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Introducción
La prueba biológica estándar de la rabia recomendada desde hace mucho tiempo por la Organización Mundial de la Salud es el aislamiento y amplificación del virus inoculando camadas de ratones de alrededor de tres días de nacidos.1 El uso de animales lactantes fue establecido debido a su mayor susceptibilidad, ya que su sistema inmune no está completamente desarrollado.1
Actualmente, por el bienestar animal, los organismos internacionales han recomendado abandonar gradualmente la utilización de ratones y limitarse a la utilización de cultivos celulares. Sin embargo, la prueba biológica es aún práctica común, pues además de aislar e incrementar el título viral permite reproducir los postulados de Koch.
En México, las campañas de vacunación antirrábica canina han sido exitosas y desde 2005 no se han registrado casos de rabia humana transmitida por perros. De 2000 a 2018 se presentaron 52 casos de rabia humana, de los cuales 48 (92 %) fueron transmitidos por animales silvestres (quirópteros y mustélidos principalmente) y solo cuatro (8 %) por perro (Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, datos no publicados). Esto hace necesario estudiar más la permanencia y diseminación del virus de la rabia (VR). En la fauna silvestre, las peleas intra e interespecies, el aseo comunitario, compartir la alimentación por regurgitación y la secreción de aerosoles parecen ser vías de diseminación del virus.
El objetivo de esta investigación fue constatar si el contagio cría-madre podría ser un medio de diseminación viral al realizar la prueba biológica de VR con varias muestras de un banco histórico, para lo cual se alargó el periodo de observación de las madres (hasta 60 días).
Método
Se trabajaron 27 muestras de VR procedentes de diferentes lugares de México y de distintas especies (Tabla 1).
Tabla 1 Resultados de la observación durante 60 días de las madres de ratones BALB/C lactantes inoculados con diferentes aislados mexicanos del virus de la rabia
| Especie | Lugar | Año de recolección | Variante antigénica en los ratones | Número de ratones lactantes en la camada | Mortalidad por rabia en la camada* | Transmisión de rabia a la madre | Canibalismo** | Variante antigénica en la madre | Seroconversión de las madres sobrevivientes (60 días) *** |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Humano | Ciudad de México | 1991 | 1 | 5 | 5 | 0.25 | |||
| Bovino | Chiapas | 1991 | 3 | 4 | 4 | 0 | |||
| Bovino | Chiapas | 1994 | 3 | 3 | 2 | 1 | 0 | ||
| Bovino | Estado de México | 1994 | 11 | 5 | 5 | 0 | |||
| Bovino | Puebla | 1994 | 1 | 3 | 3 | 0 | |||
| Bovino | Veracruz | 1991 | 11 | 9 | 9 | Positiva | 11 | ||
| Bovino | Hidalgo | 1995 | 11 | 8 | 8 | 0 | |||
| Bovino | Morelos | 1994 | 11 | 9 | 9 | Positiva | 11 | ||
| Caprino | Michoacán | 1991 | 3 | 2 | 2 | 0 | |||
| Caprino | Puebla | 1990 | ND | 5 | 4 | 0 | |||
| Caprino | Tlaxcala | 1991 | 1 | 6 | 6 | 0 | |||
| Ovino | Estado de México | 1994 | 11 | 7 | 7 | 0 | |||
| Ovino | Estado de México | 1994 | 11 | 6 | 6 | 0 | |||
| Equino | Michoacán | 1991 | 3 | 5 | 4 | 1 | 0 | ||
| Equino | Ciudad de México | 1994 | 1 | 4 | 4 | 0 | |||
| Equino | Puebla | 1990 | 3 | 6 | 6 | 0 | |||
| Porcino | Ciudad de México | 1994 | 1 | 1 | 1 | 0 | |||
| Porcino | Ciudad de México | 1994 | 1 | 9 | 7 | Positiva | 1 | ||
| Perro | Durango | 1991 | 1 | 5 | 5 | 0 | |||
| Perro | Oaxaca | Sin fecha | 1 | 8 | 8 | 0 | |||
| Perro | Puebla | Sin fecha | 1 | 4 | 4 | 0 | |||
| Gato | Michoacán | 1991 | 1 | 4 | 4 | 0 | |||
| Gato | Jalisco | 1990 | ND | 6 | 4 | 1 | 0.28 | ||
| Gato | Tlaxcala | 1990 | 1 | 6 | 6 | 0 | |||
| Gato montés | Chihuahua | Sin fecha | 7 | 6 | 6 | 0 | |||
| Gato montés | Sonora | 1990 | 7 | 1 | 1 | 1.39 | |||
| Zorrillo | BCS | 1991 | 10 | 4 | 4 | 0 |
*Número de ratones lactantes muertos por rabia.
