Notas fitopatológicas

 

Condiciones Optimas para Inducir Germinación Errumpente y No Errumpente de Sclerotium cepivorum y Secuencias Asociadas a la Síntesis de Proteínas Durante la Germinación No Errumpente

 

Optimal Conditions to Induce Eruptive and No Eruptive Germination of Sclerotium cepivorum and Sequences Associated to Protein Synthesis during No Eruptive Germination

 

Yolanda Rodríguez Pagaza¹, Lorenzo Guevara Olvera², Reyna Isabel Rojas Martínez³, Emma Zavaleta Mejía³, June K. Simpson⁴ y Mario Rocha Sosa⁵

 

¹ Laboratorio de Fisiología y Fitopatología Molecular. Especialidad de Fitopatología, Instituto de Fitosanidad, Colegio de Postgraduados, (LFFM-EF-IF-CP), km. 36.5 Carr. México-Texcoco, Montecillo, Texcoco, edo. de Méx., CP 56230, México.

² Laboratorio de Ingeniería Bioquímica, Instituto Tecnológico de Celaya, Av. Tecnológico y Av. García Cubas S/N, Celaya, Gto., CP 38010, México.

³ LFFM-EF-IF-CP.

⁴ Departamento de Ingeniería Genética de Plantas, Centro de Investigación y Estudios Avanzados Unidad Irapuato, Instituto Politécnico Nacional, km. 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León. Irapuato, Gto., CP 3682, México.

⁵ Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, UNAM, Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Mor., CP 62250, México. Correspondencia: ypagaza@colpos.mx

 

Recibido: Noviembre 03, 2009
Aceptado: Abril 30, 2010

 

Resumen

Se generó una biblioteca sustractiva con las secuencias asociadas a la síntesis de proteínas durante la germinación no errumpente de Sclerotium cepivorum. Para generar la biblioteca sustractiva se determinaron las condiciones óptimas para obtener germinación errumpente y no errumpente de esclerocios de S. cepivorum. A 22° C, el 96.7% de los esclerocios germinaron de forma no errumpente en ausencia de disulfuro de alilo (DAS), y el 91.67% de los esclerocios germinó de forma errumpente en presencia de DAS al 2%. En la biblioteca sustractiva se obtuvieron 23 fragmentos de genes asociados a la germinación no errumpente de S. cepivorum. Estos fragmentos tuvieron similitudes significativas con 15 proteínas diferentes, las cuales participan en los procesos de respiración, transcripción, traducción, transducción de señales y síntesis de aminoácidos y proteínas. Los resultados sugieren que la germinación no errumpente es más rápida que la germinación errumpente debido a un incremento en los procesos metabólicos de los esclerocios de S. cepivorum germinados de forma no errumpente.

Palabras clave: Hibridación sustractiva, disulfuro de alilo, GenBank.

 

Abstract

A subtractive library of sequences associated to proteins synthesis in hyphal germination of Sclerotium cepivorum was generated. In order to generate the subtractive library, optimal conditions to have eruptive and hyphal germination of S. cepivorum sclerotia were determined. At 22° C, 96.7% of sclerotia germinated hyphally without allyl disulfide (DAS) and 91.67% of sclerotia germinated eruptively in presence of DAS 2%. Twenty three fragments of genes associated to hyphal germination of S. cepivorum were obtained in the subtractive library. Those fragments had significant similarity to 15 different proteins that participate in respiration, transcription, translation, signal transduction and amino acid and protein synthesis process. The results suggest that hyphal germination is faster than eruptive germination because have an increment in the metabolic processes in sclerotia of S. cepivorum germinated hyphally.

Keywords: Substractive hybridization, allyl disulfide, GenBank.

