Artículos científicos

 

Rizobacterias Aisladas del Trópico Húmedo con Actividad Antagónica sobre Colletotrichum gloeosporioides, Evaluación Cuantitativa e Identificación Molecular

 

Quantitative Evaluation and Molecular Identification of Rhizobateria from Tropical Region, Antagonistic Against Colletotrichum gloeosporioides

 

Aracely Macedo Castillo, Aida Martínez Hernández y Joel Lara Reyna

 

Colegio de Postgraduados, Campus Campeche, km 17.5 Carretera Haltunchén-Edzná, Sihochac, Champotón, Camp., México. Correspondencia: jlara@colpos.mx.

 

Recibido: Junio 27, 2011
Aceptado: Diciembre 05, 2011

 

Resumen

Un total de 278 aislamientos bacterianos obtenidos de la rizósfera de cultivos tropicales fueron evaluados in vitro para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides. Sólo 31 aislamientos mostraron actividad antagónica con diferentes grados de inhibición. Ensayos cualitativos en confrontación dual, resultaron en la selección de ocho aislamientos con mayor capacidad de inhibición. Para evaluar cuantitativamente la inhibición del crecimiento de C. gloeosporioides, se estableció un método basado en estandarizar el inóculo inicial de ambos microorganismos y en digitalizar diariamente el área de crecimiento, tanto de la bacteria como la del fitopatógeno creciendo bajo condiciones de confrontación dual o sin antagonistas. El método permitió comparar la capacidad de inhibición de los ocho aislamientos contra la cepa comercial GB03 de Bacillus subtilis; considerando el área de crecimiento del hongo, el crecimiento máximo de las colonias, el tiempo en que inicia el antagonismo, la tasa promedio de crecimiento del hongo, el porcentaje de inhibición, y la zona de inhibición en cada confrontación. Los aislamientos fueron identificados molecularmente mediante secuenciación parcial del gene ribosomal ARNr 16S. Los aislamientos pertenecen a los géneros Bacillus y Burkholderia. Estos parámetros permitieron identificar cuatro aislamientos que poseen el mayor potencial para ser evaluados en campo.

Palabras clave: gene ribosomal, ARNr 16S, Bacillus, Burkholderia.

 

Abstract

A total of 278 bacterial isolates from the rhizosphere of tropical crops were evaluated for its potential to inhibit in vitro the growth of Colletotrichum gloeosporioides. From these, 31 isolates showed antagonistic activity. Dual confrontation qualitative tests for the 31 isolates resulted in the selection of eight isolates antagonist for C. gloeosporioides. To evaluate quantitatively the growth inhibition of C. gloeosporioides, we established a method by standarizing the initial inoculum of the antagonistic bacteria and the pathogen while scanning on a daily basis the growth area of both organisms either growing under confrontation or without antagonism. This method allowed the comparison of the ability of inhibition of each strain against a commercial strain by measuring the fungus growth area, the maximum growth of the colonies, the initiation of the antagonism, the average of the daily growth rate of the fungus, the percentage of inhibition, and the inhibition zone in each confrontation. All together, the method allowed an objective determination of the potential as antagonist agents of each isolate. Furthermore the eight isolates were molecularly identified by sequencing the ribosomal gene 16S rRNA, resulting in the identification of genera belonging to Bacillus and Burkholderia.

Keywords: ribosomal gene, 16S rRNA, Bacillus, Burkholderia.

 

Résumé

Un total de 278 isolats bactériens obtenus à partir de la rhizosphère de cultures tropicales a été évalué in vitro pour déterminer leur capacité à inhiber la croissance de Colletotrichum gloeosporioides. Seulement 31 isolats ont montré une activité antagoniste avec différents degrés d'inhibition. Les tests qualitatifs de confrontation duelle ont abouti à la sélection des huit isolats avec les capacités d'inhibition les plus. Pour évaluer quantitativement l'inhibition de la croissance de C. gloeosporioides a été établie une méthode basée sur la standardisation d'un inoculum initial de chacun des deux organismes et sur la numérisation quotidienne de la zone de croissance, autantdes bactéries que du phytopathogène sous des conditions de confrontation duelle. La méthode a permis de comparer la capacité d'inhibition des huit isolats contre la souche commerciale de Bacillus subtilis GB03, en considérant la zone de la croissance fongique, la croissance maximale des colonies, l'instant du début de l'antagonisme, le taux moyen de croissance du champignon, le pourcentage d'inhibition, et la zone d'inhibition dans chaque confrontation. Par séquençage partiel du gène ribosomique ARNr_16S, les isolats ont été moléculairement identifiés comme appartenant au genre Bacillus et Burkholderia. Ces paramètres ont permis d'identifier quatre isolats potentiellement plus adaptés à une expérimentation sur le terrain.

Mots-clés: gène ribosomique 16S ARNr, Bacillus, Burkholderia.

