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Gaceta médica de México

versión impresa ISSN 0016-3813

Gac. Méd. Méx vol.141 no.1 México ene./feb. 2005

 

Artículos originales

 

Toxicidad de venenos de serpientes de importancia médica en México

 

Toxicity of venoms from snakes of medical importance in Mexico

 

Adolfo R. de Roodt,* Judith Estévez–Ramírez,** Jorge F. Paniagua–Solís,*** Silvana Litwin,* Alejandro Carvajal–Saucedo,**** Jorge A. Dolab,***** Luis E. Robles–Ortiz,*** Alejandro Alagón****

 

* Área de Investigación y Desarrollo / Serpentario. Instituto Nacional de Producción de Biológicos – A.N.L.I.S. Dr. Carlos G Malbrán, Buenos Aires, Argentina.

** Investigación y Desarrollo, Instituto Bioclón S.A. de C. V., México DF, México.

*** Dirección de Investigación y Desarrollo. Laboratorios Silanes S.A de C. V., México, D.F. México.

**** Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos, México.

***** Departamento Vacunas y Sueros. Instituto Nacional de Producción de Biológicos – A.N.L.I.S. Dr. Castillo G. Malbrán, Buenos Aires, Argentina.

 

Correspondencia y solicitud de sobretiros:
Dr. Alejandro Alagón Cano,
Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México,
Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Morelos,

México, 62210.
Alagón@ibt.unam.mx
.

 

Recepción: 29 de junio de 2004 
Aceptación: 08 de julio de 2004

 

Resumen

La caracterización de las actividades tóxicas de los venenos de serpientes es necesaria para el cabal entendimiento de los procesos fisiopatológicos que se producen ante su mordedura, como también para evaluar la potencia neutralizante de los antivenenos utilizados para tratar estos envenenamientos. A causa de los pocos datos disponibles sobre la toxicidad del veneno de serpientes con importancia sanitaria en México, estudiamos las actividades tóxicas de los venenos de Bothrops asper, Athropoides nummifer, Agkistrodon billineatus> Crotalus durissus durissus, Crotalus basiliscus, Crotalus scutulatus, Crotalus atrox y Micrurus nigrocinctus. A los venenos se les realizaron los siguientes estudios: SDS–PAUE, determinación de la potencia letal, y de las actividades hemorrágica, necrotizante, coagulante en plasma y fibrinógeno, fosfolipásica y fibrinogenolítica. Se estudió además la capacidad neutralizante de un antiveneno de uso corriente para la terapéutica de las mordeduras de serpientes venenosas en México, sobre varias de estas actividades. Los venenos de vipéridos mostraron actividades hemorrágicas, necrotizante, coagulante sobre plasma, protrombínica, fibrinogenolítica y fosfolipásica importantes. Los venenos de mayor potencia letal fueron los de Micrurus nigrocinctus y Crotalus scutulatus, sin embargo el veneno que presentó en general potencias tóxicas mayores fue el de Bothrops asper. Las diferentes potencias tóxicas halladas se encontraron dentro de los márgenes descritos para especies de vipéridos y elápidos de Sudamérica. La actividad sobre el plasma y el fibrinógeno fue muy diferente en los diferentes venenos viperinos, sin embargo todos mostraron ser capaces de afectar componentes del sistema de la coagulación. El antiveneno probado no sólo neutralizó la letalidad del veneno sino también sus actividades tóxicas.

