sólo desde el punto de vista económico sino también por sus efectos nocivos tanto al ambiente como a la salud humana (Pérez et al., 2007).

Considerando la importancia que el nematodo falso nodulador tiene en varias zonas productoras de frijol del estado de Zacatecas, la actual tendencia en la búsqueda de alternativas sustentables para el control de nematodos fitoparásitos, y que el control biológico con organismos antagonistas no se ha probado en el patosistema N. aberrans-frijol, se plantearon los siguientes objetivos: 1) obtener aislamientos nativos de P. chlamydosporia en varias localidades del estado de Zacatecas donde N. aberrans está presente en frijol, y 2) probar el potencial como agente de control biológico del aislamiento obtenido sobre el nematodo falso nodulador y así contribuir en la búsqueda de alternativas para el control eficaz y sustentable de este nematodo.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta de muestras. En Zacatecas, los sitios de muestreo se seleccionaron con base en los antecedentes de la presencia e impacto de N. aberrans en la zona y en la observación de síntomas tanto aéreos como subterráneos ocasionados por el nematodo en plantas de frijol. La colecta de muestras se llevó a cabo en el verano de 2009 en tres predios del Municipio de Pánuco, Zacatecas; uno ubicado en Pozo de Gamboa (22.95 ° Lat N, 102.57 ° Long O; 2250 msnm) y los otros dos aproximadamente a 9 km de éste, ambos (India 1 e India 2) localizados en La India (22.99 ° lat N, 102.55 ° long O; 2180 msnm).

En cada predio se tomaron 30 muestras de suelo y de raíces. El suelo se colectó en la periferia de las raíces, tomando muestras de 200 g de suelo entre los 15 y 25 cm de profundidad. En cuanto a las raíces, se tomaron aproximadamente 60 g en cada punto donde se colectó suelo y se revisó que éstas estuvieran agalladas (más del 80 % del sistema de raíces). Cada muestra se colocó por separado en bolsas de plástico etiquetadas y se conservaron frescas hasta su traslado al laboratorio para su procesamiento.

Aislamiento del hongo. Con el fin de obtener uno o más aislamientos nativos de los predios muestreados, se procesaron por separado suelo, raíces agalladas y también masas de huevos del nematodo siguiendo los protocolos descritos por Kerry (1997) y utilizando medio selectivo a base de Papa-Agar con antibióticos (PAA) (Hidalgo et al., 2000). Para la detección a partir de suelo y de raíces agalladas de cada localidad, se procesaron 10 muestras de 1 g, de las cuales se hicieron dos diluciones (10^-1 y 10^-2) y 200 µL de cada una se colocaron en medio selectivo; en el caso de las raíces, cada gramo de raíz se maceró previamente antes de preparar la dilución. Una vez sembradas las cajas, éstas se incubaron a 27 °C durante tres semanas (Franco et al., 2009; Hidalgo et al., 2000; Pérez et al., 2007). La detección del hongo a partir de masas de huevos se llevó a cabo tomando masas extraídas de raíces agalladas y desinfestadas con una solución de hipoclorito de sodio 2.0 % por 30 s; posteriormente, las masas se enjuagaron con tres lavados de agua destilada esterilizada durante 1 min cada uno y se colocaron 20 masas por cada placa Petri con PAA. Las placas se incubaron durante 4 d a 27 °C para luego revisar el crecimiento o no del hongo a partir de los huevos.

Una vez que se detectaron colonias que por su crecimiento en medio selectivo se identificaron como Pochonia, y con base en experiencias previas, éstas se transfirieron sobre PAA y se incubaron durante 10 d a 27 °C para observar el crecimiento característico de la colonia (Hidalgo et al., 2000). Las cajas se revisaron directamente en un microscopio compuesto a 400 aumentos para corroborar la producción de conidios y dictioclamidosporas que caracterizan al género y a la especie. El hongo se identificó morfológicamente de acuerdo a las descripciones de Gams y Zare (2001), Kerry (1997) y Zare et al. (2001). Posteriormente, se transfirió a placas de PAA con el fin de contar con suficiente material para las siguientes pruebas. Algunas placas de 21 d de edad del aislamiento identificado previamente, se utilizaron para preservarlo en tubos con medio PAA y aceite mineral, así como en ultracongelación a -80 °C en glicerol 25 % esterilizado como medio de almacenaje.