 

Las bacterias son el tipo más abundante de microorganismos del suelo, debido a que pueden crecer rápidamente y tienen la capacidad de utilizar un amplio número de fuentes de carbono o nitrógeno. La gran mayoría de las bacterias del suelo interactúan específicamente con la raíz (Lynch, 1991). Esto se debe principalmente a que muchos tipos de compuestos son exudados por la raíz en forma de secreciones (aminoácidos, azúcares, ácidos orgánicos, carbohidratos complejos, flavonoides, proteínas y mucílago), que son utilizados como nutrientes por las bacterias que colonizan la rizósfera (Chaboud, 1983; Lynch, 1991; Montesinos, 2002). Así, el ambiente de la rizósfera es ideal para la interacción de los microorganismos con la raíz dando como resultado no sólo una gran diversidad de microorganismos presentes, sino una gran competencia entre la comunidad microbiana por alcanzar un nicho en la rizósfera (de Boer et al., 2003). Muchos de aquellos microorganismos que tienen la capacidad de colonizar estos nichos, presentan propiedades que les permiten inhibir la presencia de otros microorganismos. La inhibición del crecimiento de hongos por bacterias nativas del suelo ha sido reconocida como un tipo de antagonismo, documentada y evaluada en diversos laboratorios del mundo (Kajimura et al., 1995; Araújo et al., 2002; Cornelis y Matthijs, 2002; Vandamme et al., 2007; Prapagdee et al., 2008). A pesar del beneficio ecológico derivado del uso de controladores biológicos, la utilización de bacterias como agentes de control biológico a escala comercial es mínima (comparada contra insecticidas químicos) en América latina. Los suelos del sureste mexicano, una zona ecológica tropical altamente diversa, es una zona no evaluada en la búsqueda de aislamientos bacterianos con potencial de utilización como agentes de control natural, que tengan efecto antagonista en contra de fitopatógenos responsables de enfermedades que atacan los cultivos. Desde el punto de vista geológico, la península de Yucatán es una gran roca caliza recientemente emergida del lecho marino, por lo que el material parental de los suelos es calizo en más del 60% (INECOL, 2000), siendo distinto al de la selva tropical de otras regiones del mundo. Por lo tanto, la microbiota edáfica que se desarrolla en la rizósfera de la vegetación adaptada a esos suelos podría presentar características únicas. La microbiota de los suelos calizos de la Península de Yucatán ha sido poco estudiada.

La antracnosis, es una de las enfermedades más importantes del mango (Fitzell et al., 1984; Ploetz, 1999; Nelson, 2008). En México, esta enfermedad se encuentra en todos los estados donde se cultiva mango, provocando daños durante la floración, fructificación y postcosecha (Claridades Agropecuarias, 2010). El agente etiológico, de acuerdo con la literatura, es el hongo fitopatógeno C. gloeosporioides. Sin embargo, Phoulivong et al. (2010), basado en cinco secuencias génicas, reportan un alto porcentaje en identificación errónea de cepas aisladas en Laos y Tailandia.

En el presente documento, se presenta los resultados del aislamiento, evaluación e identificación molecular de bacterias nativas de la rizósfera de plantas de uso agrícola en el estado de Campeche, las cuales mostraron actividad inhibitoria al crecimiento de C. gloeosporioides. Adicionalmente, se propone una metodología alternativa para evaluar cuantitativamente el antagonismo entre microorganismos.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal. El material vegetal se colectó en tres municipios del estado de Campeche (México) en zonas recién abiertas a la producción agrícola (Cuadro 1). Se colectaron raíces de plantas seleccionadas de forma aleatoria en cultivos de papaya Carica papaya (Cayal, Campeche); arroz Oryza sativa (Palizada, Campeche); y caña de azúcar Saccharum officinarum (Champotón, Campeche). Un total de 30 muestras de raíces de cada especie se colectaron en bolsas de papel, se transportaron al laboratorio en una hielera para mantener las muestras frescas, y se procesaron el mismo día de colecta.

Aislamiento de bacterias. Se utilizó la siguente metodología: Las raíces de las especies vegetales se lavaron superficialmente con agua destilada estéril. Se maceraron 10g de las raíces previamente cortadas en trozos pequeños, para liberar la mayor parte de bacterias adheridas a la raíz, se depositaron en tubos cónicos de plástico estériles con 15mL de agua destilada estéril con 15% de Tween®20 (Promega). La suspensión se homogenizó con un agitador mecánico vortex durante un tiempo de 10 a 30 seg. Se dejaron en reposo durante 10 min y se agitaron durante 30 seg con vortex. A partir de las suspensiones se hicieron diluciones seriales desde 1/10 hasta 1/1000 con agua destilada estéril. Posteriormente fueron sembrados 200μl de cada dilución en cajas Petri con medio sólido LB (Luria-Bertani). Las cajas se incubaron a 28°C durante toda la noche para el desarrollo de colonias bacterianas. Las colonias que presentaron diferente morfología y coloración se reaislaron en cajas Petri sembrando un máximo de 10 aislamientos por caja.

