Artículo original

 

Crecimiento y sobrevivencia de Vibrio parahaemolyticus en ostión americano (Crassostrea virginica) almacenado en refrigeración

 

Growth and survival of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus in American oyster (Crassostrea virginica) under cold storage

 

Argel Flores-Primo, D en C,⁽¹⁾ Violeta T Pardío-Sedas, D en C,⁽¹⁾ Karla López-Hernández, D en C,⁽¹⁾ Leonardo Lizárraga-Partida, D en C,⁽²⁾ Roxana Uscanga-Serrano, QC.⁽¹⁾

 

(1) Programa de Maestría en Ciencia Animal, Facultad de Medicina, Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana. Veracruz, Veracruz, México.

(2) Biotecnología Marina, Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada. Ensenada, Baja California, México.

 

Autora de correspondencia

 

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Resumen

Objetivo. Cuantificar las densidades de Vibrio parahaemolyticus en ostión americano (Crassostrea virginica) almacenado en refrigeración.

Material y métodos. Se almacenaron 320 ostiones a 7 °C durante nueve días y se determinaron las densidades totales y patogénicas mediante la técnica NMP-PCR.

Resultados. Se observaron densidades de V. parahaemolyticus tlh+ en los días 0,3 y 6 de almacenamiento con 1. 134,2.764 y 0.785 log₁₀NMP/g, respectivamente, y en los días 0 y 3 la densidad patogénica trh+ con 0.477 y 0.519 log₁₀NMP/g, respectivamente; las densidades patogénicas tdh+ (0.519 log₁₀NMP/g), tdh+/trh+ (0.519 log₁₀ NMP/g) y tdh+/orf8+ (-0.444 log₁₀NMP/g) se detectaron al tercer día de almacenamiento.

Conclusión. Los resultados sugieren que el crecimiento de V. parahaemolyticus y la ocurrencia de genes patogénicos a 7 °C involucran cambios en la expresión génica como una respuesta al estrés por frío. Esto contribuye a la sobrevivencia y virulencia de V. parahaemolyticus, lo cual representa un riesgo a la salud pública.

Palabras clave: Vibrio parahaemolyticus; ostión; patogenicidad; refrigeración; México.

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Abstract

Objective. To quantify Vibrio parahaemolyticus densities in American oyster (Crassostrea virginica) under cold storage.

Materials and methods. 320 oysters were stored at 7°C for nine days and total and pathogenic densities were determined by the NMP-PCR methodology.

Results. V. parahaemolyticus tlh+ densities were observed on 0,3, and 6 days of storage at 1.134, 2.764 and 0.785 log₁₀NMP/g, respectively, and pathogenic density trh+ on 0 and 3 days at 0.477 and 0.519 log₁₀NMP/g, respectively; the pathogenic densities tdh+ (0.519 log₁₀NMP/g), tdh+/trh+ (0.519 log₁₀NMP/g), and tdh+orf8+ (-0.444 log₁₀NMP/g) were detected on day 3 of storage.

Conclusion.The results suggest that V. parahaemolyticus growth and pathogenic genes occurrence at 7°C involve changes in the genetic expression as a cold shock response, favoring V. parahaemolyticus survival and virulence, representing a health risk.

Key words: Vibrio parahaemolyticus; oyster; pathogenicity; refrigeration; Mexico.

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Vibrio parahaemolyticus es una bacteria halofílica autóctona y abundante en ecosistemas marinos y estuarinos, distribuida en todas las aguas costeras del mundo y asociada con varias especies de mariscos comestibles.¹ Ha sido reconocida como uno de los patógenos emergentes de transmisión alimentaria más importante y agente causal principal del incremento en brotes de infección por el elevado consumo de pescados y mariscos crudos, mal cocidos o mal manipulados, particularmente ostiones.^2-4 V. parahaemolyticus causa gastroenteritis aguda, caracterizada por náuseas, vómitos, calambres intestinales y fiebre baja con un periodo de incubación de 4 a 96 h. La diarrea inflamatoria es generalmente acuosa y en ocasiones sanguinolenta.⁵ La septicemia y la muerte ocurren raramente, sin embargo, la infección puede causar septicemia y ser fatal en pacientes con condiciones médicas preexistentes como daño hepático y renal, diabetes o trastornos del sistema inmune.⁶

