INTRODUCCIÓN

El Estado de Guanajuato es el principal productor de brócoli (Brassica oleracea var. Itálica L.) en México, con una producción de 364,658.01 ton, lo que significa un ingreso para los productores del estado de 2, 084,816.33 de pesos (^{SIAP, 2019}). La mayor parte de la producción es para exportación, el 97.5% de exportaciones de este vegetal son adquiridas por Estados Unidos, seguido de Canadá y países europeos como Reino Unido, Alemania, Francia, Países Bajos y Bélgica (^{SIAP, 2018}). La Palomilla de dorso diamante (PDD), Plutella xylostella (L.), es la plaga más importante en cultivos de la familia Brassicaceae (^{Fathi et al., 2011}; ^{Zalucki et al., 2012}). El manejo de PDD se basa principalmente en el uso de insecticidas de síntesis química de amplio espectro (^{Tabone et al., 2012}). La mayoría de los insecticidas existentes son perjudiciales para el medio ambiente y se han observado múltiples efectos secundarios en artrópodos benéficos (^{Biondi et al., 2012}; ^{Lu et al., 2012}). Además, debido al uso excesivo de plaguicidas comerciales y las aplicaciones inadecuadas (^{Sun et al., 2012}), la PPD ha desarrollado resistencia a al menos 95 diferentes ingredientes activos, entre los que destacan la cipermetrina, abamectina, indoxacarb, spinosad, permetrina, fipronil y productos elaborados a base de la bacteria Bacillus thuringiensis (^{APRD, 2019}). Los plaguicidas, dependiendo de la forma de aplicación y dosis utilizadas, presentan efectos letales y subletales sobre los insectos (^{Mahmoudvand et al., 2011a}). La toxicología demográfica es una técnica ecotoxicológica que integra los parámetros de la tabla de vida en función a las dosis aplicadas (letales o subletales), las poblaciones expuestas a diversas dosis de un tóxico se comparan con poblaciones no expuestas a este mismo tóxico (^{Mahmoudvand et al., 2011b}). Las dosis subletales llegan a afectar la fisiología y el comportamiento de los insectos (^{Haynes, 1988}), lo cual puede influir en el tiempo de desarrollo (^{Wang et al., 2008}), peso de larvas, pupas y adultos (^{Yin et al., 2008}), longevidad del adulto (^{Ergin et al., 2007}), incubabilidad (^{Alyokhin et al., 2008}), fecundidad (^{Wang et al., 2009}), tamaño del huevo (^{Yin et al., 2008}) y parámetros de reproducción, tales como la tasa reproductiva neta (R₀), tasa de aumento intrínseca (r_m), tasa de aumento finita (k), tiempo de generación (T), tiempo de duplicación (Dt) (^{Ahmad et al., 2012}) y la proporción de sexos (^{Delpuech & Meyet, 2003}). Los efectos subletales son considerados factores que intervienen en el desarrollo de la resistencia, por lo que una mejor comprensión de estos puede ser importante para diseñar estrategias efectivas de manejo de la resistencia a insecticidas (^{Tabashnik et al., 2008}). El objetivo de esta investigación fue caracterizar los efectos subletales en la fase de huevo, estadios larvales, el tiempo de desarrollo, supervivencia, ovoposición y la longevidad del adulto en una población resistente de P. xylostella a fipronil.

MATERIALES Y MÉTODOS

Insectos. La línea de campo se colectó en parcelas comerciales ubicadas en el municipio de Celaya en el Estado de Guanajuato y fue criado en condiciones de laboratorio manteniéndolas bajo presión de selección con el insecticida fipronil durante diez generaciones (G₁₀), para incrementar el nivel de resistencia. Utilizando plantas de brócoli de 50 días de edad, la alimentación de los adultos consistió en una solución azucarada al 15%, esto para asegurar el apareamiento y la ovoposición. Todas las etapas de desarrollo de la PDD se mantuvieron en condiciones controladas de 27±1°C, 80±10% HR, 16:8 h L:O. Como línea susceptible se utilizaron insectos proporcionados por Instituto Nacional de Investigación Forestal Agrícola y Pecuaria (INIFAP), sin haberse sometido a un proceso de presión de selección con insecticidas desde 1996.