Discriminación preliminar de aislamientos con actividad antagonista. Todos los aislamientos fueron evaluados en cuanto a su capacidad para inhibir el crecimiento micelial del hongo fitopatógeno Colletotrichum gloeosporioides, mediante ensayos de confrontación y estimación cualitativa. El aislamiento identificado de C. gloeosporieoides, fue proporcionado por el Dr. Jairo Cristobal Alejo, quién lo obtuvo a partir de cultivos comerciales de mango en Hunucmá (Yucatán). Segmentos de medio LB de 1 cm² aproximadamente, con micelio de C. gloeosporioides de siete días de edad, se depositaron al centro de una caja Petri con medio PDA fresco. En cada caja inoculada con el hongo se sembraron cuatro diferentes aislamientos bacterianos en cada punto cardinal (Figura 1A). Las cajas se incubaron a 28°C durante ocho días. Se consideró como potenciales antagonistas aquéllos aislamientos que causaron algún grado de inhibición del crecimiento micelial de C. gloeosporioides, alrededor de la zona de crecimiento de las colonias bacterianas. Previamente, se verificó que no hubiera alguna ventaja en el crecimiento de los aislamientos bacterianos y fúngicos en medio LB o PDA.

Evaluación individual de aislamientos bacterianos. Los aislamientos que provocaron inhibición del crecimiento de C. gloeosporioides, fueron evaluados nuevamente confrontando cada aislamiento por separado contra el hongo fitopatógeno. El ensayo de confortación se realizó conforme a una escala cualitativa (Opelt y Berg 2004; Vandamme et al., 2007; Prapagdee et al., 2008). En esta escala, se establecieron cuatro niveles de antagonismo de acuerdo a la distancia entre el borde de la colonia del hongo, y el de la colonia bacteriana, medida en línea recta entre ambos microorganismos: +, < 5 mm; ++, 5.1 a 10 mm; +++; 10.1 a 15mm; ++++, > 15.1mm. Cada aislamiento se evaluó por triplicado en medio LB (Figura 1B). La inhibición del crecimiento se midió al día 23 en todos los experimentos, tiempo en que C. gloeosporioides tarda en cubrir la caja Petri creciendo sin confrontación (testigo sin antagonistas).

Evaluación cuantitativa del antagonismo. Cajas Petri de 9 cm de diámetro con medio PDA se inocularon en un extremo, a 1 cm de distancia del borde de la caja, con círculos de 0.785 cm² de medio PDA que contenían micelio joven de C. gloeosporioides. Los inóculos se cortaron con sacabocados a partir de la periferia de una colonia de 10 días de edad, para garantizar el mismo estado fisiológico. Por otra parte, los aislamientos bacterianos al ser evaluados, fueron crecidos en LB líquido durante toda la noche. El número de células μ^-1 de cada cultivo fue determinado midiendo la densidad óptica en un espectrofotómetro (Beckman Coulter DU 530) a 600 nm (DO_680nm), y se cuantificó el número de células sembrando una dilución para calcular las unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC mL^-1). Con este valor, se ajustó la DO_680nm para que cada cultivo bacteriano tuviera una concentración aproximada de 10⁶ células μl^-1. Se inocularon 10 μl^-1 de cada aislamiento en el extremo contrario a donde se inoculó el hongo. Las confrontaciones, realizadas por triplicado, se incubaron a 28°C. El crecimiento de ambos organismos fue documentado diariamente mediante la digitalización del área de crecimiento que cubrió cada colonia durante 23 días, tiempo previamente estimado en que el hongo cubre el diámetro total de la caja Petri cuando crece sin antagonistas (testigo) (Figura 2). La digitalización se realizó por la parte superior de la caja Petri con un escáner HP 5770®. El escáner se ajustó con la opción de captura "calidad fotográfica" del menú principal, y a la más alta resolución (1200 dpi); las imágenes se guardaron con formato "jpg". Las imágenes digitalizadas se transformaron en imágenes de alto contraste (blanco y negro) con el software Adobe Photoshope v 6.0. El cálculo del área en cm² del crecimiento diario se realizó mediante el programa de distribución libre Image Tools V 3.0 (http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html) de la siguiente manera: el programa se calibró con una imagen de tamaño conocido en mm, utilizando la herramienta "distance" del menú "analysis"; posteriormente se abrió el archivo de la imagen de alto contraste; en el menú "preferences" se seleccionó la opción "object analysis" y "área"; finalmente con la herramienta "área" se calculan automáticamente las áreas reconocidas en la imagen (solo las de alto contraste), el programa envía los datos a un hoja de cálculo. Como testigo positivo del antagonismo contra C. gloeosporioides se utilizó la cepa de Bacillus subtilis GB03 (BsGB03), ingrediente activo del biofungicida comercial KODIAK® (Brannen y Kenney, 1997). Para evaluar el grado de antagonismo de cada aislamiento bacteriano se consideraron los siguientes parámetros; midiendo o calculando cada uno de ellos de forma independiente, tanto bajo condiciones de confrontación con cada aislamiento, como con la cepa testigo BsGB03, o sin confrontación: área cubierta en cm² por C. gloeosporioides medida diariamente y al finalizar el experimento (23 días); tasa promedio de crecimiento del hongo, en cm² día^-1; porcentaje de inhibición sobre el crecimiento del hongo; zona de inhibición en cm². Las curvas de crecimiento fueron construidas en base al promedio de las áreas cubiertas por C. gloeosporioides en cada triplicado, medidas diariamente. La tasa promedio de crecimiento se calculó promediando el incremento diario en el área cubierta por el hongo, promediado entre los 23 días de duración del experimento. El porcentaje de crecimiento del hongo en confrontación con respecto a su crecimiento sin antagonistas (100%) fue calculado al finalizar el experimento (23 días). El porcentaje de crecimiento del hongo, sustraído con respecto al 100% (hongo creciendo sin antagonistas), corresponde al valor de porcentaje de inhibición. La zona de inhibición es el área intermedia entre los bordes de las colonias confrontadas, en la cual no crece ninguno de los dos organismos. Los datos de crecimiento se analizaron mediante un diseño completamente al azar con medidas repetidas donde el modelo lineal fue Y=B+T+e, donde: Y son las variables medidas (área), B es el efecto de tratamiento de antagonismo de la bacteria, T el tiempo de medición y "e" el error del efecto estudiado. La comparación se realizó mediante el método de T múltiple del paquete estadístico SAS®.