Evaluación del potencial parasítico. Para evaluar el potencial del aislamiento de P. chlamydosporia obtenido a partir de suelo, como agente de control biológico, se realizaron tres pruebas para tal fin: la colonización de raíces, el parasitismo de huevos del nematodo en condiciones in vitro, y su efectividad como agente de control biológico en condiciones de invernadero (De Leij y Kerry, 1991; Hidalgo et al., 2000); estas pruebas han sido aplicadas en estudios previos con aislamientos mexicanos (Flores et al., 2008; Franco et al., 2009; Pérez et al., 2007).

Pruebas de colonización de raíces. Los cultivos probados, empleados en algunos casos como parte de los ciclos de rotación en el estado de Zacatecas, se agruparon con base en su grado de susceptibilidad a N. aberrans en hospedantes (jitomate y chile), hospedantes pobres (calabaza y tomate de cáscara), y no hospedantes (maíz, col y brócoli) (datos no publicados). También se probaron variedades de frijol mejoradas con diferente grado de susceptibilidad al nematodo: Bayo INIFAP y Flor de Mayo criollo (susceptibles), Flor de Mayo M-38 (tolerante) y Bayo Mecentral (resistente) (Hernández, 2001).

Con el fin de evaluar la capacidad del aislamiento obtenido para colonizar las raíces de las plantas antes mencionadas, se siguió la metodología de Franco et al. (2009). Las semillas de dichas plantas se sumergieron en agua destilada estéril durante 10 min y luego 1 min en una solución de hipoclorito de sodio 8 % en agitación constante; finalmente, las semillas se enjuagaron con agua destilada estéril durante 1 min y hasta eliminar el exceso de hipoclorito de sodio. Las semillas se distribuyeron sobre papel absorbente contenido en una caja de Petri esterilizada, se humedecieron con agua destilada estéril y se incubaron a 27 °C durante ocho días para el caso de semillas grandes (maíz, frijol y calabaza) y doce días para semillas pequeñas (jitomate, chile, tomate de cáscara, col y brócoli). A la par de la germinación de las semillas, se llenaron tubos de ensaye (20 x 3 cm), con 70 g de vermiculita humedecida y estéril. Los tubos se dejaron enfriar y en cada uno de ellos, por debajo de la superficie, se colocaron tres círculos de medio PAA de 1 cm de diámetro con el aislamiento de P. chlamydosporia (IZ1) de aproximadamente 20 d de edad; los círculos se tomaron de la zona más externa de la colonia (zona de crecimiento). Otro lote igual de tubos se sembró con el aislamiento mexicano de P. chlamydosporia var. chlamydosporia SC1, el cual sirvió como referencia para esta prueba. Dicho aislamiento está depositado en la colección de Pochonia chlamydosporia del Programa de Fitopatología, Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo (Estado de México, México) y cuya capacidad colonizadora de raíces, parasitismo de huevos de N. aberrans y efectividad biológica han sido probados en ensayos tanto en invernadero como en campo (Flores et al., 2007; Pérez et al., 2007; Pérez et al., 2011).

En cada tubo se colocaron dos semillas germinadas de maíz, frijol y calabaza, o tres para semillas pequeñas (jitomate, chile, tomate de cáscara, col y brócoli). Para cada cultivo, y aislado fúngico, se tuvieron tres réplicas. Todos los tubos se incubaron a 25 °C durante una semana (maíz, frijol y calabaza) y hasta dos semanas para el resto de las plantas, ello en función del tiempo que tardaron en germinar y desarrollarse. Luego del período de incubación en condiciones estériles, se sacaron las plantas de cada tubo, se les removió el exceso de vermiculita, se cortaron las raíces en segmentos de 1 cm (maíz, frijol y calabaza) o 0.5 cm (jitomate, chile, tomate de cáscara, col y brócoli), se mezclaron (para considerar por igual partes proximales y distales de la raíces), y se sembraron en cajas de Petri con PAA para luego incubarlas durante siete días a 27 °C. Por cada tubo o repetición, se sembraron tres cajas de Petri con 10 segmentos de raíz. Transcurridos los siete días de incubación, las cajas se revisaron directamente en un microscopio compuesto a 400 aumentos para corroborar la colonización por parte de los aislamientos probados. Además, se cuantificó el número de segmentos colonizados y se calculó así el porcentaje de colonización (Franco et al., 2009; Hidalgo et al., 2000).