El mecanismo de infección al hombre por V. parahaemolyticus no está completamente definido. Diversos estudios señalan que su patogenicidad está relacionada con cepas que producen dos hemolisinas: una hemolisina directa termoestable (TDH) que causa la disrupción de los microdominios lipídicos, lo que favorece la invasión bacteriana, codificada por el gen tdh. y la hemolisina termoestable relacionada (TRH), codificada por el gen trh, el cual presenta una secuencia nucleótida 68% homologa con el gen tdh y que desempeña un papel significativo en la enfermedad.⁸'⁹ Mientras que ambos genes son marcadores patogénicos, el gen tlh (hemolisina termolábil) es un marcador especie-específico para V. parahaemolyticus.¹⁰ Los estudios realizados en diferentes regiones del mundo han mostrado que los genes tdh y trh están presentes en 90-99.8% de los aislamientos de las cepas clínicas, mientras que solamente de 0.2 a 10% de los aislamientos ambientales son potencialmente patogénicos.¹¹'¹² Asimismo, se han reportado cepas pandémicas del serotipo V. parahaemolyticus O3:K6 en muestras clínicas y ambientales. Los serotipos más infecciosos contienen la secuencia distintiva toxRS_new (operón que contiene una secuencia única que codifica proteínas reguladoras de genes asociados con virulencia), así como los genes tdh y orf8 (fago filamentoso asociado) con la ausencia del gen trh.^13,14 Estas cepas pandémicas han sido reportadas en muestras ambientales y clínicas de diversos países como Asia¹⁶, Japón, India y Bangladesh,^17-19 España, Italia y Francia,¹²'²⁰'²¹ Estados Unidos,¹⁴ Chile y México.^22,15 Esta diseminación actual se ha vinculado con brotes de enfermedades humanas causadas por V. parahaemolyticus debido a un incremento de cepas más patogénicas y pandémicas, lo cual, a su vez, se ha relacionado con la elevación de la temperatura superficial del mar en las zonas costeras del mundo.¹ Estas infecciones pueden persistir durante el año en las zonas tropicales.²³

En México, los ostiones son moluscos muy populares con una alta demanda, por lo que son cosechados intensivamente en las diversas lagunas y esteros, entre las que destaca el Sistema Laguna Mandinga (SLM). En 2013, Veracruz produjo 45% (19 422 ton) de la producción nacional de ostión (42 945 ton).²⁴ Debido a que la calidad del ostión decae rápidamente, la industria ha buscado procesos para minimizar la ocurrencia de patógenos y extender su vida de anaquel, entre los que destacan la refrigeración, comúnmente utilizada para preservar los ostiones en concha y en pulpa.²⁵ La norma NOM-242-SSA1-2009²⁶ establece que los ostiones deben mantenerse en refrigeración a 7 °C hasta por siete días para asegurar la calidad para su consumo. Sin embargo, la inocuidad de los ostiones puede estar comprometida debido a que las cepas de V. parahaemolyticus varían en su habilidad para sobrevivir y crecer bajo temperaturas de refrigeración. V. parahaemolyticus enfrenta las bajas temperaturas modificando diversos parámetros celulares, fenómeno conocido como respuesta al shock por frío.²⁷ Los resultados de estudios recientes de los autores de este artículo muestran las mayores densidades de cepas patogénicas durante primavera e invierno.²⁸ Dados la capacidad de V. parahaemolyticus de adaptarse a bajas temperaturas y el riesgo a la salud que representa la presencia de este patógeno en el ostión debido a su consumo en crudo, el presente trabajo tuvo por objeto evaluar la presencia de las densidades totales (tlh+) y patogénicas (tdh+, trh+, orf8+) de V. parahaemolyticus en ostión americano (Crassostrea virginica) durante el almacenamiento refrigerado a 7 °C, para determinar el efecto de esta temperatura en el crecimiento y sobrevivencia de V. parahaemolyticus por el riesgo a la salud pública que su consumo representa.

 

Material y métodos

Área de estudio y colección de muestras. El proyecto del que formó parte este estudio fue evaluado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y está en acuerdo con la Norma Oficial Mexicana NMX-FF-001-SCFI-2009²⁹ para productos de la pesca y la acuacultura-ostión en concha vivo. Los ostiones se recolectaron de bancos en producción de un área de extracción ostrícola cercana a asentamientos humanos ubicados en la Laguna Grande del SLM durante enero y marzo de 2013. El SLM se ubica en el suroeste del estado de Veracruz y fluye de forma paralela a la costa del Golfo de México entre 19°02' N y 96°06' W en Alvarado, Veracruz, México.³⁰ El clima de la región es tropical, la época de secas comprende parte del invierno y la primavera (temperatura promedio 24.4°C); la época de lluvias incluye el verano y parte del otoño (temperatura promedio 25.2°C), y la estación de nortes comprende parte del otoño y el invierno (temperatura promedio 20.0°C).³¹