Identificación molecular mediante secuenciación del ARNr 16S. Se realizó un PCR en colonia utilizando un método comúnmente utilizado: los aislamientos crecieron durante toda la noche en 3 mL de LB líquido, en agitación a 150 rpm, a 28°C. Las células se centrifugaron durante 2 min a 12 000 rpm, lavadas dos veces con agua ultrapura estéril, y resuspendidas en 1 ml de agua ultrapura estéril. Para la reacción de amplificación se utilizó 1 μl de una dilución 1/1000 de la suspensión celular, mezcla de reacción Platinum® PCR SuperMix (conteniendo Taq DNA Polimerasa recombinante Platinum®, dNTP's y buffer de Magnesio), y los iniciadores 63f: cag gcc taa cac atg caa gtc y 1387r: ggg cgg wgt gta caa ggc diseñados contra la subunidad 16S del ARN ribosomal (ARNr 16S) (Marchesi et al., 1998), los cuales generan un fragmento de aproximadamente 1,300 pb. Los productos de amplificación se secuenciaron por ambos extremos (5' y 3') utilizando el mismo par de iniciadores. Las dos secuencias generadas a partir de cada aislamiento se alinearon entre sí utilizando el algoritmo ClustalW del programa MegAlign (DNASTAR Inc.) para identificar la zona de empalme entre ambas, y generar una sola secuencia consenso; cada secuencia consenso fue comparada mediante la herramienta BLASTN contra la base de datos de nucleótidos "nucleotide collection" (nr/nt) del GenBank® (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), para encontrar secuencias homólogas que nos indicaran la identidad de las bacterias. Alineamientos comparando los consensos contra las secuencias de algunas de las especies con las que presentó homología en el análisis de BLAST se generaron con CLUSTALW. El análisis para mostrar en árboles filogenéticos (fenogramas) los agrupamientos entre las secuencias de ARNr 16S de los aislamientos bacterianos y las secuencias de especies conocidas se generaron con el algoritmo de Neighbor-joining (Saitou y Nei, 1987), a través de las herramientas disponibles en el Kyoto University Bioinformatics Center ( http://www.genome.jp/tools/clustalw/).

 

RESULTADOS

Aislamientos bacterianos con capacidad antagónica. Un total de 278 aislamientos bacterianos fueron recuperados de la rizósfera de tres cultivos establecidos en zonas productoras del estado de Campeche: se obtuvieron 116 aislamientos de papaya, 71 aislamientos de caña de azúcar y 91 aislamientos de arroz (Cuadro 1). En la evaluación preliminar de la capacidad para inhibir el crecimiento micelial de C. gloeosporioides, sólo 31 de los 278 aislamientos inhibieron el crecimiento del hongo. Distintos aislamientos bacterianos ejercieron diferentes grados de inhibición del crecimiento del hongo (Figura 1A). En esta primera etapa de discriminación el análisis fue diseñado para evaluar una gran cantidad de aislados bacterianos, por lo que el efecto de cada aislado se registró solamente como positivo, si ejerció algún grado de inhibición sobre el crecimiento del hongo; o como negativo, si no ejerció ninguna inhibición. En los casos en los que no hubo inhibición (247 aislamientos), el hongo creció sobre la colonia bacteriana como se observa en la primer caja de la Figura 1A.