**Número de ratones lactantes muertos por canibalismo.
***IU: Unidades Internacionales.
Todas las madres fueron seronegativas contra la rabia antes de la inoculación de los ratones lactantes.
Se inocularon camadas de ratonas BALB/C de cuatro a siete días de edad, una camada por muestra (n = 27), siguiendo la metodología descrita por la Organización Mundial de la Salud para la prueba biológica,1 con algunas modificaciones. Los lactantes fueron inoculados por vía intracraneal con 0.03 mL de una suspensión al 20 % (peso/volumen) del macerado de la muestra de VR en solución amortiguadora de fosfatos. Los lactantes inoculados se dejaron con sus madres y fueron observados durante 21 días. Cada camada inoculada permaneció en condiciones de aislamiento.
Los que presentaban signos de rabia (parálisis, emaciación, pelo hirsuto, etcétera) fueron sacrificados humanitariamente, colectándose el cerebro y glándulas salivales para el diagnóstico y posterior caracterización del virus. Una vez que todos los lactantes se sacrificaron se conservaron las madres de cada camada y se mantuvieron en observación por 60 días, después de los cuales fueron sacrificadas.
El diagnóstico de rabia en los animales se llevó a cabo mediante inmunofluorescencia directa en improntas del cerebro, utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la nucleoproteína del VR, siguiendo la metodología estándar descrita por la Organización Mundial de la Salud.2
A fin de constatar si la variante antigénica de rabia con la que fueron infectadas las hembras que enfermaron era la misma que la inoculada en sus crías, se hicieron pruebas de inmunofluorescencia indirecta utilizando un panel de ocho anticuerpos monoclonales (AcM) estandarizado por el Center for Disease Control and Prevention de Atlanta, Georgia, Estados Unidos, para identificar las variantes del virus de la rabia más importantes que circulan en América Latina y el Caribe, siguiendo la metodología descrita por Díaz et al.3
Adicionalmente, se realizó la detección del ARN viral a partir de los encéfalos de los ratones lactantes y sus madres, así como de las glándulas salivales de los lactantes. La retrotranscripción se llevó a cabo empleando ARN total y el oligonucleótido correspondiente, usando la enzima Superscript® (Invitrogen). Se utilizaron los iniciadores diseñados específicamente para amplificar el gen de la nucleoproteína: Jw12* Forward 5´ ATGTAACACCYCTACAATG 3´ 55- 73 y Jw6* Reverse 5´ CARTTVGCRCACATYTTRTG 3 660-641. Los productos de amplificación por PCR se purificaron a partir de un gel de agarosa con el estuche QIAquick Gel Extraction® (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos purificados se prepararon para ser secuenciados a 25-100 fmol de producto de la reacción en cadena de la polimerasa y 3.2 pmolas de los oligonucleótidos correspondientes de cada gen.
El producto eluído se secuenció en el secuenciador Beckman Coulter Sequencing Ceq 8800 Genetic Analysis System® (Beckman Coulter).
