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Introducción
De acuerdo con la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición de 2012, en México hay 8874 personas de 60 años o más, lo que significa 9.2 % de la población estimada del país; mientras que para 2050 se estima que los adultos mayores conformarán cerca de 28.0 % de la población.1 Respecto a la salud bucal de los pacientes, el edentulismo es la pérdida total de todos los dientes naturales que causa dificultades de la masticación y provoca deficiencias nutricionales, aislamiento social y depresión.2 El edentulismo provoca que los pacientes requieran el uso de prótesis, lo que los predispone a infecciones como estomatitis subprotésica por la colonización de Candida albicans, la cual en México tiene una prevalencia de 65 %.3 Los microorganismos del género Candida son un grupo de levaduras con comportamiento oportunista que forman parte del ecosistema de la mucosa bucal;4 Candida albicans es la especie más común.
Por otra parte, el material con el que se confeccionan las prótesis totales o dentaduras es la resina acrílica de polimetil metacrilato (PMMA), porque presenta propiedades fisicoquímicas deseables, pero requiere higiene constante para evitar la acumulación de microorganismos.5 Además, existen múltiples factores predisponentes de candidiasis como reducción del flujo salival, uso de corticosteroides, prótesis bucales desajustadas, malnutrición, desórdenes endocrinos e inmunitarios, entre otros.6
Actualmente no existe un biomaterial comercial para dentaduras con efecto antimicrobiano; sin embargo, en odontología el uso de nanopartículas es una tecnología de frontera que puede modificar sustancialmente las propiedades físicas, químicas y biológicas de los materiales, por lo que el propósito de la presente investigación fue conocer las especies de Candida más prevalentes en pacientes portadores de prótesis mexicanos, así como evaluar el efecto antifúngico contra Candida albicans de una resina acrílica experimental con nanopartículas de plata para aplicación en dentaduras y la biocompatibilidad en un modelo animal.
Métodos
Se llevó a cabo un estudio transversal en una primera fase para determinar las características sociodemográficas de los pacientes y la prevalencia de especies de Cándida Se eligieron por conveniencia 140 pacientes de 60 años y más que acudieron a la Clínica de Odontología de la Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León, Universidad Nacional Autónoma de México, durante 2019. A todos se les realizó historial clínica y se recolectó información sobre variables sociodemográficas como edad, sexo, estado civil y lugar de origen. También se registró si los pacientes eran usuarios o no de prótesis dentales.
Toma de muestras para identificación de Candida
Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado antes de iniciar la toma de muestra de la mucosa. La obtención de muestras de la mucosa palatina se efectuó bajo condiciones de asepsia con kit Stuart® (Thermo Fisher Scientific, España) para colección y transporte de muestras biológicas. Cada tubo se rotuló y selló para su transportación al laboratorio. Las muestras fueron sembradas en cajas de petri con CHROMagar Candida, para lo cual se empleó el método de estriado; posteriormente se incubaron a 35 ± 2 °C durante 48 horas. Se realizó el registro de resultados de acuerdo con la coloración de cada muestra, con base en las especificaciones del medio del contraste: colonias pintadas de verde, Candida albicans; colonias en rosa, Candida krusei; colonias en azul, Candida tropicalis. Se reportan los resultados de pacientes con y sin prótesis que presentaron o no crecimiento de las diferentes especies de Candida, conforme al análisis estadístico de χ2.
Resina acrílica experimental y nanopartículas de plata
Se utilizó una resina acrílica de PMMA sintetizada en el Laboratorio de Investigación Interdisciplinaria donde se llevó a cabo el estudio. El PMMA es un acrílico rosa formado de partículas esféricas de 10 a 30 μm desarrollado por Acosta Torres et al., cuya síntesis y caracterización se publicó en 2014.7 Las nanopartículas de plata (AgNP) fueron sintetizadas en el mismo laboratorio y por el mismo grupo de investigación, cuya formulación se publicó en 2011.8 Estas nanopartículas tienen morfología semiesférica de 20 a 50 nm. El PMMA con o sin nanopartículas de plata ha sido previamente evaluado en cultivos con fibroblastos gingivales humanos a las 24 y 48 horas, sin que se hayan reportado efectos citotóxicos ni diferencias significativas con el grupo control.7
Elaboración de muestras de PMMA y PMMA-AgNP
Se fabricaron discos de resina acrílica de PMMA y PMMA-AgNP (0.2 μg/mL de AgNP), de 10 mm de diámetro × 2 mm de espesor7 para realizar las pruebas de efecto antifúngico y biocompatibilidad en un modelo animal (n = 10). Las muestras fueron lavadas y esterilizadas en luz ultravioleta durante 10 minutos.
