Artículos científicos

 

Alternaria tenuissima, A. alternata y Fusarium oxysporum Hongos Causantes de la Pudrición del Florete de Brócoli

 

Alternaria tenuissima, A. alternata and Fusarium oxysporum Fungi Causes of the Rotting of the Floret of Broccoli

 

María de Lourdes Fraire–Cordero¹, Daniel Nieto–Angel¹, Elizabeth Cárdenas–Soriano¹, Gabriel Gutiérrez–Alonso², Rafael Bujanos–Muñiz³, y Humberto Vaquera–Huerta⁴.

 

¹ Colegio de Postgraduados, Instituto de Fitosanidad, Km. 36.5 Carr. México–Texcoco, Montecillo, Edo. de México, CP 56230. Correspondencia: lfraire@colpos.mx.

² Seminis–Estación Experimental "La Charca". A 3 kms del kilometro 11 de la carretera Cortazar–Jaral del Progreso, Jaral del Progreso, Guanajuato, CP 38470.

³ INIFAP–Campo Experimental Bajío, Km. 6.5 Carr. Celaya–San Miguel de Allende, Celaya, Guanajuato, CP 38010.

⁴ Colegio de Postgraduados, Instituto de Socioeconomía, Estadística e Informática, Km. 36.5 Carr. México–Texcoco, Montecillo, Edo. de México, CP 56230.

  

Recibido: Noviembre 20, 2009
Aceptado: Mayo 04, 2010

 

Resumen

Durante los meses de julio–octubre del 2005 y 2006, se observaron manchas necróticas circulares, café oscuras en floretes de brócoli en Guanajuato, México. Se colectaron floretes de brócoli con síntomas y del tejido sintomático se aislaron Alternaria tenuissima, A. alternata y Fusarium oxysporum, los cuales fueron identificados morfológica y molecularmente. Las pruebas de patogenicidad mostraron que los tres hongos son agentes causales de la pudrición o manchado del florete de brócoli. Los primeros síntomas se observaron a las 48 h después de la inoculación A. tenuissima y A. alternata presentaron manchas necróticas de 1mm en los botones florales y F. oxysporum presentó crecimiento superficial. A las 96 h las manchas necróticas causadas por A. tenuissima y A. alternata eran de 3 cm de diámetro con una textura aguanosa, la necrosis avanzo rápidamente hasta llegar a los tallos próximos a los botones florales y en el caso de A. alternata penetró tallos de 2 y 3 cm de diámetro. Fusarium oxysporum a las 96 h causó una pudrición gris seca de 3 cm de diámetro en botones y pedicelos con abundante micelio blanquecino el cual se extendió rápidamente, la pudrición incluyó a los tallos próximos a los botones florales.

Palabras clave: identificación, necrosis, Brassica oleracea, Alternaria, Fusarium.

 

Abstract

During the months of July–October of 2005 and 2006, circular necrotic spots, dark coffee were observed in florets of broccoli in Guanajuato, Mexico. Florets of broccoli with symptoms were collected and of the symptomatic tissue were isolated Alternaria tenuissima, A. alternata and Fusarium oxysporum, which were identified morphologically and molecularly. The pathogenicity tests showed that the three fungi are causal agents of the rotting of floret in broccoli. The first symptoms were observed to 48 h after inoculation, A. tenuissima and A. alternata presented necrotic spots of 1mm in the floral bellboys and y F. oxysporum presented superficial growth. To 96 h the necrotic spots caused by A. alternata y A. tenuissima were of 3 cm of diameter with a sodden texture, the necrosis advanced quickly until to arrive at the stems next to the floral bellboys and in the case of A. alternata penetrated stems of 2 and 3 cm of diameter. F. oxysporum to 96 h caused to a gray rotting of 3 cm of diameter in bellboys and pedicels with abundant white mycelium which extended quickly, rotting included the stems next to the floral bellboys.

Key words: identification, necrosis, Brassica oleracea, Alternaria, Fusarium.

 

El brócoli es uno de los cultivos de mayor importancia socioeconómica en la región del Bajío en México (Montesinos, 2005), sin embargo, durante el verano las condiciones cálidas y de alta humedad relativa favorecen la presencia de enfermedades que limitan la producción (Narro–Sánchez et al., 2005). Las enfermedades causadas por hongos son un problema significativo para la producción de crucíferas en varias partes del mundo (Hodgkin y MacDonald, 1986; Dillard et al., 1998; Pattanamahakul y Strange, 1999) incluyendo México (Narro–Sánchez et al., 2005). Entre los hongos que causan mayores daños al follaje o a la germinación de las semillas son: Alternaria brassicae (Berk) (Tewari, 1983), A. brassicicola (Schw) (Babadoost y Gabielson, 1979) A. alternata (Fries), A. raphani (Groves y Skolko) (Gupta y Chaudhury, 1992) Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans (Wr) (Gaetán, 2005); y Phoma lingam (Tode ex Fr.) (Moreno–Rico et al., 2005).