Las secuencias se ensamblaron por concatenación y se comprobaron tanto la secuencia directa como la reversa por duplicado empleando el programa CEQ incluido en el equipo secuenciador. La edición de las secuencias, los alineamientos y la traducción nucleotídica de las secuencias se realizó con el programa BioEdit 5.0.9.4 Las secuencias se sometieron a un análisis BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/credits.html). Los alineamientos múltiples se efectuaron en el programa Clustal W.5
Las hembras lactantes que permanecieron sanas a los 60 días posinoculación (p. i.) de las crías fueron sangradas de la vena marginal de la cola, para detectar seroconversión anti-VR mediante la técnica de reducción rápida de focos fluorescentes recomendada por la Organización Mundial de la Salud.6
Resultados
Diagnóstico y caracterización del virus
En todas las camadas inoculadas con las diferentes muestras de VR hubo lactantes con signos de rabia; solo en cuatro de las 27 muestras inoculadas sobrevivieron lactantes (Tabla 1). Todos los lactantes que presentaron signos de rabia fueron positivos en la prueba de inmunofluorescencia directa y por RT-PCR. Adicionalmente, se detectó el VR por RT-PCR en las glándulas salivales de los ratones lactantes que transmitieron la enfermedad a sus madres.
Mediante la utilización del panel reducido de ocho AcM se identificaron las variantes antigénicas de perro (V1), murciélago hematófago (V3 y V11), zorro de Arizona (V7) y zorrillo Baja California Sur (V10) (Tabla 1).
En total tres (11 %) de las 27 hembras lactantes que amamantaban a las crías inoculadas presentaron signos de rabia (parálisis, pelo hirsuto, etcétera.) a los 33, 37 y 39 días p. i. de las crías. Estas hembras fueron positivas por inmunofluorescencia directa y RT-PCR. El periodo de incubación de la rabia en las crías de las hembras que presentaron signos de rabia fue de 10, 14 y 15 días, a diferencia de las 24 hembras lactantes restantes, cuyo periodo de incubación en las crías fue en promedio 6.5 días (rango 5-10 días p. i.).
Las variantes del VR detectadas con el panel de ocho AcM en las hembras que adquirieron la enfermedad fue la misma que presentaron las crías inoculadas y correspondieron: dos a la variante 11 (vampiro) y una a la 1 (perro).
Los tres VR que se transmitieron de los lactantes a sus madres provenían de especies no reservorios (dos bovinos y un cerdo). El análisis de secuenciación de un fragmento del gen de la nucleoproteína reveló que los dos aislamientos del ganado bovino correspondían a virus de origen vampiro y el de porcino era de origen canino. Estos resultados fueron congruentes con la caracterización antigénica de los mismos. El análisis bioinformático corroboró que las hembras lactantes tenían el mismo virus que sus crías (100 % de similitud).
Prueba de anticuerpos neutralizantes contra el VR
Entre las 24 hembras lactantes que permanecieron sanas a los 60 días p. i. de sus crías, tres (12.5 %) mostraron la presencia de anticuerpos contra el VR con títulos de 0.25, 0.28 y 1.31 UI (Tabla 1). Debido a las condiciones físicas de las hembras y los lactantes enfermos no fue posible obtener sangre de estos animales.
Discusión
En este trabajo se demostró en un modelo murino la posibilidad de transmisión vertical de la rabia de los lactantes a sus madres, ya que tres de las 27 hembras que amamantaron a sus camadas infectadas con VR enfermaron y los análisis mostraron que estas tenían el mismo virus que su respectiva camada. Es probable que la inoculación del VR de los lactantes a las hembras se haya producido a través de laceraciones causadas durante la lactancia, pues los ratones neonatos poseen dientes pequeños y afilados. Se detectó el VR por RT-PCR en las glándulas salivales de los ratones lactantes que transmitieron la enfermedad a las hembras.