Evaluación del efecto antifúngico
Biopelículas de Candida albicans (ATCC 90026) fueron depositadas sobre discos de PMMA y PMMA-AgNP y observadas mediante microscopia confocal de barrido láser (Leica SP5®). Las muestras de acrílico se tiñeron durante 15 minutos antes de la obtención de imágenes con el colorante Live/dead BacLightTM preparado con 1 mL de agua destilada estéril, 1 mL de colorante de ácido nucleico fluorescente verde SYTOTM 9, 1 mL de fluorescente rojo tinción con ácido nucleico y yoduro de propidio.
Biocompatibilidad en un modelo animal
Mediante procedimiento quirúrgico se realizó el implante de discos de PMMA y PMMA-AgNP en el dorso de 30 ratas Wistar, para valorar su efecto a los 15 y 45 días (n = 15). Como grupo control se utilizaron 15 ratas Wistar a las que no se les implantó ningún disco. Transcurrido cada periodo de tiempo, se sacrificó a los animales y se obtuvieron muestras para biopsia de los tejidos circundantes de la zona del implante de los discos acrílicos, de acuerdo con la ISO 10993-6.9 Se prepararon las muestras para su procesamiento histológico, se montaron en bloques de parafina, se realizaron los cortes con micrótomo y la tinción con hematoxilina-eosina, para la observación con microscopio óptico.10
Consideraciones éticas
El protocolo para la toma de muestras del paladar de los pacientes fue aprobado por la Comisión de Ética en Investigación de la Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León (CE_17/009); se obtuvo la participación voluntaria de los pacientes. El protocolo para el ensayo en modelo animal fue aprobado por la Comisión de Ética de la misma escuela (CEI.19_033_S8E).
Resultados
De los 140 pacientes valorados, 63.6 % correspondió al sexo femenino. La edad media fue de 69 años (60 a 92 años). La distribución por estado civil mostró que 66.4 % fue casado y 33.6 %, soltero. Por el estado de origen, 66.4 % de los pacientes nació en Guanajuato y 33.63 % en otro estado de la República.
Se encontraron 48 pacientes portadores de prótesis, 21 con prótesis parcial y 27 con prótesis total (dentadura). Candida albicans se encontró en 65.1 % de los pacientes, por lo cual constituyó la especie más prevalente. De acuerdo con los datos mostrados en la Tabla 1, se infirió que no existieron diferencias estadísticas significativas entre los pacientes positivos a Candida albicans si portaban o no prótesis. El mismo comportamiento se presentó en los pacientes portadores y no portadores de prótesis que resultaron positivos a Candida tropicalis. Sin embargo, se encontró diferencia significativa en los pacientes positivos a Candida krusei cuando usaban o no una prótesis dental, lo que mostró que el uso de prótesis favorece la proliferación de este microorganismo.
Tabla 1 Total de pacientes portadores y no portadores de prótesis dentales que mostraron Candida albicans, tropicalis o krusei
| Portación o no de prótesis | Pacientes con Candida (%) | |||
|---|---|---|---|---|
| Total (n) | albicans | tropicalis | krusei | |
| Pacientes portadores de prótesis parciales o totales | 48 | 35.4 | 16.7 | 31.3 |
| Pacientes no portadores de prótesis | 92 | 29.7 | 16.7 | 12.2 |
| Χ2 = 0.480, p = 0.489 | Χ2 = 0.018 , p = 0.892 | Χ2 = 7.412, p = 0.006 | ||
Evaluación del efecto antifúngico
Las imágenes de microscopia confocal muestran las superficies de los discos de PMMA y PMMA-AgNP en 2.5 D. En el grupo con PMMA se observaron células de Candida albicans en verde, que indica su viabilidad (Figuras 1A y 1B). El grupo con PMMA-AgNP muestra fluorocromos verdes y rojos; el color rojo es indicativo de células muertas de Candida albicans (Figuras 1C y 1D).
Evaluación histológica de PMMA y PMMA-AgNP en un modelo animal
Los cortes histológicos evaluados evidencian la presencia de una pseudocápsula asociadas al nicho del material implantado; se observó una reacción inflamatoria de predominio linfoplasmocitario, discreta, controlada y limitada a la cápsula; así como células gigantes multinucleadas aisladas, lo que denota la biocompatibilidad del material utilizado.