Evaluación cualitativa de antagonismo. Mediante ensayos de confrontación dual se estableció la capacidad individual de cada uno de los 31 aislamientos preseleccionados para inhibir el crecimiento de C. gloeosporioides comparando, al final del experimento, la distancia entre los bordes de las colonias en cada confrontación (Prapagdee et al., 2008). Este tipo de experimentos permite establecer diferencias métricas entre confrontaciones y comparar cualitativamente el antagonismo entre los aislamientos bacterianos. Los resultados de esta evaluación se presentan en el Cuadro 2. Ocho de los aislamientos bacterianos (Ar009, Ar038, Ar042, Ar059, Ar061, Ca039, Ca044, Pa106) mostraron una mayor capacidad para inhibir el crecimiento del hongo. Sin embargo, al evaluar las repeticiones de C. gloeosporioides creciendo en confrontación dual con un mismo aislamiento bacteriano, se observaron algunas inconsistencias ya sea en el grado de inhibición observado, o bien en el tamaño y forma de la colonia bacteriana. Como ejemplo, en la Figura 1B se muestran tres repeticiones del efecto antagonista de cuatro distintos aislamientos (Ar032, Ca044, Ar048, Ar059). Debido a que la cantidad de inóculo inicial de los microorganismos durante la confrontación no fue controlada, el tamaño de las colonias bacterianas variaron entre repeticiones; como se aprecia en el caso de las aislamientos Ca044, Ar048 y Ar059, cuyas colonias variaron claramente de tamaño en al menos una de las repeticiones. Con esta metodología no es posible determinar el grado de variación entre las colonias. En algunos casos, adicionalmente a la variación en el tamaño de la colonia, también se observaron variaciones en la distancia entre los bordes de las colonias confrontadas (Ca044); pero en otros casos, aunque el tamaño de la colonia varió, no se apreciaron diferencias cualitativas en la distancia entre los bordes (Ar059). En casos como Ar032 y Ar048 fue difícil asignar un valor para la distancia entre las colonias confrontadas ya que la forma de las colonias bacterianas es irregular y el borde del micelio es difuso. Por la inconsistencia encontrada entre las repeticiones, se realizaron ajustes a esta metodología para: controlar la cantidad de inóculo de bacterias y hongo al inicio del experimento, homogenizar el estado de desarrollo del micelio inoculado, y para obtener datos cuantitativos comparativos entre los aislamientos a evaluar.

Evaluación cuantitativa del antagonismo de los cultivos bacterianos contra C. gloeosporioides. El antagonismo de los ocho aislamientos hacia el crecimiento de C. gloeosporioides fue evaluado de forma cuantitativa a través del seguimiento diario del crecimiento de los organismos confrontados; tomando como referencia los crecimientos del hongo y de la bacteria creciendo en forma independiente (Figura 2); como se puede observar en la figura, la imagen editada en alto contraste refleja fielmente la imagen digitalizada original. El registro realizado permitió observar el día en que el crecimiento del micelio del hongo se disminuye hacia la colonia (considerando la Figura 3). A partir de ese momento la colonia del hongo comienza a "achatarse" y crece sólo hacia las zonas laterales, fuera de la influencia de la actividad antagónica de los aislados bacterianos (Figura 2A). Esto ocurrió en el día siete en el caso de Ar042, ejemplo mostrado en la Figura 2. En el caso del testigo donde el hongo crece sin antagonistas, la colonia se desarrolló continuamente hasta cubrir por completo el medio de cultivo en el día 23. La digitalización (Figura 2B) permitió convertir la zona cubierta por las colonias, tanto por la bacteria como por el hongo, a un dato preciso de área en cm², y calcular los parámetros utilizados en este trabajo para comparar la capacidad de los ocho aislamientos como antagonistas; así como hacer un análisis estadístico del fenómeno. La dinámica del crecimiento de C. gloeosporioides en presencia de los ocho aislamientos bacterianos, de la cepa testigo BsGB03, o del hongo creciendo sin antagonistas, se muestra en la Figura 3. Las curvas de crecimiento del hongo en presencia de los antagonistas bacterianos se separan claramente de la curva donde el hongo crece sin antagonistas; esto es evidente, para todos los aislamientos, a partir del día 10. En las imágenes digitalizadas se observó que la interrupción del crecimiento frontal y "achatamiento" de la colonia del hongo ocurrió entre el día siete y nueve, dependiendo del aislamiento (datos no mostrados). En la Figura 4A y el Cuadro 3 se muestra el área final alcanzada por C. gloeosporioides creciendo en confrontación dual con cada uno los ocho aislamientos bacterianos, y en los testigos. En todos los casos el área de crecimiento del hongo es significativamente menor (p<0.001) al crecer en confrontación con respecto al testigo creciendo sin antagonistas. Los aislamientos Ar061 y Ar059 son los que más efecto tuvieron sobre el crecimiento del hongo. Todos los aislamientos mostraron tener mayor efecto inhibitorio que la cepa comercial BsGB03 utilizada como testigo. El porcentaje de inhibición ejercida por cada aislamiento bacteriano sobre el crecimiento de C. gloeosporioides se muestra en el Cuadro 3. Los aislamientos bacterianos que causaron mayor porcentaje de inhibición fueron Ar061, Ar059 y Ar009; con valores de 56.7, 54.2 y 52.8% de inhibición, respectivamente. La cepa testigo BsGB03 sólo inhibió el 39.9 % del crecimiento del hongo, valor inferior al obtenido con cualquiera de los aislamientos nativos evaluados.