Parasitismo de huevos de N. aberrans. Para llevar a cabo esta prueba, se emplearon nuevamente los dos aislamientos de P. chlamydosporia var. chlamydosporia antes referidos (IZ1 y SC1) y se siguió la metodología propuesta por Hidalgo et al. (2000). Ambos aislamientos se mantuvieron durante 21 d en medio PAA, tiempo después del cual se les colocaron 5 mL de agua destilada estéril, se raspó la superficie con una varilla de vidrio y se obtuvo una suspensión de material fúngico (conidios y fragmentos miceliales). En cada caso, se tomaron alícuotas de 0.2 mL de la suspensión y se dispersaron uniformemente sobre placas de Petri con Agua-Agar y antibióticos (AAA) para luego incubarlas a 25 °C durante dos días. Los huevos para la prueba se obtuvieron a partir de masas extraídas de plantas de frijol infectadas por una de las poblaciones de N. aberrans proveniente de Zacatecas (La "India 2"), las cuales se mantuvieron en el invernadero del Área de Nematología Agrícola del Programa de Fitopatología del Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo (temp máxima promedio = 29.6 °C; temp mínima promedio = 6.1 °C; humedad relativa promedio = 20.5 %). Las masas de huevos colectadas se disgregaron utilizando jeringas de insulina para liberar los huevos de la masa gelatinosa. Una alícuota de 1 mL (aproximadamente 300 huevos) se colocó en cada una de las cajas previamente sembradas con los respectivos aislamientos y se incubaron a 25 °C por cuatro días. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se estimó el porcentaje de parasitismo de huevos mediante el conteo al azar de 100 huevos en un microscopio compuesto a 400 aumentos. La prueba consistió de cinco réplicas por cada aislamiento más huevos. Además, se incluyó un control negativo que consistió de cinco cajas con huevos pero sin hongo.

Prueba de efectividad sobre N. aberrans en condiciones de invernadero. Los seis tratamientos que se aplicaron en esta fase se presentan en el Cuadro 1. El diseño experimental fue completamente al azar, con cuatro repeticiones. Con el fin de establecer el ensayo en condiciones lo más parecidas a lo que sucedería en campo, éste se llevó cabo en macetas de 5 kg de capacidad que contenían suelo proveniente de uno de los predios previamente muestreados y naturalmente infestados con N. aberrans sensu Sher, ubicado en la localidad de Pozo de Gamboa, Zacatecas; cabe mencionar que en dicha localidad no se detectó a P. chlamydosporia y el nivel de inóculo del nematodo era elevado (62 individuos vermiformes, 21 hembras maduras y 14 agallas g^-1 de raíz en promedio). El suelo se homogeneizó y en cada maceta se vaciaron 4.5 kg para luego sembrar cuatro semillas de frijol var. Flor de Mayo criollo previamente desinfectadas; esta variedad es susceptible al nematodo y se utilizó con el fin de incrementar su nivel de inóculo en suelo antes de iniciar el ensayo en invernadero. Las plantas se mantuvieron 40 d posteriores a la siembra (temp máxima promedio = 30.8 °C; temp mínima promedio = 7.1 °C; humedad relativa promedio = 21.6 %) y de cada maceta se extrajeron dos plantas con el fin de corroborar la presencia del nematodo y conocer indirectamente el nivel de inóculo en cada una de ellas (a través del conteo de agallas). Una vez contadas las agallas de todas las raíces muestreadas (5-8 agallas g^-1 de raíz), éstas se incorporaron nuevamente a su respectivo suelo. Como parte propiamente del ensayo, en cada una de los macetas se sembraron nuevamente cuatro semillas de frijol var. Flor de Mayo criollo.