La Figura 2 muestra las imágenes microscópicas de las células de infiltrado inflamatorio crónico y las células gigantes como prueba de la reacción a cuerpo extraño. Después de analizar el comportamiento celular de las muestras animales (Tabla 2), es posible decir que después de 45 días se observó 100 % de inflamación mixta de severidad leve y que en 90 % estaban ausentes las reacciones a cuerpo extraño. Por lo anterior, el material desarrollado se considera biocompatible al ser evaluado en un modelo animal y viable para aplicación en la siguiente etapa de valoración clínica.
Figura 2 Análisis microscópico de las muestras histológicas tomadas de las ratas Wistar después de haber sido expuestas a la resina acrílica experimental. A) El tejido en contacto con PMMA muestra infiltrado inflamatorio crónico de predominio linfoplasmocitario (flechas). B) El tejido en contacto con PMMA-AgNP muestra reacción a cuerpo extraño, células gigantes aisladas (flechas). PMMA = polimetil metacrilato, PMMA-AgNP = polimetil metacrilato con nanopartículas de plata.
Tabla 2 Descripción del análisis histopatológico de las muestras obtenidas de los animales a los 15 y 45 días de exposición a PMMA y PMMA-AgNP
| Característica | 15 días | 45 días | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Control | PMMA | PMMA-AgNP | Control | PMMA | PMMA-AgNP | |
| Tipo de inflamación | Ausente | 80 % crónica | 60 % mixta | Ausente | 100 % mixta | 90 % mixta |
| Severidad | Células inflamatorias no detectadas | 40 % moderada, 40 % leve | 60 % moderada, 20 % severa | Células inflamatorias no detectadas | 60 % leve | 50 % leve |
| Extensión | Células inflamatorias no detectadas | 90 % limitada a la cápsula | 90 % limitada a la cápsula | Células inflamatorias no detectadas | 100 % limitada a la cápsula | 100 % limitada a la cápsula |
| Reacción a cuerpo extraño | Ausente | 70 % presente | 80 % presente | Ausente | 100 % ausente | 90 % ausente |
PMMA = polimetil metacrilato, PMMA-AgNP = polimetil metacrilato con nanopartículas de plata.
Discusión
La población mexicana que acude a las clínicas universitarias presenta alta prevalencia (65.1 %) de Candida albicans. En relación con el uso de prótesis, Bianchi CM et al., en 2016, realizaron un estudio en el que aislaron diferentes especies de Candida; encontraron que las personas de edad avanzada con prótesis removibles presentaron una probabilidad 4.4 veces mayor de aislamiento de Candida que las personas que no las usaban (IC 95 % = 1.65-11.4).11 En contraste con el presente estudio, únicamente comprobamos la relación con el uso de prótesis con Candida krusei, probablemente debido a que solo 48 personas de la muestra total refirió usar prótesis.
El acrílico desarrollado con nanopartículas de plata cuenta con efecto antifúngico que inhibe Candida, lo que caodyuvará en el tratamiento cuando el paciente presente estomatitis subprotésica y posiblemente no tenga necesidad de tomar un tratamiento farmacológico adicional. En otros estudios, las nanopartículas de plata también han mostrado efecto antimicrobiano, sin ser tóxicas cuando tienen un tamaño de 20 a 50 nm, y constituyen una posible alternativa al uso de antibióticos sin causar resistencia microbiana.12 Los reactivos utilizados para sintetizar las nanopartículas de plata son de bajo costo, por lo que esta opción podría estar al alcance de todos los pacientes. La resina acrílica propuesta es de fácil manipulación y disponible para los odontólogos y técnicos dentales que elaboran dentaduras, ya que el material puede reducir de forma directa la colonización microbiana y servir como un agente para prevenir las infecciones orales en adultos mayores.
Conclusiones
Se desarrolló una resina acrílica para dentaduras, a base de micropartículas de PMMA adicionado con nanopartículas de plata, como propuesta para los pacientes edéntulos que presenten infecciones por Candida. El PMMA con nanopartículas de plata tiene efecto antifúngico en la inhibición de Candida albicans. Las pruebas previas in vitro del PMMA y PMMA-AgNP indican que el material es no citotóxico, por lo que se consideró realizar un estudio in vivo no invasivo colocando la resina acrílica experimental en un modelo animal, lo que resultó biocompatible al evaluar el efecto en los tejidos vivos, por lo que se considerará proponer el producto para valoración clínica en pacientes.