El cambio en la pendiente de las curvas de crecimiento del hongo confrontado con las bacterias antagonistas (Figura 3), implica un cambio en la tasa de crecimiento. La Figura 4B muestra que, en todos los casos, este valor disminuyó por efecto de las bacterias antagonistas. El análisis estadístico, mostró diferencias (p<0.001) en la tasa de crecimiento del hongo confrontado con todos los aislamientos bacterianos, con relación al testigo sin confrontación. C. gloeosporioides creció a una tasa promedio de 2.69 cm² día en ausencia de antagonistas, mientras que el crecimiento del hongo en confrontación varió entre 0.88 y 1.42 cm²día^-1. Las menores tasas promedio de crecimiento se observaron en confrontación con Ar061 y Ar059, seguidas por Ar009, Pa106, Ar042, Ca044 y la cepa testigo BsGB03. El aislamiento Ar061 fue el que más inhibió el crecimiento del hongo, disminuyendo su tasa de crecimiento a 0.88 cm²día^-1 (tres veces menor que en el testigo). En la Figura 5 se muestra una imagen, al final de la evaluación, de una repetición de los experimentos de confrontación dual de C. gloeosporioides contra cada uno de los ocho aislamientos bacterianos, y los testigos. Conforme con los análisis anteriores, se observa que el tamaño de la colonia de C. gloeosporioides es menor en cualquiera de los ensayos de confrontación que cuando crece sin antagonistas. Adicionalmente se observa que la coloración de la colonia fúngica también se alteró en respuesta a la confrontación con algunos aislamientos; y que hay gran variación en el tamaño de las diferentes colonias bacterianas, así como en el área sin crecimiento entre los bordes de ambas colonias (zona de inhibición). Los valores del área cubierta por las colonias bacterianas, y los de las zonas de inhibición, se reportan en el Cuadro 3. Ar061 y Ar059, los dos aislamientos que mostraron mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de C. gloeosporioides (Figura 4), presentaron un comportamiento invasivo, generando colonias extensas que compiten con la del hongo por el espacio disponible, así como una zona de inhibición relativamente pequeña (Figura 5). Por el contrario, las zonas de inhibición más extensas se observaron con los aislamientos Ar009, Ar038 y Ar042 (35.6, 31.6 y 33.0 cm², respectivamente). Las colonias de esos tres aislamientos bacterianos fueron las de menor tamaño, cubriendo áreas de 3.0, 3.0 y 2.2 cm², respectivamente (Cuadro 3); áreas de 10 a 14 veces menos extensas que la cubierta por Ar059. El análisis conjunto de todas las curvas de crecimiento, tanto de C. gloeosporioides como de las bacterias, confrontados o sin confrontación, no permitió identificar dos diferentes tipos de comportamiento entre los ocho aislamientos analizados. En un grupo de aislamientos, conformado por Ar009, Ar038, Ar042, Ca039, Ca044 y Pa106, los cuales desarrollan una colonia relativamente pequeña y generaron una amplia zona de inhibición (Figura 5), la pendiente de la curva de crecimiento del fitopátogeno se modificó alrededor del día siete, reduciendo su tasa de crecimiento, alcanzando la fase estacionaria de la curva prematuramente con respecto al crecimiento del hongo sin confrontación y disminuyó de forma importante el área final cubierta por el hongo. En cambio, las curvas de crecimiento de la bacteria, en presencia y en ausencia de C. gloeosporioides, indicaron que el hongo no tiene efecto, o tuvo un efecto inhibitorio mínimo (Ar038), sobre el crecimiento de las bacterias. Ejemplos de esa respuesta se muestran en la Figura 6A (cepa testigo BsGB03) y Figura 6B (Ar042). En el otro grupo de aislamientos, conformado por Ar061 y Ar059, cuya colonia creció de forma invasiva cubriendo por completo el área disponible en la caja Petri cuando se sembraron individualmente (Figura 6C), mostraron una zona de inhibición poco extensa (Figura 5), las curvas de crecimiento, tanto del fitopatógeno como de su antagonista, se modificaron al crecer en confrontación con respecto a cuándo crecieron de forma aislada; como se muestra, para el caso de Ar059 (Figura 6C). La presencia del hongo en la confrontación dual inhibe el crecimiento de Ar061 y Ar059 (Cuadro 3).