En la estación de invierno, mediante buceo, se recolectó un total de 320 ostiones vivos de tamaño medio legal (7-8 cm de largo NMX-FF-001-SCFI-2011),²⁹ que se transportaron al laboratorio en hieleras.³² Se lavaron y eliminaron los balanos y residuos de algas adheridas a las conchas y se descartaron los animales muertos. Posteriormente, 80 ostiones se depositaron en cuatro contenedores y se almacenaron a 7 °C de acuerdo con la NOM-242-SSA1-2009.³³

Enumeración de Vibrio parahaemolyticus. Los ostiones se analizaron por duplicado a los 0, 3, 6 y 9 días de almacenamiento. La metodología empleada para el aislamiento y cuantificación de V. parahaemolyticus se realizó por NMP-PCR (número más probable - reacción en cadena de la polimerasa) de acuerdo con Flores y colaboradores.²⁸ Los aislamientos presuntivos de V. parahaemolyticus se confirmaron mediante la presencia del gen tlh especie-específico. La presencia del gen tlh y de los genes tdh y trh se determinó mediante PCR multiplex según Bej y colaboradores⁸ y la presencia del gen orf8 se determinó por separado de acuerdo con Myers y colaboradores.¹⁴ Las secuencias de los iniciadores empleados se presentan en el cuadro I. Las densidades no patogénicas, patogénicas y potencialmente pandémicas de V. parahaemolyticus fueron calculadas usando los resultados positivos de PCR después de la confirmación de las colonias presuntivas, empleando las tablas del NMP correspondientes al intervalo de confianza a 95% y los resultados se expresaron como V. parahaemolyticus NMP/g de ostión.³⁴

Figura 1

Análisis estadístico. Los valores de NMP de las densidades de V. parahaemolyticus se transformaron en log₁₀ y se analizaron por Anova para detectar diferencias a través del tiempo de almacenamiento. Para fines estadísticos, las muestras indeterminadas (ND = no detectado) se consideraron como la mitad del límite de detección en el ostión (0.15 NMP/g). El análisis estadístico se realizó mediante el software estadístico XLSTAT 2014 versión 2.05 (Addinsoft SARL) a un nivel de significancia de p< 0.05.

 

Resultados

Las figuras 2 y 3 muestran la amplificación de los genes no patogénicos tlh+, patogénicos tdh+, trh+, tdh+/trh+ y potencialmente pandémico orf8+ de V. parahaemolyticus aislados de ostiones almacenados a 7 °C.

En el cuadro II se presentan las densidades totales, patogénicas y potencialmente pandémicas del V. parahaemolyticus encontradas durante el almacenamiento a 7 °C durante nueve días. Las muestras del tiempo 0 (ostiones frescos) mostraron una densidad media de V. parahaemolyticus tlh+ de 1.134 log₁₀ NMP/ g y el gen patogénico trh+ de 0.477 log₁₀ NMP/ g. A los tres días de almacenamiento, la densidad media de V. parahaemolyticus tlh+ se incrementó significativamente a 2.764 log₁₀NMP/g y se detectaron densidades de genes patogénicos tdh+, tdh-/trh+ y tdh+/trh+ en 0.519 log₁₀NMP/g, respectivamente, y tdh+/orf8+ en -0.444 log₁₀ NMP/g. Al día seis de almacenamiento, la densidad de V. parahaemolyticus tlh+ disminuyó significativamente a 0.785 log₁₀NMP/ g y no se detectó la presencia de genes patogénicos (-0.824 log₁₀ NMP/g). Al día nueve de almacenamiento, no se detectó la presencia de V. parahaemolyticus tlh+ ni de cepas potencialmente patogénicas.

 

Discusión

La amplificación de los genes no patogénicos tlh+, patogénicos tdh+ y trh+ y potencialmente pandémico orf8+ de V. parahaemolyticus aislados de ostiones almacenados a 7 °C representa un problema de salud debido al riesgo potencial por el consumo de ostión crudo en la región.