La incidencia de micoflora presente en el follaje de las plantas varía dependiendo de la etapa fenológica (Singh y Rai, 1980) y algunos de estos hongos se comportan como patógenos importantes en cosecha o postcosecha causando pérdidas significativas en el cultivo de brassicas. Alternaria brassicae causó pérdidas de un 30% en las cabezas de coliflor por pudriciones antes de la cosecha (Tamayo et al., 2001), y reducción en la calidad de la col por la necesidad de remover las hojas infectadas (Dillard et al., 1998). Ceponis et al., (1987), encontraron pudriciones hasta de 50% de las cabezas de col en embarques muestreados en el mercado de Nueva York atribuibles a A.brassicae. Menniti y Casalini, (2000), reportan a A. brassicicola causando serios problemas postcosecha en coliflor. Mercier et al., (1991), identificaron a Fusarium avenaceum creciendo sobre floretes de brócoli almacenados por largos períodos a baja temperatura y en atmósferas controlada. A. brassicicola y A. brassicae son las especies que causan los mayores problemas en la producción de crucíferas sobre todo por su capacidad de sobrevivir en las semillas por varios meses a diferentes temperaturas y humedades relativas (Kumar y Gupta, 1994; Abul–Fazal et al., 1994).

En el estado de Guanajuato, México., durante el verano del 2002 y 2003 se presentó un incremento considerable en la incidencia de pudriciones y manchado del florete de brócoli en campo, los síntomas se asociaron con los hongos Alternaria spp, Phoma spp y Fusarium spp (Narro–Sánchez et al., 2005). El propósito de este estudio fue identificar las agentes causales de los síntomas del manchado y pudrición del florete en los cultivos comerciales localizados en Guanajuato, México.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de los hongos presentes en los floretes de brócoli con síntomas de manchas y pudriciones. Durante los meses de julio a octubre del 2005 y 2006 en Apaseo el Grande, Guanajuato, Méx., se colectaron floretes de brócoli en la etapa de cosecha de las variedades comerciales 'Marathon', 'Patron' (Compañía Sakata) y 'Monaco' (Compañía Syngenta–Rogers), con síntomas de manchas café oscuras y pudriciones en los botones florales.

De cada florete se tomaron 5 trozos de tejido de 0.5 cm² de la zona de avance de la enfermedad, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1.5% por dos minutos y se lavaron tres veces consecutivas con agua destilada estéril. En total se hicieron 150 siembras de tejido en cajas de Petri con el medio de cultivo papa–dextrosa–agar (Bioxon®, Becton Dickinson S.A de C.V., México.). Cada colonia desarrollada se separó y se purificó por cultivo monospórico. La identificación a nivel de género se realizó siguiendo las claves de Barnett y Hunter (1972), y dio como resultado que para el 2005 el 70% de las colonias aisladas correspondieron al género Alternaria y el 30% a Fusarium y para el 2006 el 80% de las colonias correspondieron a Alternaria y el 20% a Fusarium. Las colonias de Alternaria se dividieron en dos grupos por el color que presentaban, ya que algunas eran de color café–verdoso (AC) y otras verde olivo (AO).