El nematicida (carbofuran 48 % a dosis de 4 L ha^-1) se aplicó en dos ocasiones a la misma dosis, pero para hacer más eficientes ambas aplicaciones y saber la fecha de la primera aplicación, se hicieron muestreos destructivos de plantas de frijol mantenidas a la par de las del experimento; dichos muestreos se realizaron cada tercer día luego de la aparición de las primeras hojas verdaderas. Este monitoreo del nematodo se realizó debido al conocimiento que ya se tiene de la capacidad de sobreviviencia de los estadios biológicos del nematodo (Cristóbal et al., 2001b) y con el fin de saber el momento idóneo para la aplicación del nematicida. Una vez detectados los nematodos por métodos convencionales (en suelo), se estableció la fecha de la primera aplicación del nematicida (10 d posteriores a la aparición de las primeras hojas verdaderas), y la segunda dos semanas después (Pérez et al., 2011).

Ambos aislamientos utilizados se propagaron masivamente sobre maíz quebrado (Pérez et al., 2007) y se aplicaron en los tratamientos correspondientes en dos dosis (Cuadro 1). Antes de la aplicación de los aislamientos, se realizaron pruebas de calidad al maíz quebrado colonizado que se utilizó como sustrato de propagación del hongo. Las pruebas fueron: número de clamidosporas y unidades formadoras de colonias (UFC) g^-1 de maíz colonizado, así como el porcentaje de germinación de clamidosporas; para éstas se siguieron los protocolos descritos por Hidalgo et al. (2000) y Kerry (1997). El número de clamidosporas g^-1 de maíz colonizado para el aislamiento SC1 fue de 5.0 x 10⁶, en tanto que para el aislamiento IZ1 fue de 5.4 x 10⁶. El total de UFC g^-1 de maíz colonizado del aislamiento SC1 fue de 6.76 x 10⁶ y el del aislamiento IZ1 fue de 6.05 x 10⁶. Finalmente, el porcentaje de germinación de clamidosporas correspondientes al aislamiento SC1 fue del 80 %, mientras que para el aislamiento IZ1 fue del 76 %.

Una vez conocida la cantidad de clamidosporas g^-1 de maíz colonizado por cada aislamiento, se estimó la cantidad de sustrato colonizado a utilizar en los diferentes tratamientos. Del aislamiento SC1 se aplicaron 10 g de maíz quebrado colonizado por repetición, mientras que del aislamiento IZ1 se aplicaron 10.8 g de maíz quebrado colonizado por repetición para la dosis baja y 21.6 g por repetición para la dosis alta, equivalentes a 7500 y 15000 clamidosporas g^-1 de suelo, respectivamente (Cuadro 1) (Pérez et al., 2007 y 2011). Para aplicar el sustrato colonizado, se utilizó vermicomposta elaborada a base de estiércol de cabra como vehículo de aplicación; la dosis referencia fue de 15 t ha^-1 (52 g maceta^-1). En uno de los tratamientos sólo se aplicó vermicomposta (Cuadro 1) con el fin de establecer el efecto único del abono en las plantas de frijol sin la presencia del hongo. Todos los tratamientos, a excepción de la aplicación del nematicida, se aplicaron una semana después de la siembra, toda vez que las plantas de frijol ya habían germinado y había raíces para colonizar por parte del hongo. El sustrato colonizado y la vermicomposta se incorporaron al suelo, mientras que el nematicida se aplicó al cuello de cada planta.

Se vigiló que el suelo se mantuviera húmedo durante el transcurso del experimento y se aplicó fertilización foliar a las plantas cada 20 d durante el período vegetativo (Bayfolan® Forte a dosis de 1.5 mL L^-1 de agua). A los 60 d posteriores a la siembra del frijol (temp máxima promedio = 34.3 °C; temp mínima promedio = 8.2 °C; humedad relativa promedio: 25.8 %), en las plantas se cuantificó el peso seco del follaje mediante el secado de la parte aérea de cada planta dentro de bolsas de papel en una estufa a 40 °C por 72 h. También se cuantificó el peso fresco de las raíces y se calculó el índice de agallamiento, que se obtuvo mediante el cociente del número de agallas entre el peso fresco de raíces y se utilizó para tener una medida más precisa del daño del nematodo en las raíces (Perez et al., 2011). Además, se contó el número de individuos de los juveniles de tercer (J₃) y cuarto estadio (J₄), y el de hembras maduras g^-1 de raíz; para ello, se licuaron tres muestras de raíces (1 g cada una) (Ayoub, 1977) y se revisaron otras tres muestras de 1 g teñidas previamente con fucsina ácida (Byrd et al., 1983), respectivamente. Del hongo se cuantificaron las UFC tanto en raíces como en suelo al final del experimento con el fin de corroborar su presencia y así asociar los efectos observados (Kerry, 1997; Perez et al., 2007, 2011).