Las densidades detectadas de V. parahaemolyticus tlh+ y trh+ al inicio del almacenamiento (tiempo 0) (1.133 y 0.477 log₁₀ NMP/ g) fueron similares a las reportadas en la época de invierno por Flores y colaboradores²⁸ en 2012 en la misma zona de extracción y estación del año, con densidades de V. parahaemolyticus tlh+, tdh+ y orf8+ de 1.477, 1.197 y 0.773 log₁₀ NMP/g, respectivamente. El aislamiento de V. parahaemolyticus en dos años consecutivos indica que la bacteria es endémica en el SLM. Se ha reportado que las densidades totales y patogénicas de V. parahaemolyticus en el ambiente son significativamente más altas en primavera y en verano que en invierno.³⁵ Las densidades patogénicas de V. parahaemolyticus trh+ detectadas durante el invierno sugieren que estas cepas son tolerantes a las bajas temperaturas y su ocurrencia en el ostión es probablemente debido a que la temperatura del agua en el SLM en invierno (25.7 °C) es adecuada para el crecimiento de V. parahaemolyticus, considerando que la temperatura mínima de crecimiento de la especie es 5 °C.³⁶ Los vibrios de interés clínico son aislados con menor frecuencia cuando la temperatura de los ambientes acuáticos es menor de 10 °C.⁶ La producción de estos factores de virulencia está regulada fuertemente por la temperatura, por lo que son inducidos cuando la temperatura del agua es >20 °C,³⁷ como se presenta regularmente a lo largo del año en las aguas tropicales.²⁸ Deepanjali y colaboradores²³ observaron que la temperatura del agua en las regiones costeras tropicales de India (25-35 °C) fue siempre óptima para el crecimiento de V. parahaemolyticus en los ostiones.

Como se aprecia en el cuadro II, a los tres días de almacenamiento, la densidad de V. parahaemolyticus tlh+ y trh+ se incrementó y se detectaron los genes tdh+, tdh+ / trh+ y tdh+ / orf8+, los cuales no fueron detectados al inicio del almacenamiento. Estos resultados indican que la presencia de los genes patogénicos después de un descenso en la temperatura desempeña un papel en la adaptación para crecer a bajas temperaturas. Wu³⁸ reportó que las cepas de V. parahaemolyticus en el ostión almacenado a 5 °C durante 10 días sobrevivieron pero no crecieron, mientras que a 8 °C las cepas sobrevivieron y crecieron Otro estudio demostró que, si la temperatura del agua del área de cosecha era >20 °C, la densidad media era mayor, observándose un descenso significativo (0.8 log UFC / g) de V. parahaemolyticus en el ostión naturalmente contaminado después de 14 días a 3 °C³⁹ Los estudios de Burnham y colaboradores⁴⁰ indican que la sensibilidad al estrés por frío depende principalmente de la temperatura, la cepa y la duración del almacenamiento.

Los escasos estudios realizados a la fecha sugieren que V. parahaemolyticus exhibe respuestas fisiológicas complejas a una reducción abrupta en la temperatura, que involucran un patrón de expresión génica denominado respuesta al shock o estrés por frío, y que involucra la inducción de proteínas de shock por frío y proteínas de acondicionamiento al frío. Esta respuesta incrementa la sobrevivencia abajas temperaturas mediante un proceso dependiente de la translación^27,41 Yang y colaboradores²⁷ reportaron la sobrerregulación de cinco genes (VP2536, VP0446, VP0372, VP3048 y VP2536) que codifican hemolisinas en V. parahaemolyticus aunque no observaron cambios transcripcionales en las hemolisinas TLH y TDH, por lo que los resultados del presente estudio indican que la ocurrencia de los genes patogénicos detectados en el día 3 a 7 °C involucra cambios en la expresión génica como una respuesta al estrés por frío, lo que contribuye a la virulencia y sobrevivencia de V. parahaemolyticus. Estos resultados son preocupantes, especialmente si se considera el extendido uso de bajas temperaturas para almacenar y conservar los ostiones y otros mariscos.

Al día seis del almacenamiento solamente se detectó la ocurrencia de V. parahaemolyticus tlh+ y al día nueve no se detectó crecimiento de ninguna cepa, lo cual podría indicar un efecto represor catabólico de la temperatura sobre el crecimiento de V. parahaemolyticus. Las razones pueden ser la muerte celular, o bien, que al descender la temperatura en el ostión, las células de V. parahaemolyticus entraron en un estado viable pero no cultivable (VBNC); la habilidad de producir hemolisinas no se ve afectada por el estado VBNC, por lo que, cuando las condiciones vuelvan a ser las adecuadas como al interior de un huésped, pueden manifestar nuevamente su virulencia.⁴² Mizunoe y colaboradores⁴³ observaron que células de V. parahaemolyticus sometidas a 4 °C alcanzaron el estado VNBC en 12 días y señalaron que no se puede depender de la temperatura de refrigeración para destruir microorganismos, aun bajo la temperatura adecuada. En este contexto, la habilidad de V. parahaemolyticus para crecer a 7 °C, la presencia de genes patogénicos y la resistencia al frío de las células VBNC deben llamar la atención del riesgo que V. parahaemolyticus representa para la industria ostrícola.