Identificación molecular de aislamientos bacterianos. Los iniciadores universales reportados previamente (Marchesi et al., 1998), amplificaron un fragmento de ARNr 16S de aproximadamente 1300 pb a partir de los ocho aislamientos seleccionados. Las secuencias consenso fueron depositadas en el GenBank con el número de acceso presentado en el Cuadro 4. Mediante el análisis BLAST se encontró que las secuencias de los diversos aislamientos presentaron una alta identidad (99%), con secuencias previamente reportadas para el género Burkholderia (Pseudomonas) o Bacillus (Cuadro 4). Para establecer con más precisión la posible identidad, a nivel de especie de las bacterias aquí caracterizadas, secuencias de diversas especies de Burkholderia o Bacillus, homólogas en un 99% a nuestras secuencias consenso, se alinearon y posteriormente se agruparon mediante un análisis filogenético generando el fenograma presentado en la Figura 7. El agrupamiento de las secuencias de ARNr 16S muestra que los aislamientos Ar061 y Ar038 quedan ubicados dentro del grupo similar a Burkholderia lata y Ar009 es más similar a Burkholderia cepacia. Los aislamientos Ar042, Ca039 y Ar059, quedan agrupados dentro del grupo de Bacillus cereus; Ca044 queda ubicado dentro del grupo similar a Bacillus subtilis; y Pa106 se asocia al grupo de Bacillus pumilus. Los cinco aislamientos bacterianos relacionados mediante el análisis molecular a especies del género Bacillus presentaron la morfología típica correspondiente a este género en cuanto al crecimiento de la colonia (Figura 5), morfología celular en estado vegetativo, y formación de esporas (datos no mostrados). Es importante mencionar que frecuentemente las colonias de los aislamientos identificados como Bacillus, debido a la motilidad de la bacteria, muestran una forma irregular emitiendo lóbulos digitiformes, como es el caso de Pa106 en la Figura 5. Se observó que en este aislamiento, la emisión de estos lóbulos se incrementó en los últimos días de la evaluación (datos no mostrados), ocasionando que los datos de área de la bacteria creciendo en confrontación se muestre como estimulada por la presencia del hongo con respecto a su tamaño creciendo de forma aislada.

 

DISCUSIÓN

Es difícil establecer la potencialidad de algún aislamiento basado únicamente en la evaluación cualitativa del área de inhibición al final de una confrontación. Tratando de incrementar la exactitud de las mediciones, algunos trabajos reportan el crecimiento radial de las colonias mediante el uso de micrómetros (Tequida et al., 2002); este tipo de medición, asume que el crecimiento radial es una variable constante en todas sus direcciones, sin embargo la colonia desarrollada casi nunca es un círculo perfecto. Ejemplos de esta situación es reportado por Ramos et al. (2010), en ambos trabajos evalúan ascomicetos en su actividad antagonista contra Phytophthtora capsici; aunque miden el radio para calcular el área, tanto de la colonia del hongo como de los ascomicetos, se demuestra el crecimiento irregular de las colonias. A diferencia de lo anterior, en nuestra evaluación, el método de digitalización y la medición de las áreas de crecimiento permitió, independientemente de la forma de la colonia, hacer comparaciones precisas entre aislamientos bacterianos mediante parámetros cuantitativos como: el tamaño de las colonias confrontadas al final de la evaluación, la tasa promedio de crecimiento, el porcentaje de inhibición, y el tamaño final de la zona de inhibición; los cuales consideramos descriptores igualmente importantes para evaluar la potencialidad de algún aislamiento. Estos parámetros nos permitieron establecer, cuantitativa y estadísticamente, que ocho aislamientos bacterianos de la rizósfera de plantas cultivadas en el trópico húmedo, inhiben el crecimiento de C. gloeosporioides in vitro, con igual o mayor capacidad que la cepa comercial BsGB03. En términos aplicados, la selección de un aislamiento para su utilización en el control de un patógeno, se basa en su capacidad para inhibir el crecimiento del patógeno. A nuestro criterio, los aislamientos con mayor potencial para ser evaluados en campo, en orden de importancia son Ar009, Ar042, Ar038 y Ca039. Todos estos aislamientos redujeron la tasa de crecimiento del hongo mostrando mayor inhibición que la cepa comercial; generaron amplias zonas de inhibición (efecto a distancia), sin requerir desarrollar una colonia muy extensa para ejercer su efecto antagonista; y adicionalmente no hay efecto fuerte de antagonismo del hongo sobre las bacterias. La utilidad de estos aislamientos como agentes de control biológico debe ser confirmada con una evaluación en campo.