Análisis estadístico. Los datos obtenidos de las variables medidas se sometieron a un análisis de varianza y cuando en éste se detectaron diferencias significativas entre tratamientos, se realizó la comparación de medias con la prueba de Tukey (P < 0.05). Para tal fin se utilizó el programa Statistical Analysis System® para Windows V8.

 

RESULTADOS

Búsqueda de aislamientos nativos. De las muestras de suelo y raíces colectadas en Zacatecas, así como de las masas de huevos de N. aberrans se obtuvo sólo un aislamiento a partir de suelo, mismo que correspondió a la localidad La India 2 (23 °00'9'' lat N, 102 °30'7" long O), etiquetado como IZ1 para indicar la localidad y el estado de procedencia, así como el hecho de haber sido el primer aislamiento obtenido en la zona. Este aislamiento forma parte de la colección de Pochonia chlamydosporia del Programa de Fitopatología, Colegio de Postgraduados-Campus Montecillo.

En placas de PAA, el aislado presentó una colonia con apariencia algodonosa y bordes redondeados, de color blanco que con el tiempo se tornó color crema debido a la producción de clamidosporas. IZ1 se identificó morfológicamente como P. chlamydosporia var. chlamydosporia de acuerdo a las claves de Gams y Zare (2001), y Zare et al. (2001). El aislado presentó conidióforos por lo general postrados y poco diferenciados del micelio, fiálides solitarias, o de 2 a 3 por nódulo en verticilo. Los conidióforos portan conidios unicelulares hialinos o de color brillante, de forma subglobosa a elipsoidal; éstos mostraron estar adheridos y agrupados en cabezuelas recubiertas de una sustancia adhesiva. Además, se observaron dictioclamidosporas o estructuras de resistencia en el micelio aéreo.

Evaluación del potencial parasítico. Pruebas de colonización de raíces. El aislamiento SC1 e IZ1 colonizaron el 100 % de los segmentos sembrados en PAA de todas las plantas probadas. Al revisar las cajas Petri bajo el microscopio, y luego de siete días de haberse hecho la siembra de los fragmentos de raíz, se observó la presencia de clamidosporas sólo en aquellas que contenían fragmentos de raíces de calabaza; en el resto de los cultivos las clamidosporas se presentaron entre el noveno y el décimo día. Respecto a la colonización de raíces de variedades de frijol, tanto el aislamiento IZ1 como SC1 colonizaron también el 100 % de los segmentos sembrados; en este caso, la presencia de clamidosporas en los segmentos de raíces de todas las variedades de frijol probadas se dio al doceavo día de incubación.

Parasitismo de huevos de N. aberrans. Los dos aislamientos de Pochonia chlamydosporia parasitaron huevos de N. aberrans. En el caso del aislamiento SC1 el porcentaje de parasitismo fue del 84 %, mientras que el aislamiento IZ1 parasitó un 82 % de los huevos del nematodo.

Prueba de efectividad sobre N. aberrans en condiciones de invernadero. Aunque no hubo diferencias significativas en el peso seco de follaje de las plantas entre los diferentes tratamientos, el aislamiento IZ1 a la concentración más alta de clamidosporas en suelo (IZ1-15000) presentó el mayor peso seco del follaje comparado con el resto de las plantas (Cuadro 2). Tampoco se detectaron diferencias significativas en el peso fresco de raíces; sin embargo, las plantas inoculadas con el aislamiento SC1 y a las que se aplicó IZ1 a dosis alta presentaron mayor peso en promedio (Cuadro 2).