Bioensayos. Se evaluó el insecticida fipronil a seis concentraciones y un testigo absoluto que consistió en agua más adherente, la prueba de efectividad biológica se realizó mediante el método de inmersión de hojas (^{IRAC, 2019}). Se recortaron discos de hojas de B. oleracea var. Itálica de 6 cm de diámetro y se sumergieron durante 10 s en las diferentes concentraciones evaluadas y fueron preparadas con agua destilada que contenía 1 mL L^-1 de adherente. Las hojas se dejaron secar durante 1 hora y luego se colocaron de forma individual en cajas Petri revestidas con papel absorbente humedecido con agua. Se transfirieron un total de 10 larvas de tercer instar por cada disco de hoja y se realizaron cuatro repeticiones por concentración. La mortalidad se evaluó 24 h después del inicio del experimento; las larvas que no reaccionaron cuando fueron estimulados con un pincel en la parte dorsal se registraron como muertas. Esta actividad se repitió hasta la décima generación fue donde ya no hubo diferencias en la respuesta al insecticida.

Efectos de la resistencia a fipronil en el desarrollo de Plutella xylostella. Una vez que la población de campo de P. xylostella alcanzó resistencia en la G₁₀ en base a presión de selección de fipronil, 10 larvas de tercer instar se colocaron en disco de hoja tratado con la CL₂₀ de la G₁₀ (progenitores), utilizando un diseño experimental completamente al azar 10 repeticiones por cada tratamiento. Cada hoja con 10 larvas de tercer instar se consideró como unidad experimental. Se dejaron las larvas a alimentar por 24 h y posteriormente se cambió la hoja por otra no tratada y se observaron las larvas hasta transformarse en pupas y la emergencia de adultos. Una vez emergidos, los adultos se sexaron y se formaron 10 parejas, las cuales se colocaron en cajas Petri provistas de papel absorbente humedecido con agua potable y una hoja de B. oleracea var. Itálica y se dejaron que copularan y ovipositaran hasta que la última hembra murió. Diariamente se tomó el registro de los huevos ovipositados por hembra por día, los adultos fueron alimentados con agua azucarada al 15%, para asegurar su apareamiento y la oviposición. Se colectaron 100 huevos al azar de las parejas formadas y se colocaron sobre discos de hojas de brócoli en cajas Petri revestidas con papel absorbente humedecido con agua potable, realizado mediante un diseño experimental completamente al azar con 10 repeticiones. Cada unidad experimental consistió en un disco de hoja de brócoli con 10 huevos. Se registró la duración del desarrollo en cada una de las etapas larvales, así como de pupa y de adulto de ambos sexos. En la etapa de pupa, se seleccionaron 10 pupas al azar de dos días de edad y se pesaron. En los adultos emergidos se evaluaron los efectos subletales, como proporción sexual, longevidad del adulto (hembra y macho) y fecundidad. Durante la fase experimental los insectos se mantuvieron en condiciones ambientales controladas de 27±1°C, 80±10% HR, 16:8 h L:O.

Análisis de resultados. Los datos de mortalidad obtenidos en los bioensayos fueron corregidos con la fórmula de ^{Abbott (1925)} y los resultados se sometieron a un análisis probit (^{Finney, 1971}) para obtener la curva de concentración-mortalidad, utilizando el programa SAS System for Windows ver 9.0 (^{SAS, 2002}). Con los valores obtenidos en los variables de desarrollo se realizó un análisis de varianza (ANVA), cuando este indicó diferencia significativa entre los tratamientos se aplicó la prueba de Tukey (α<0.05), para la separación de las medias. Todos los análisis fueron realizados con el programa R, versión 3.3.1.

RESULTADOS

Los valores de CL₅₀ y CL₂₀ de la línea susceptible (LS), la línea de campo sin presión de selección, o generación inicial G₁ (LC) y la línea de campo con presión de selección G₁₀ o resistente (LR) de P. xylostella se muestra en el Cuadro 1. Para la LS se estimó una CL₅₀ de 0.092 partes por millón (ppm) y una CL₂₀ de 0.028 ppm, la línea de campo generación inicial presentó una CL₅₀ de 0.482 ppm y una CL₂₀ de 0.095 ppm. Después de a haber aplicado un proceso de selección durante diez generaciones se obtuvo una CL₅₀ de 3.024 ppm y una CL₂₀ de 0.865 ppm. El factor de resistencia fue 32.86 veces mayor en comparación a la LS.