Pruebas de patogenicidad de Alternaria spp. y Fusarium sp. Se utilizaron 40 floretes en etapa de cosecha de la variedad 'Marathon', se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1.5% por 2 minutos y se lavaron con agua destilada estéril, para cada hongo se utilizó un florete como unidad experimental con 1 0 repeticiones en un arreglo completamente al azar, cada florete se inoculó colocando sobre su superficie (domo) cuatro gotas de 0.5 mL de una suspensión de conidios en agua destilada estéril (1x10⁵ conidios/mL) de cada uno de los aislamientos procedentes de cultivos monospóricos. La colonias monospóricas de AC y AO se cultivaron en medio de cultivo papa–zanahoria–agar (PZA) y la de Fusarium en PDA, a una temperatura de laboratorio (24 ± 2°C) con 8 horas diarias de luz blanca fluorescente (lámparas Philips®, 21w/33). Después de dos semanas los conidios se filtraron en una malla de algodón estéril y se preparó la suspensión conidial antes mencionada. Como testigo se utilizaron los 10 floretes restantes, los cuales se inocularon con agua destilada estéril con el mismo procedimiento. Los 40 floretes inoculados se colocaron en charolas de unicel de 40x30 cm desinfestadas con etanol al 70%. Se cubrieron con una bolsa de polietileno y se incubaron a una temperatura de 24±2°C y 80% de humedad relativa, los síntomas se registraron diariamente por seis días en el caso de los inoculados con AC y AO y siete días en el caso de Fusarium sp. De los síntomas observados en los sitios de inoculación se hicieron cortes transversales para observar el avance de los hongos dentro de los tejidos, a las 144 h después de la inoculación (DI) para AC y AO y a las 168 h DI en el caso de Fusarium sp. De las zonas de avance de los hongos en los tejidos necrosados, se tomaron 10 fracciones de tejido de 0.5 cm² y se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1.5% durante 2 min, posteriormente se lavaron tres veces consecutivas con agua destilada estéril y se sembraron en medio de cultivo PDA. Las características morfológicas de las colonias y hongos reaislados se compararon con las originalmente inoculadas.

Identificación de Alternaria spp. y Fusarium sp. como posibles agentes causales de la pudrición del florete. Se utilizaron tres colonias monoconidiales de Alternaria AC y AO se sembradas en PZA y tres colonias monoconidiales de Fusarium sembradas en PDA, las cuales se mantuvieron por 10 días a una temperatura de 24±2°C con 8 horas diarias de luz blanca fluorescente (lámparas Philips®, 21w/33). La identificación se hizo con base a las características del micelio, color de la colonia, forma de conidióforos; y forma, tamaño y color de los conidios. Para observar estas estructuras se hicieron preparaciones permanentes de los hongos en glicerol al 50% acidificado con cinco gotas de HCl al 12N y se observaron en el microscopio compuesto Carl Zeiss. Con la ayuda de las claves de Rotem (1994), Simmons (1995) y Nelson et al., (1983) se identificaron los aislamientos a nivel de especie. Para confirmar la identificación morfológica se llevó a cabo la extracción de ADN (ácido desoxiribonucléico) de micelio de una colonia monoconidial de los hongos de acuerdo a la metodología de Ahrens y Seemüller (1992), se amplificaron las regiones internas ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (rARN) localizadas entre la subunidad pequeña 18S rRNA, 5.8S y la subunidad larga 28S rRNA, con los iniciadores universales ITS4 (5'–TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC–3') e ITS5 (5'–GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G–3') (White et al., 1990) por PCR y el producto se purificó con el j uego wizard (PROMEGA®) y s e s ecuenció en el Instituto de Fisiología Celular de la UNAM en un secuenciador Genetic Analizer mod. 3 100, APPLIED BIOSYSTEM. La secuencia ITS fue alineada en la base de datos del Banco de Genes del Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI), USA por medio del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La preservación de los cultivos monospóricos se hizo en tubos de ensaye con medio PDA y cubiertos con aceite mineral esterilizado.

 

RESULTADOS

Expresión de síntomas. Durante el muestreo en campo se observó que la pudrición en los floretes es más frecuente cuando se presentan condiciones de alta humedad provocadas por precipitaciones (50 mm) intercaladas con periodos de sequía. Las condiciones anteriores provocan la aparición de manchas café oscuras principalmente en los puntos de unión entre los minifloretes, donde no se conserva la pendiente del florete y quedan pequeños hundimientos. Es posible que en ésta zona las gotas de lluvia se conserven por más tiempo, lo que propicia la infección de los hongos. También se encontraron floretes con pudriciones en los puntos de crecimiento de los minifloretes donde los botones florales más jóvenes son más pequeños de tal forma que también se forma un hundimiento donde se conserva la humedad con facilidad.

Pruebas de patogenicidad de Alternaria spp. y Fusarium sp. en floretes de brócoli . Todos los floretes inoculados con Alternaria AC, AO y Fusarium sp., produjeron síntomas de necrosis y pudrición. Alternaria AC y AO a las 48 h DI produjeron pequeños puntos negros de aproximadamente 1 mm de diámetro en los sépalos de los botones florales, pero no se observó micelio evidente.A las 96 h DI AC y AO desarrollaron una mancha de 2.5–3 cm de diámetro aproximadamente. El micelio de AC tomó un coloración café–amarillenta en el centro de la lesión y en los alrededores una coloración amarillenta, los botones infectados tomaron una coloración café oscuro pero no se desintegraron con facilidad (Fig. 1A). El micelio de AO tomo una coloración café oscuro en el centro de la lesión y se produjo abundante esporulación, alrededor de la lesión el micelio fue de color blanquecino y los botones infectados tomaron un color café oscuro pero tuvieron una consistencia acuosa y se desintegraron con facilidad (Fig. 1B). Posteriormente a las 144 h DI las manchas se unieron cubriendo el 80% de la superficie del florete. En los cortes realizados en las zonas inoculadas, se observó que las cepas de Alternaria después de causar una pudrición café acuosa en los botones florales, invadieron los pedicelos y los tallos más delgados (2–3 mm de diámetro) (Fig. 1C y 1D), en el caso de AO también invadió tallos gruesos de 2–3 cm de diámetro.