En el Índice de agallamiento se detectaron diferencias altamente significativas entre tratamientos (P ≤ 0.001); dicho índice se redujo en las raíces de plantas donde se aplicó IZ1 a baja (7500) y alta concentración (15000) de clamidosporas en el suelo. La reducción fue del 81.2 y 76.8 % comparado con las plantas del testigo absoluto y las que recibieron sólo vermicomposta, respectivamente (Cuadro 2). La reducción del índice de agallamiento al aplicar el aislamiento SC1 fue ligeramente menor (38 %) que al aplicar el aislamiento IZ1 (Cuadro 2).

Hubo diferencias altamente significativas entre tratamientos (P° 0.001) en el número de J3 y J4 dentro de las raíces; las diferencias más notorias se presentaron en las raíces donde se aplicó el aislamiento Sc1, ya que en éstas el número de J3 y J4 en raíces fue en promedio menor que en el resto de los tratamientos. El número de juveniles J3-J4 en las raíces de las plantas donde se aplicó IZ1 a baja y alta concentración de clamidosporas fue en promedio 30.5 y 43.8 % menor que el cuantificado en las raíces de las plantas donde se aplicó el nematicida; de igual manera, al comparar el número de juveniles de los tratamientos en los cuales se aplicó el aislamiento zacatecano con el observado en las raíces de las plantas del testigo absoluto, la reducción en promedio fue del 48 % (IZ1-15000) y del 36 % (IZ1-7500). Cabe mencionar que al aplicar sólo vermicomposta al suelo con N. aberrans, el número de individuos tanto de J3 como de J4 fue menor en comparación con el testigo, aunque no en la magnitud que se observó cuando a la vermicomposta se le adicionó P. chlamydosporia (aislamientos SC1 e IZ1 en dosis alta).

Aunque no se presentaron diferencias significativas entre tratamientos con relación al número de hembras maduras g^-1 de raíz, en las raíces de las plantas tratadas con SC1 e IZ1 se presentó el menor número de hembras g^-1 de raíz. En estos tratamientos, la reducción en el número de hembras osciló entre 68.4 y 70 % respecto a las plantas del testigo absoluto, y entre el 74 y 75.4 % comparado con las plantas a las que se les aplicó nematicida (Cuadro 2).

En las plantas a las que se les aplicó SC1, fue posible detectar la presencia del hongo, situación similar a la observada en las plantas donde se aplicó IZ1 a ambas concentraciones. Pochonia chlamydosporia se observó creciendo sólo en las cajas donde se procesaron raíces de plantas inoculadas. El mayor número de UFC en raíces correspondió al tratamiento IZ1-15000 (Cuadro 2). En cuanto al número de UFC en suelo, el hongo sólo se detectó en los tratamientos donde éste se inoculó. El mayor número de UFC en suelo correspondió a los tratamientos con SC1 e IZ1 a alta concentración (15,000 clamidosporas g^-1 de suelo) (Cuadro 2).

 

DISCUSIÓN

El aislamiento de Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia obtenido a partir de los muestreos de suelo, raíces agalladas y masas de huevos asociadas representa el primer registro de la presencia de dicho hongo nematófago en suelos del estado de Zacatecas, sumándose así a los reportados en otras regiones del país (Flores et al., 2008; Franco et al., 2009).

Pochonia chlamydosporia, como un agente potencial de control biológico de nematodos fitopatógenos de importancia agrícola, debe cumplir con una serie de requisitos los cuales permiten seleccionar y discriminar entre aislamientos poco efectivos y aquellos que potencialmente pueden explotarse a gran escala y de manera comercial. De acuerdo con Kerry (1997), los aislamientos de P. chlamydosporia con potencial para utilizarse como agentes de control biológico deben registrar porcentajes de 80 % o más en ambas pruebas de laboratorio (parasitismo de huevos y colonización de raíces), para posteriormente proceder a su evaluación en invernadero y campo.

Como se ha establecido con anterioridad, P. chlamydosporia, una vez presente en suelo, no sólo se alimenta de huevos de nematodos sino que es capaz de alimentarse de materia orgánica y colonizar la rizosfera de varias plantas cultivadas; de hecho, este fenómeno de colonización se ha estudiado con detalle y se ha encontrado evidencia respecto a que el hongo es capaz de colonizar las raíces incluso endofíticamente (Bordallo et al., 2002; Maciá et al., 2009 a y b).