La norma oficial NOM-242-SSA1-2009³³ establece que el límite máximo de V. parahaemolyticus en los moluscos bivalvos debe ser 10⁴ NMP/g de muestra. Incluso cuando las densidades de V. parahaemolyticus tlh+ detectadas en los ostiones cumplen con la regulación, la presencia de cepas potencialmente patogénicas representa un riesgo a la salud pública y, más aún, no están consideradas en la regulación Por ende, el uso de las densidades totales de V. parahaemolyticus como un indicador de contaminación es incierto, especialmente para detectar la posibilidad de un incremento en la virulencia y estimar el riesgo del crecimiento postcosecha.

Por lo anterior, los resultados de este estudio son alarmantes debido a que las especies patogénicas deben estar ausentes en el ostión para que éste se considere apto para su consumo. Cabe señalar que la presencia de V. parahaemolyticus patogénico es suficiente para poder generar afectaciones importantes a la salud humana debido al cuadro clínico que desencadenan y al crecimiento exponencial en el huésped. La variedad patogénica de V. parahaemolyticus orf8+, gen que codifica una proteína de adherencia que incrementa la habilidad del patógeno para adherirse a las células intestinales o la superficie del plancton,^44,45 ha sido relacionada con el serotipo pandémico más infeccioso, el O3:K6, lo que implicaría un alto riesgo de un brote de la enfermedad como ya ha sucedido en otras regiones del mundo.³⁶

 

Conclusiones

Durante el almacenamiento refrigerado a 7 °C se observó un incremento de las densidades de V. parahaemolyticus no patogénico desde el inicio hasta el día 6 de almacenamiento y la detección de densidades patogénicas en el tercer día, lo que indica que estas cepas podrían estar mejor adaptadas a las bajas temperaturas. Los presentes resultados indican que la refrigeración por sí misma no limita el crecimiento de este patógeno y que existen diferentes comportamientos en respuesta al frío específicos de las cepas de V. parahaemolyticus, los cuales varían en su habilidad para sobrevivir y crecer bajo esta temperatura de refrigeración. Esto impacta en la inocuidad del alimento.

Aun cuando las densidades totales de V. parahaemolyticus en los ostiones cumplieron con las regulaciones mexicanas, la presencia de las cepas patogénicas representa un problema de salud pública, especialmente porque no están incluidas en la regulación vigente, por lo que ambas deberían ser monitoreadas.

Debido a que sólo una pequeña proporción del ostión en el mercado mexicano es actualmente sujeta a cualquier proceso postcosecha, es necesario modificar los métodos de conservación para limitar el crecimiento de V. parahaemolyticus en los ostiones que aseguren su inocuidad. Más aún, a pesar de su percepción nutritiva y saludable, el ostión está clasificado como un alimento de alto riesgo a nivel mundial, por lo que la vigilancia de V. parahaemolyticus en los moluscos bivalvos es crucial para generar datos más confiables para estimar riesgos, comprender mejor los cambios en el riesgo por el consumo de este tipo de alimento y para proteger la salud pública.

 

Agradecimientos

El presente trabajo se realizó en el marco del programa del Conacyt de Apoyos Complementarios para la Consolidación Institucional de Grupos de Investigación, modalidad de Retención, con número de expediente 173957. Los autores agradecen al Dr. Leonardo Lizárraga-Partida y al grupo VibrioMex por proveer los controles CAIM 1772, CAIM 1400 y CAIM 610, necesarios para la realización de las pruebas moleculares.

 

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Fecha de recibido: 16 de octubre de 2014
Fecha de aceptado: 18 de marzo de 2015

 

Autora de correspondencia:
Dra.Violeta T. Pardío Sedas.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
Universidad Veracruzana. Av. Miguel Ángel de Quevedo s/n,
col. Unidad Veracruzana. 91710
Veracruz,Veracruz, México.
Correo electrónico: vpardio@uv.mx, vpardio@yahoo.com.mx

 

Declaración de conflicto de intereses. Los autores declararon no tener conflicto de intereses.