Los porcentajes de pupas, pesos de pupa, porcentajes de adultos emergidos y proporción sexual tanto para progenitores como descendientes de la LS y la línea de campo LR expuestas a una concentración subletal (CL₂₀) y sin exposición se muestran en el Cuadro 2. De acuerdo con el ANVA hubo una diferencia significativa entre los tratamientos en estudio para los porcentajes pupales, porcentaje de adultos emergidos y proporción sexual, en cuanto a los pesos de pupas no hubo diferencia significativa entre los tratamientos. La LS registró el mayor promedio para el porcentaje de pupas de los progenitores (95%), mientras que la LR expuesta a CL₂₀ tuvo el valor menor (53%), observándose una reducción del 44% respecto a la LS. Por su parte, el porcentaje de pupas de los descendientes se vio reducido tanto para la LS tratada con una CL₂₀, como para la LR sin exposición y LR expuesta a CL₂₀ con valores de 43, 41 y 33%, respectivamente. En el porcentaje de adultos emergidos se observa que hubo un efecto marcado al tratar la LS y LR con la CL₂₀ reduciéndose más de un 25%, respecto a la LS y la LR sin aplicación para los progenitores. En lo que respecta a la proporción sexual de los progenitores no se observó diferencia significativa entre los tratamientos evaluados. Sin embargo, hubo una diferencia significativa en los descendientes al verse reducida la proporción de 1.92 a 0.9 hembras por macho para LS sin aplicación, con respecto a la LS con aplicación de la CL₂₀, de igual manera la LR sin exposición con respecto a la LR expuesta se vio reducida de 1.55 a 0.27 hembras por macho.

Los efectos subletales del fipronil en la oviposición tanto de hembras de la LS con y sin aplicación de la CL₂₀ y de la LR con y sin aplicación se muestran en el Cuadro 3, donde se observa que hubo diferencias significativas entre los tratamientos evaluados para el número de huevos por hembra por día (HHD) y en el total de huevos ovipositados por hembra. La LR fue la que presentó la media más alta de HHD tanto para progenitores como descendientes con valores de 53.76 y 42.28 huevos, respectivamente, reportando un total de 251.8 huevos para progenitores y 253 huevos para descendientes. Por su parte la LS muestra medias de 32.04 y 24.28 de HHD y un total de 160.2 y 145.8 huevos para progenitores y descendientes, respectivamente. La aplicación de una concentración subletal (CL₂₀) de fipronil en ambas líneas (LS y LR) presenta un efecto para las hembras en la oviposición de huevos al verse reducida en la generación de progenitores en más de un 11% para la LS y en 25% para la LR. En el caso de los descendientes solo se aprecia una disminución en la LR de un 20.5%, lo cual se verá reflejado en un menor número de individuos, caso contrario en la LS se observó un aumento de un 59%.

En el Cuadro 4 se muestra la comparación de medias de las fases de desarrollo, así como el tiempo de longevidad de hembra-macho y el tiempo total de desarrollo de las líneas con y sin aplicación, así como la línea LR con y sin exposición a la CL₂₀ de P. xylostella, observándose diferencias significativas para las fases de huevo, larva 4 (L4) y pupa, longevidad de hembra-macho y para el tiempo total de desarrollo de P. xylostella. La LR presentó el mayor tiempo de desarrollo en la fase de huevo con un valor medio de 3.85 días, por su parte la LS y LR con aplicación presentaron la media más baja de 3.03 y 3.00 días, respetivamente. De igual manera para la fase de L4 se puede observar que al aplicar fipronil (CL₂₀) en la LS y en la LR hubo un efecto en el desarrollo de las larvas al alargar su tiempo de 2.379 y 4.64 días, respectivamente, en comparación con la LS y la LR sin aplicación (1.79 y 3.33 días, respectivamente). Por otro lado, en la fase de pupa el tiempo de desarrollo se ve disminuido al aplicar una CL₂₀ de fipronil en la LS y LR con valores de 2.14 y 2.83 días, respectivamente, mientras que en la LS y LR sin aplicación los días de desarrollo fueron de 4.05 y 3.25, respectivamente. El tiempo de vida de las hembras también se vio afectado por la aplicación de fipronil tanto en la LS y LR al reducirse en más de 1.95 y 2.75 días respectivamente, en comparación de la LS y la LR sin tratamiento insecticida. La vida de los machos solo se vio reducida para la LS con aplicación, en comparación a la LS sin aplicación acortándose sus días de vida de 2.89 a 1.00. Para el tiempo total de desarrollo del huevo hasta la muerte del adulto, se puede observar que la LS como la LR sin exposición se comportaron de manera muy similar (17.81 y 18.17 días, respectivamente). Sin embargo, para las líneas LS y LR expuestas, los días de vida desde huevo hasta la muerte del adulto se vieron afectados donde la LS se redujo 2.46 días, en tanto que para LR se presentó un aumento de 3.3 días.