Este hongo parasita las etapas activas de los nematodos, principalmente huevos y en contadas ocasiones hembras sésiles (Hidalgo et al., 2000; Kerry, 1997); por tal motivo, la colonización de raíces es un evento fundamental para potenciar el contacto con los huevos contenidos en las masas gelatinosas que se encuentran sobre la superficie de las raíces (Kerry y Bourne, 1996). Esta es la principal razón del por qué la colonización de raíces es básica en el proceso de selección y evaluación de aislamientos de este hongo para el control de Meloidogyne (De Leij y Kerry, 1991; Hidalgo et al., 2000; Sorribas et al., 2003) y del nematodo falso nodulador (Flores et al., 2008; Franco et al., 2009; Pérez et al., 2007). Además, la colonización de las raíces cobra aún mayor importancia al encontrarse evidencias de que dicha interacción puede ser endofítica (Bordallo et al., 2002). Esta interacción, de acuerdo con Maciá et al. (2009a y b), puede ser benéfica para las plantas colonizadas, ya que no sólo promueve su crecimiento, sino que además las protege contra el ataque de hongos fitopatógenos.

Conocer la capacidad de colonización en plantas con diferente grado de susceptibilidad al nematodo, también permite utilizar a P. chlamydosporia en conjunto con esquemas de rotación para así inducir su desarrollo y mantener su presencia en suelo una vez aplicado, ello sin necesidad de recurrir a numerosas y constantes aplicaciones del mismo, experiencia que ha resultado exitosa en el manejo de nematodos agalladores bajo condiciones específicas de manejo (Atkins et al., 2003b; Kerry e Hidalgo, 2004).

En el presente estudio, los resultados de las pruebas de colonización permitieron avanzar en el conocimiento sobre el potencial del nuevo aislamiento proveniente del estado de Zacatecas, además de que por primera vez se probaron plantas que pueden ser utilizadas en esquemas de rotación e incluso variedades del hospedante de interés (en este caso frijol) con diferente grado de susceptibilidad al nematodo. Esto marca una diferencia con relación a estudios previos en los cuales las pruebas se dirigieron sólo hacia plantas altamente susceptibles a N. aberrans (Flores et al., 2008; Pérez et al., 2007). El conocimiento obtenido permitirá saber con cuáles de las plantas probadas, y que pueden ser empleadas como parte de ciclos de rotación en el estado de Zacatecas, se puede estimular la presencia y mantenimiento del hongo en la rizosfera y en el suelo mismo, bajo un esquema de biomanejo del nematodo en el cual se incorpore la rotación de cultivos o la siembra de variedades resistentes. En este esquema también es importante el papel que juega la misma materia orgánica que se incorpora como vehículo de aplicación del hongo. En el presente estudio la fuente de materia orgánica fue la vermicomposta, de la cual se han documentado sus propiedades como: fuente de nutrientes de liberación lenta, promotora en la producción de compuestos fenólicos (incremento de la resistencia a la herbivoría), potenciadora de la diversidad microbiana del suelo y bioplaguicida (Domínguez et al., 2010). Aunque en el presente trabajo no se observó un efecto evidente de la sola aplicación de vermicomposta como ha sido documentado por Villa et al. (2008) contra el mismo N. aberrans y por Castro et al. (2011) contra M. incognita, los resultados observados en cuanto al número de nematodos dentro de las raíces (J3, J4 y hembras maduras) fueron porcentualmente menores en comparación con la aplicación del nematicida y el testigo absoluto; las reducciones fueron claras y en algunos casos significativas, cuando la vermicomposta se utilizó como el vehículo de aplicación del hongo.