Un denominador común en los tres casos fue que las camadas eran numerosas (nueve individuos), por lo tanto, asumimos que esta condición aumenta las probabilidades de infección de la hembra debido a mayor contacto, aunado a que los tres casos presentaron periodos de incubación de la enfermedad largos (10 a 15 días). De acuerdo con nuestros resultados, el tamaño de la camada fue aparentemente más importante que el canibalismo, puesto que en algunas hembras lactantes se observó canibalismo y ninguna contrajo la enfermedad (Tabla 1).
Los signos de rabia en las madres infectadas aparecieron después de los 21 días de observación recomendados para la prueba biológica,1 lo que explica por qué el fenómeno no se había reportado.
Tres de las 24 hembras lactantes que estaban sanas a los 60 días p. i. de las crías presentaron seroconversión contra el VR (Tabla 1), lo que demuestra que las madres estaban siendo sometidas a estímulos con el VR por sus crías infectadas. Varios artículos muestran alta prevalencia de anticuerpos contra el VR con muy baja o nula presencia del virus, particularmente en quirópteros, hienas, zorros y también en el ser humano.7-9 Esto puede ser debido a una exposición a dosis subletales del VR.
La transmisión vertical de la rabia en el sentido madre-hijo se ha descrito como poco probable, ya que el virus se limita al tejido nervioso y no circula en la sangre. En casos humanos, Aguèmon et al.10 en 2016 describieron bebés sanos que fueron paridos por mamás con rabia que sucumbieron a la enfermedad.
Los neonatos podrían actuar como amplificadores del VR; se ha observado que dosis subletales para los adultos pueden afectar a los lactantes dada su alta susceptibilidad, además de que cepas vacunales atenuadas, inocuas para adultos, pueden enfermar a los lactantes.11 Así, podríamos establecer un mecanismo hipotético de preservación del VR en una población reservorio, en el cual los neonatos amplificarían bajas dosis de virus y podrían diseminarlo con mayor éxito entre congéneres susceptibles, en un proceso representado en la Figura 1. Apoyando esta hipótesis está el hecho de que en los quirópteros la prevalencia de anticuerpos contra los Lyssavirus coincide con la época reproductiva.12 Además, Streicker et al.,13 en 2012, llegaron a la conclusión de que la eliminación de murciélagos hematófagos adultos utilizando anticoagulantes aumentaba la diseminación del VR, al seleccionar a una población de animales jóvenes susceptibles que amplifican eficazmente el VR.
Figura 1 Hipótesis de la transmisión vertical de crías a madres. En este modelo se propone que el virus de la rabia podría conservarse en la naturaleza por medio de la transmisión de los neonatos (susceptibles de contraer la rabia, por ejemplo, vía aerosoles, y que funcionarían como amplificadores del virus) a las hembras, también susceptibles durante la lactancia.
Es necesario considerar también que en las especies que tienen la capacidad de hibernar, el periodo de hibernación mantendría al VR latente por bajas en el metabolismo, reactivándose cuando los animales retoman su actividad.12 Otro factor importante en la transmisión del virus es la presencia de anticuerpos maternos y su duración,14 que en los quirópteros parece ser corta.15 Observaciones en murciélagos hematófagos demostraron que las crías de estos animales lactan durante largos periodos (entre siete y nueve meses),16 esto puede ser importante en la transmisión del virus ya que el contacto íntimo es prolongado.
Se ha descrito que algunos aislamientos de rabia de quirópteros pueden ser virulentos por inoculación epitelial en mayor proporción que por vía intramuscular.17 En este trabajo, dos de los que causaron la muerte de las hembras procedían de quirópteros. Estas variantes podrían ser capaces de infectar epitelios. Además, los Lyssavirus pueden ingresar al sistema nervioso central vía cutánea mediante los nervios sensores.18
El fenómeno aquí descrito puede presentarse en la naturaleza y favorecer la perpetuación y establecimiento de enzootias en reservorios silvestres de Lyssavirus.