 

Estudios realizados in vitro han mostrado que los esclerocios de S. cepivorum presentan dos tipos de germinación: errumpente y no errumpente. El determinar los posibles genes que se expresan durante uno y otro tipo de germinación ayudará a dilucidar los procesos bioquímicos y fisiológicos entre los dos tipos de germinación. Por esta razón, los objetivos del presente trabajo fueron determinar las condiciones óptimas para inducir la germinación errumpente y no errumpente de S. cepivorum in vitro y determinar los posibles genes que expresan de forma diferencial en la germinación no errumpente de S. cepivorum mediante la técnica de Hibridación Sustractiva bajo condiciones de Supresión HSS (Diatchenko y Siebert, 1998). Se probaron 5 tratamientos para determinar las condiciones óptimas para la germinación errumpente y no errumpente: esclerocios germinados en presencia de agua (DAS 0%) a 17° y 22° C, esclerocios germinados en presencia de 1% de disulfuro de alilo (DAS 1%) a 17° y 22° C; y esclerocios germinados en 2% de disulfuro de alilo (DAS 2%) a 22° C. Los esclerocios se colocaron individualmente en una gota de medio PDA dentro de cajas Petri. Se valoraron aproximadamente 100 esclerocios por tratamiento de forma individual cada 24 h por 16 días para determinar la forma de germinación.

Los tratamientos que se seleccionaron como óptimos fueron esclerocios germinados en DAS 0 % a 22° C (96.7 % de germinación no errumpente) y DAS 2% a 22° C (91.67% de germinación errumpente) (Figura 1). La HSS se realizó usando el Kit PCR-Select^TM cDNA subtraction (Clontech) y se corroboró que las clonas fueran diferenciales mediante una hibridación tipo Southern. Se obtuvieron 23 clonas diferenciales que se purificaron, se secuenciaron y se compararon con proteínas en el GenBank, obteniéndose 2 clonas redundantes y 6 que no tuvieron similitudes significativas (Cuadro 1). Para obtener información sobre los procesos metabólicos en los que los fragmentos podrían estar involucrados se usó la base en línea de UniProt Consortium (2008). Se registraron 16 secuencias en el GenBank (Cuadro 1). Las secuencias YRP 63 y YRP 18 se registraron por separado debido a que difieren en sus nucleótidos.

Los 23 fragmentos de genes obtenidos tuvieron similitudes significativas con 15 proteínas diferentes las cuales participan en los procesos de transcripción, traducción, transducción de señales y metabolismo primario. Los resultados sugieren que existe un incremento en los procesos metabólicos de los esclerocios de S. cepivorum que permiten que la germinación no errumpente se lleve a cabo más rápidamente que la germinación errumpente. Lo anterior concuerda con la diferencia observada en los tiempos en que ocurrió uno y otro tipo de germinación, ya que los esclerocios con DAS 0% germinaron más rápido que los expuestos a DAS 1 y 2%, observándose cuatro esclerocios ya germinados el primer día a 22° C y uno el segundo día a 17° C. En las cajas Petri expuestas a DAS se observaron los primeros esclerocios germinados hasta los 5 (22° C, DAS 1%), 3 (22° C, DAS 2%) y 6 días (17° C, DAS 1%) después de la siembra (dds). La mayoría de los esclerocios expuestos a DAS 0% germinaron entre los 3 y 7 dds en ambas temperaturas (81 y 86 esclerocios a 22° y 17° C, respectivamente), la mayoría de los expuestos a DAS 1% y 22° C lo hicieron entre los 5 y 11 dds, y los expuestos a DAS 1 y 2% a 17° y 22° C, respectivamente, lo hicieron entre los 8 y 13 dds. Las condiciones óptimas para obtener el mayor porcentaje de esclerocios germinados de forma errupente y no errumpente fue con DAS 2% y 0% a 22° C respectivamente. Los resultados obtenidos de la HSS sugieren que existe un incremento en los procesos metabólicos de los esclerocios de S. cepivorum que permiten que la germinación no errumpente se lleve a cabo más rápidamente que la germinación errumpente.

 

LITERATURA CITADA

Diatchenko, L., A. Chenchik and P. Siebert. 1998. Suppression sustractive hybridization: A method for generating subtracted cDNA libraries starting fron poly (A+) or total RNA. Pp. 213-239. In: Siebert, P. and Larrick, J. (eds.). RT-PCR Methods for Gene Cloning and Analysis. BioTechniques Books, MA. USA. 350 p.         [ Links ]

UniProt Consortium. 2008. The Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Research 36:D190-D195 http://www.uniprot.org. (consulta, mayo de 2008).         [ Links ]