En el caso de Fusarium, a las 48 h DI se observó micelio externo superficial de color blanco, creciendo lento sobre los botones, entre las 72 y 96 h DI el crecimiento fue lento pero ya había formado una mancha de micelio blanquecino de 3 cm de diámetro en promedio y no se observó esporulación. Posteriormente las manchas de micelio blanquecino algodonoso se unieron de tal forma que cubrieron el 80% de la superficie a las 168 h DI (Fig. 1E). Los cortes revelaron una pudrición acuosa de botones y pedicelos en el centro de la lesión y una necrosis gris seca de los botones y pedicelos en los alrededores de la lesión. El hongo produjo abundante micelio superficial y llegó a invadir tallos florales delgados en los sitios de inoculación (2–7 mm de diámetro) (Fig. 1F). En los floretes utilizados como testigos no se observó manchas o crecimiento de micelio externo sobre la superficie de los botones, y tampoco pudrición de tejidos. De todos los floretes con síntomas se tomó tejido dañado se reaislaron los hongos en cultivo puro, coincidiendo con las características de los hongos aislados. El aislamiento AO fue el más patogénico, ya que causa una desintegración de tejidos mayor y es capaz de invadir tallos gruesos de 2–3 cm de diámetro.

Identificación de Alternaria spp. y Fusarium sp. como agentes causales de la pudrición del florete. En total se identificaron tres especies de hongos causantes del manchado o pudrición del florete de brócoli. Alternaria AC presentó colonia verde grisacea en medio de cultivo PZA, conidios obclavados, muriformes, con ornamentación rugosa–punteada, con septación transversal y longitudinal variable de 4 a 6 y 2 a 3 respectivamente y un tamaño variable de conidios de 11 a 42 x 7.7 a 11 μm con conidióforos primarios de 31–88 x 3.3 a 4.4 μm, estas características correspondieron a la especie Alternaria tenuissima (Kunse; Wiltshire) de acuerdo a las claves y descripciones de Rotem (1994) y Simmons (1995). Alternaria AO presentó colonia verde olivo en medio de cultivo PZA, conidios obclavados, muriformes, con ornamentación rugosa–punteada, con septación transversal y longitudinal variable de 3 a 7 y 0–1 respectivamente y un tamaño variable de conidios de 12 a 42 x 6.7 a 13 μm con conidióforos primarios de 16–71 x 3.3 a 4.4 μm. La catenulación puede poseer de 5 – 10 conidios, presenta ramificación secundaria y puede presentar ramificación terciaria, estas características correspondieron a la especie Alternaria alternata de acuerdo a las claves de Rotem (1994) y Simmons (1995). Fusarium sp presentó colonia de coloración rosada a púrpura con apariencia algodonosa, esporodoquios abundantes errupentes de coloración color salmón o naranja, macroconidios en forma de hoz de 3 a 5 células, delgados con la célula apical atenuada y la célula basal en forma de pie producidos en esporodoquios, monofialides ramificadas o simples y abundantes clamidosporas simples o en pares, las características concordaron con lo descrito por Nelson et al., (1983), para la especie Fusarium oxysporum.

Identificación molecular. Las regiones internas ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (rARN) amplificadas por PCR para Alternaria AC fue de 578pb que correspondió a una secuencia completa de ambas regiones ITS1 e ITS2. En el banco de genes (NCBI), la secuencia se alineó en primer lugar con secuencias correspondientes a especies de Alternaria no especificadas y a algunos hongos de suelo, la primera especie de Alternaria con la que se alineó fue Alternaria tenuissima (número de acceso AY154712.1) con un índice de similaridad de 99%, el índice de similaridad fue el mismo para Alternaria tenuissima (número de acceso AY154712.1) y para las secuencias de especies no especificadas, así como para otras especies como A. mali (Roberts) y A. longipes (Ellis and Everhart) con las cuales se alineo posteriormente con el mismo porcentaje, sin embargo por la morfología presentada se corroboró que la especie de estudio era A. tenuissima.