Si bien es cierto que la capacidad de colonización de raíces es un buen referente para valorar el potencial de un aislamiento de P. chlamydosporia, cuando a ésta se le suma el análisis de la capacidad para parasitar huevos de nematodos, es posible discriminar y seleccionar los aislamientos más eficaces. En estudios previos (Flores et al., 2007; Flores et al., 2008; Franco et al., 2009; Hidalgo et al., 2000; Pérez et al., 2007) se observó que aquellos aislamientos con los más altos porcentajes de parasitismo, independientemente de su capacidad colonizadora, mostraron los mejores resultados en invernadero al reducir el agallamiento en raíces de jitomate por N. aberrans. En el presente estudio la prueba de parasitismo con SC1 e IZ1 arrojó un porcentaje arriba del 80 %o para ambos, con lo cual se consideran agentes potenciales para el control biológico del nematodo falso nodulador; tales porcentajes fueron mayores a los mostrados por otros aislamientos de P. chlamydosporia con Meloidogyne (De Leij y Kerry, 1991; Hidalgo et al., 2000) y muy similares al parasitismo ejercido sobre huevos de N. aberrans (Flores et al., 2008; Pérez et al., 2007; Pérez et al., 2011). En el caso del aislamiento SC1, el parasitismo observado es relevante por el hecho de que este aislamiento ya ha sido probado con poblaciones del nematodo provenientes de Puebla (Pérez et al., 2007) y del Estado de México (Pérez et al., 2011), pero no con una población de Zacatecas asociada a frijol. De esto se desprende que dicho aislamiento también pudiera ser probado en algún momento en el patosistema N. aberrans-frijol.

También, aunque no significativo, en los tratamientos con IZ1 y SC1 las plantas de frijol presentaron mayor biomasa. Se requiere repetir estos experimentos en el futuro para revaluar este efecto. El aislamiento de Zacatecas se mantuvo presente a lo largo del experimento, y pudo ser re-aislado del suelo y raíces de todos los tratamientos donde se aplicó; esto coincide con lo obtenido en estudios previos bajo condiciones de invernadero tanto con Meloidogyne (De Leij y Kerry, 1991; Verdejo et al., 2003) como con N. aberrans (Pérez et al., 2007; Pérez et al., 2011).

En trabajos realizados para el control de N. aberrans en jitomate (Pérez et al., 2007) y chile (Pérez et al., 2011), también se obtuvieron resultados promisorios en cuanto al uso, como agente de control biológico, del aislamiento de P. chlamydosporia utilizado como referencia (SC1). En ambos estudios, la aplicación de P. c. var. chlamydosporia a dosis alta (15,000 clamidosporas g^-1 de suelo) en plantas de chile y jitomate en invernadero, redujo sensiblemente tanto el número de juveniles y hembras maduras, como su efecto dañino sobre las plantas. Aunque con otro patosistema, De Leij et al. (1993) registraron la reducción del 50 % de juveniles infectivos de Meloidogyne incognita en raíces de jitomate al aplicar P. chlamydosporia; por su parte Mousa et al. (1995) lograron reducir hasta un 80 % el número de hembras de Meloidogyne javanica y 50 % el número de agallas en jitomate al aplicar este hongo dos semanas antes del transplante. Vianene y Abawi (2000) también han documentado efectos negativos de P. chlamydosporia sobre huevos e incluso juveniles del segundo estadío de M. hapla en lechuga. Recientemente Ebadi et al. (2009), encontraron un aislamiento de P. chlamydosporia var. chlamydosporia capaz de parasitar el 40 % de los huevos y reducir hasta en un 56 % la población de M. incognita en pistache.

A pesar de los resultados obtenidos en este estudio y del potencial mostrado por el aislamiento de P. chlamydosporia proveniente del estado de Zacatecas, es necesario dar continuidad al trabajo e implementar y estandarizar su producción a mayor escala con el fin de probar su potencial parasítico en condiciones de campo, y así determinar su efectividad en un rango más amplio de condiciones antes de utilizarlo de manera más extensiva como agente de control biológico en el patosistema N. aberrans-frijol.

 

CONCLUSIONES

El presente estudio contribuye al conocimiento sobre P. chlamydosporia en México, primeramente por el hecho de ser el primer reporte de un aislamiento obtenido en Zacatecas y segundo, al confirmar la importancia de este hongo como una alternativa más en el control del nematodo falso nodulador en varios cultivos, entre ellos el frijol.

 

AGRADECIMIENTOS. El presente trabajo, con la consecuente titulación de uno de los autores, se llevó a cabo gracias al financiamiento del CONACYT a través de su Programa de Becas de Postgrado Nacionales. Un especial agradecimiento al Dr. Jorge A. Acosta Gallegos, Investigador del INIFAP-Campus Experimental Valle de México, por haber proporcionado las variedades de frijol utilizadas en las pruebas de colonización de raíces.

 

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