DISCUSIÓN

En estudios previos con el fipronil, ^{Barrera et al. (2006)} reportaron valores de CL₅₀ de 0.03 ppm para una línea de campo, siendo estos resultados menores a los reportados en esta investigación para la línea resistente G₁₀ (3.024 ppm), por lo cual concluimos que P. xylostella ha desarrollado resistencia a este insecticida a través del proceso de selección por 10 generaciones. Después de someter a selección a la generación progenitora durante 10 generaciones se obtuvo un aumento en la resistencia de 32.86 veces en comparación a la LS. En trabajos similares como los reportados por ^{Wang et al. (2015)}, quienes reportaron un factor de resistencia de 2,200 veces al realizar una selección durante 25 generaciones de P. xylostella. ^{Pu et al. (2009)} reportaron un factor de resistencia de 4,330 veces en G10 en una población de P. xylostella sometida a selección al insecticida abamectina. Por otro lado, ^{Abbas et al. (2014)} obtuvieron una resistencia para fipronil de 140.25 veces en 11 generaciones de selección sobre Musca domestica.

Estos resultados de porcentaje de transformación de pupa de esta investigación difieren a lo reportado por ^{Hui et al. (2010)}, donde efectos del fenvalerato en el desarrollo de P. xylostella presentaron un porcentaje de pupación en el control de 88.5 y de 87.4% para una línea tratada con una concentración subletal (CL₂₅). Por su parte, ^{Yin et al. (2008)}, reportaron un porcentaje de pupación en descendientes de P. xylostella de 75.19% de una línea tratada con una CL₂₅ de spinosad, resultados mayores a los reportados en esta investigación. ^{Huang et al. (2015)} reportaron una disminución del 24% en el porcentaje de emergencia de adultos de una LS al ser tratada con CL₂₅ de cantaridina.

^{Yin et al. (2008)} reportaron una fecundidad de 121.19 huevos en promedio por hembra, para una línea susceptible, la cual se vio reducida a 81.70 huevos al exponer a sus progenitores a una CL₂₀ de spinosad. Sin embargo, ^{Mahmoudvand et al. (2011a)} observaron una fecundidad mayor para una línea susceptible de 207.29 huevos en promedio por hembra, disminuida a 146.05 huevos al aplicar indoxacarb a una CL_25. Por su parte, ^{Han et al. (2012)} reportaron una fecundidad menor a la observada en esta investigación con un número total de 120 huevos en una línea susceptible, la cual disminuyó al hacer exponer larvas de tercer instar a una CL₂₀ de chlorantraniliprole. Por lo anterior, se puede considerar que para el insecticida fipronil la fecundidad de P. xylostella fue reducida al aplicar concentraciones subletales de insecticidas. Fipronil actúa sobre el sistema nervioso de los insectos al unirse a los receptores de ácido gamma-aminobutírico (GABA). Estos receptores controlan el flujo de iones de cloruro a través de las membranas celulares del canal iónico que inhibe al sistema nervioso central, induciendo una hiperpolarización (^{Narahashi et al., 2007}). Los receptores GABA se encuentran en el cerebro de los insectos afectando la memoria y la percepción sensorial (^{El Hassani et al., 2005}). Asimismo, el fipronil baja la capacidad de la actividad de la enzima citocromo oxidasa, que es parte fundamental del complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial que actúa en la fase terminal de la cadena de transporte de electrones en el proceso de respiración mitocondrial para generar la energía requerida para la actividad metabólica y desarrollo (^{Hevner & Wong-Riley 1989}; ^{Decourtye et al., 2002}).