Entre los mecanismos reportados por bacterias para la inhibición del crecimiento en hongos, se menciona la generación de metabolitos inhibidores liberados al medio circundante, y la inhibición por competencia (de Weger et al., 1986; Juhnke et al., 1987; Besson y Michel, 1990; Eshita et al., 1995). No fue objetivo de este trabajo identificar el mecanismo de inhibición de los aislamientos evaluados. Sin embargo, los resultados observados durante el desarrollo de C. gloeosporioides en confrontación con los aislamientos Ar009, Ca044, Ar042, Ar038, Ca039 y Pa106 sugieren que el micelio del hongo detiene su crecimiento frontal cuando alcanza la zona de inhibición generada por estos aislamientos, debido a que en dicha zona podría existir una concentración efectiva de metabolitos con la capacidad de inhibir el crecimiento del hongo, secretados por la bacteria antagonista hacia el medio de cultivo. A partir de ese punto el hongo solo puede crecer hacia las zonas laterales, donde los metabolitos inhibidores se encuentran en menor concentración, o no existen. Pa106, al detectar la presencia del hongo (por posibles metabolitos del hongo), responde emitiendo los lóbulos. Este tipo de respuesta se ha descrito para algunas especies de Bacillus (Seenesi et al., 2002; Ingham and Ben-Jacob, 2008), género al cual pertenece Pa106. La alteración observada en la coloración de las colonias fúngicas crecidas en confrontación con algunos de los aislamientos bacterianos (Figura 5), posiblemente se debe a reacciones diferenciales del hongo ante los distintos metabolitos que produce cada aislamiento. En cambio, Ar061 y Ar059, bacterias de crecimiento invasivo (Figuras 5 y 6), presentaron un posible antagonismo por competencia de nutrientes y/o de espacio, comportamiento reportado ya para otras especies (Lam et al., 2009). En estos dos casos se registró un antagonismo mutuo entre el hongo y los aislamientos, ya que el hongo también ejerció un importante efecto inhibitorio sobre el crecimiento de las bacterias, este hecho también ha sido reportado (Ansari et al., 2005). La presencia de un halo de inhibición en estas confrontaciones, aunque fue de área muy limitada, muestra que también hay un efecto de antibiosis.

El análisis molecular basado en la comparación de las secuencias bacterianas del gene ribosomal 16S (ARNr 16S) permitió una identificación precisa a nivel de género de los ocho aislamientos antagonistas aquí identificados, indicando que tres de ellos pertenecen al género Burkholderia (Ar009, Ar038 y Ar061) y cinco al género Bacillus (Ca044, Pa106, Ar042, Ar059 y Ca039). Aunque el gene ARNr 16S es altamente conservado, diferencias mínimas a lo largo de su secuencia son significativas desde el punto de vista biológico, y son suficientes para permitir clasificar los organismos en grupos específicos en base a su homología. El análisis filogenético, mostró que los aislamientos Ar061 y Ar038 son bacterias ubicadas dentro del grupo de Burkholderia lata, mientras que Ar009 es más similar a Burkholderia cepacia. Los aislamientos Ar042, Ca039 y Ar059, fueron ubicados dentro del grupo de Bacillus cereus (Maughan y Van der Auwera, 2011); Ca044 es similar al grupo de Bacillus subtilis; y Pa106 se asocia al grupo de Bacillus pumilus. Sobre el comportamiento antagonista, las especies aquí referidas del género Bacillus han sido ampliamente evaluadas no solo en su capacidad como antagonistas a fitopatógenos, sino como promotoras del crecimiento y del rendimiento en plantas (Besson y Michel, 1990; Sandrin et al., 1990; Eshita et al., 1995; Kajimura et al., 1995). De las especies B. pumilus y B. cereus hay numerosos reportes como habitantes naturales de la rizósfera de plantas y con antagonismo demostrado hacia hongos fitopatógenos (Eshita et al., 1995). La especie Burkholderia cepacia se ha reportado como habitante natural en la endorizósfera de una gran variedad de plantas y con una fuerte actividad antagónica (Whipps y Lynch, 1985; Ramette et al., 2005; Mendes et al., 2007; Vandamme et al., 2007; Jacobs et al., 2008). Actualmente estamos confirmando la identidad a nivel de especie con base en pruebas microbiológicas estándares.

La actividad antagónica in vitro de los aislamientos aquí caracterizados, obtenidos a partir de suelos de Campeche, México, pone en evidencia la riqueza del trópico húmedo como fuente de cepas nativas con potencial para ser explotadas comercialmente como controladores naturales de fitopatógenos. Estas cepas pueden ser especialmente útiles en las zonas tropicales debido a su adaptación a las condiciones geoclimáticas de esta región.

 

AGRADECIMIENTOS

Se agradece las aportaciones realizadas por el Dr. Alfredo Sánchez Villareal en la revisión de este manuscrito; al MC. Rosendo Alberto Alcaraz Moreno por su ayuda en el análisis estadístico; y al Dr. Jairo Cristobal Alejo por la donación de la cepa C. gloeosporioides utilizada en este trabajo a Fundación avanzada Campeche.

 

LITERATURA CITADA

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