Las regiones internas ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (rARN) amplificadas por PCR para Alternaria AO fue de 558 pb que correspondió a una secuencia completa de ambas regiones ITS1 e ITS2. En el banco de genes (NCBI), la secuencia se alineó en primer lugar con A. arborescens (Simmons) (DQ242505.1), en segundo lugar con una especie de Alternaria no especificada (número de acceso AY714482.1) y en tercer lugar con A. alternata (número de acceso AF397236.1) , posteriormente con A. grisen (número de acceso AF314581.1) todas presentaron los mismos valores (Score 979 y con 100% de índice de similaridad), se decidió tomar a A. alternata (número de acceso AF397236.1), apoyados en la identificación morfológica realizada.

Las regiones internas ITS1 e ITS2 de los genes ribosomales (rARN) amplificadas por PCR para Fusarium sp. fue de 540 pb que correspondió a una secuencia completa de ambas regiones ITS1 e ITS2. En el banco de genes (NCBI), la secuencia se alineó en primer lugar con F. oxysporum (número de acceso EF495235.1); con un valor de 950 y un índice de similaridad de 99 %, en este caso no hubo alineamientos con otras especies de Fusarium, pero si con secuencias de especies no especificadas de hongos de suelo.

 

DISCUSIÓN

En este estudio se encontró evidencia suficiente de que Alternaria tenuissima, A. alternata y Fusarium oxysporum causan los síntomas de pudrición y manchado del florete de brócoli. La humedad proporcionada al florete al momento de la inoculación de los hongos fue suficiente para permitir la germinación de los conidios y la infección, Hong y Fitt (1995),mencionan que A. brassicae necesitó 4 h de humedad para infectar hojas de Brassica napus y que el incremento de la humedad favorece la severidad de la enfermedad. Para este estudio los síntomas iniciales de A. tenuissima y A. alternata en los sépalos de los botones de brócoli, fueron similares a los producidos por A. brassicicola y A. brassicae en plántulas de col, donde también se observaron puntos necróticos al inicio de la infección (Babadoost y Gabrielson, 1979). Thomma, 2003; Eshel et al., 2000; Nutsugah et al., 1994, mencionan que varias enzimas y toxinas juegan un papel determinante en el proceso de infección de A. tenuissima y A. alternata. Eshel et al., (2000) mencionan que endoglucanasas están relacionadas con el síntoma de manchas negras en frutos de persimonio atacados por A. alternata, sin embargo en este estudio no se determinó la presencia de enzimas o toxinas en los tejidos de brócoli. F. oxysporum f. sp conglutinans es un patógeno que ha sido reportado atacando brassicas en campo, donde causa un amarillamiento de hojas y posteriormente necrosis y defoliación (Rangavajhyala et al., 1998; Farnham et al., 2001); en este caso F. oxysporum, no causó amarillamiento de los botones, solo necrosis gris–seca y abundante micelio blanquecino que cubrió gran parte del domo del florete, algo similar a lo descrito por Mercier et al. (1991) en floretes de brócoli almacenados los cuales fueron infectados por F. avenaceum. A. alternata fue la especie más virulenta desintegrando los tejidos infectados más rápidamente que A. tenuissima y F. oxysporum, lo cual puede ser atribuible a la producción de algún compuesto fitotóxico que no producen las otras dos especies, sin embargo no se comprobó su presencia. A. alternata y A. tenuissima son especies ampliamente relacionadas por lo que existen numerosos aislamientos con características intermedias de ambas especies, lo que dificulta la separación taxonómica (Pryor y Michailides, 2002); ésta semejanza morfológica también se reflejó en la identificación molecular, donde las secuencias ITS1 e ITS2 de ambas especies se alinearon con el mismo porcentaje con otras especies que comparten características, que los mismos autores reportan con aislamientos de A. alternata, A. tenuissima, A. arborescens y A. infectoria en pistacho.

Alternaria tenuissima, A. alternata y Fusarium oxysporum, no solo dañan los tejidos de la inflorescencia del brócoli, sino que posiblemente puedan contaminar las semillas, tal como sucedió con A. brassicicola y A. brassicae, las cuales contaminaron semillas de col causando pérdidas importantes durante la germinación y la etapa de plántula (Babadoost y Gabrielson, 1979; Dillard et al, 1998).

 

CONCLUSIONES

Alternaria tenuissima, A. alternata y Fusarium oxysporum son agentes causales de la pudrición o manchado del florete de brócoli, al ocasionar necrosis de células y pudrición de tejidos.

 

LITERATURA CITADA

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