Sin embargo, comparando la línea LS con la línea LR sin exposición se puede observar que hubo un efecto de hormoligosis, lo cual se puede atribuir a la resistencia generada a través del tiempo. La hormoligosis describir el fenómeno cuando dosis subletales de insecticidas aumentan la tasa reproductiva y la incidencia de insectos (^{Mahmoudvand et al., 2011a}). Sota et al. (1998) reportaron que el número de huevos de hembras de P. xylostella tratadas con LC_12.5, LC₂₅ y LC₅₀ de fenvalerato aumentaron en comparación a un control.

Los resultados obtenidos en las fases de desarrollo de P. xylostella son muy similares a los reportados por ^{Mahmoudvand et al. (2011a}; ^b), en estudios realizados sobre los efectos subletales de indoxacarb y hexaflumuron sobre P. xylostella se reportaron valores de 3.26 a 3.86 días en la fase de huevo al exponer larvas de tercer instar a una CL₂₅ de ambos insecticidas. ^{Mahmoudvand y Moharramipour (2015)} presentaron un incremento en los días de desarrollo de L4 de P. xylostella tratadas con CL₁₀ y CL₂₅ de fenoxycarb y un control con medias de 2.40, 2.28 y 1.51 días, respectivamente. ^{Han et al. (2012)} reportaron que P. xylostella no presentó una disminución significativa en el tiempo de desarrollo de la fase pupal al exponer larvas de tercer instar a CL₁₀ y CL₂₅ de chlorantraniliprole en comparación a un control con valores de 4.13, 4.29 y 4.16 días, respectivamente. Por su parte, ^{Mahmoudvand y Moharramipour (2015)} reportaron un incremento en los días de pupación para esta plaga al aplicar CL₁₀ y CL₂₅ de fenoxycarb respecto a un control con medias de 4.98, 4.71 y 3.70 días, respectivamente. ^{Zhang et al. (2012)} observaron que el tiempo de longevidad tanto de hembras y machos de P. xylostella fue mayor a 8.78 y 9.89 días, respectivamente, al aplicar la CL₂₅ de metaflumizona en larvas de tercer instar. Sin embargo, ^{Yin et al. (2008)} reportaron una disminución en el tiempo de desarrollo para hembras y machos en comparación con un control de 7.73 a 6.78 días para hembras y para los machos de 6.64 a 5.52 días en larvas de tercer instar expuestas a dosis subletal (CL₂₅) de spinosad. ^{Zhang et al. (2012)} observaron que el tiempo de longevidad tanto de hembras y machos de P. xylostella es mayor a 8.78 y 9.89, respectivamente, al aplicar CL₂₅ de metaflumizona en larvas de tercer instar de P. xylostella. Por otro lado, ^{Yin et al. (2008)} reportaron una disminución en el tiempo de desarrollo para hembras y machos en comparación con un control de 7.73 a 6.78 días para hembras y para los machos fue de 6.64 a 5.52 días al exponer larvas de tercer instar a dosis subletal (CL₂₅) de spinosad. ^{Yin et al. (2008)}, ^{Zhang et al. (2012)}, ^{Mahmoudvand y Moharramipour (2015)} y ^{Han et al. (2012)} observaron una leve disminución en el tiempo total de desarrollo de P. xylostella al exponer larvas de tercer instar a dosis subletales de spinosad, metaflumizona, fenoxycarb y chlorantraniliprole. respectivamente, lo cual puede propiciar mayor número de generaciones en campo de esta plaga. En el caso de la LR no hubo diferencia en comparación a la LS; sin embargo, cuando a esta se le aplicó una CL₂₀ su ciclo de vida fue extendido.

CONCLUSIONES

La aplicación de bajas concentraciones (CL₂₀) de fipronil en una línea resistente presentó efectos importantes en la biología de P. xylostella al alargar el tiempo de desarrollo, disminuir el porcentaje de pupación y emergencia de adultos, así como una menor fecundidad comparada con la línea susceptible. Estos cambios pueden ser resultado de los costos biológicos de la resistencia. Por otro lado, hubo un menor número de individuos con un ciclo más largo, lo que pudiera ocasionar un mayor número de aplicaciones del insecticida. El desarrollo de resistencia de P. xylostella a fipronil genera un fenómeno de hormoligosis al aumentar el número de huevos por hembra, lo que favorece a una mayor incidencia de individuos, lo cual puede ocasionar problemas para su control.