Palabras clave: Agkistrodon, Bothrops, Crotalus, serpientes, , envenomation, toxicidad, veneno, terapéutica 

 

Summary

The characterization of the toxic activities of snake venoms is necessary to understand the physiopathology of the envenomation and to test the potency of the antivenoms used to treat this pathology. Because of the lack of data on the toxic activities of venoms from Mexican snakes of medical importance, we studied the venoms from Bothrops asper, Athropoides nummifer, Agkistrodon billineatus, Crotalus durissus durissus, Crotalus basiliscus, Crotalus scutulatus, Crotalus atrox and Micrurus nigrocinctus. The studies performed were : SDS–PAOE, determination of lethal potency, hemorrhagic, necrotizing, coagulation on plasma and fibrinogen, phospholipasic and fibrinogenolytic activities. In addition we studied the neutralizing capacity of the toxic activities of an antivenom currently used for the treatment of snakebites in Mexico. The venom from viperids showed important hemorrhagic, necrotizing, coagulative on plasma, prothrombinic, fibrinogenolytic and phospholipase activities. The venoms with the highest lethal potency were those of Micrurus nigrocinctus and Crotalus scutulatus; however, the viperine venom that globally displayed the most potent toxic activities was from Bothrops asper. All the venoms showed toxic activities of similar range to those described for other American venomous snakes. The activity on plasma or fibrinogen varied widely among the different venoms but all displayed capacity to act on the coagulation system. The antivenom tested not only neutralized the lethalityB. asper venom but also its other toxic activities.

Key Words: Agkistrodon, Bothrops, Crotalus, snakes, toxity, venom, therapeutics

 

Introducción

El ofidismo en el mundo es un problema sanitario al que debe prestársele especial atención a causa de las características clínicas y situaciones epidemiológicas en que se presentan las mordeduras de serpientes venenosas. Este problema posee el agravante adicional de que generalmente es sufrido por individuos de escasos recursos económicos y de poblaciones marginales.1,2

En América existen dos Familias de serpientes venenosas, la Viperidae representada por las "víboras" y la Elapidae representada por las "corales" o "coralillos", si bien los accidentes por estas últimas son muy raros debido al carácter poco agresivo, tímido y huidizo de estos ofidios y sus hábitos cavícolas. Los responsables de más de 90% de los accidentes ofídicos en América pertenecen a la Familia Viperidae.3–6

Las especies de Vipéridos pertenecientes a los Géneros Crotalus y Bothrops pueden encontrarse a lo largo de todo el continente mientras que los otros Géneros de esta Familia tienen una distribución más limitada: Lachesis se encuentra en Sur y Centroamérica, Agkistrodon y Sistrurus en Norteamérica y Athropoides, Bothriopsis, Bothriechis y Porthidium en Centroamérica y Norte de Sudamérica.3–5

En México, si bien no representan uno de los mayores problemas sanitarios, las mordeduras por serpientes venenosas son comunes en determinadas zonas poniendo en peligro la vida de los pacientes.6–9 Las principales responsables de los accidentes ofídicos en México son especies de los Géneros Bothrops y Crotalus, por lo que los antivenenos utilizados para el tratamiento de las mordeduras de las mismas debe neutralizar venenos de serpientes de estos dos Géneros.10

Las mordeduras de los vipéridos producen en Centro y Norteamérica cuadros predominantemente histotóxicos y hemotóxicos, causando extensas lesiones locales (que pueden conducir a la amputación de miembros) y hemorragias incoercibles por diferentes mecanismos que actúan sobre el sistema hemostático. Estos efectos, conjuntamente a fenómenos hipotensivos provocados por mecanismos directos (hemorragias) e indirectos (activación del sistema calicreína – bradiquinina, péptidos hipotensores) pueden conducir a la muerte.

Los venenos de serpientes son las secreciones más ricas en enzimas y toxinas en la naturaleza11,12 y están compuestos por múltiples moléculas tóxicas. Como la excepción más destacable entre los vipéridos se puede mencionar a la "cascabel" sudamericana, Crotalus (C.) durissus (d.) terrificus, de veneno fuertemente neurotóxico y miotóxico. La mordedura de esta serpiente no produce lesiones locales, su componente mayor es una b–neurotoxina (crotoxina) que posee actividad miotóxica, constituye 30–50% de la masa total del veneno. Es una de las neurotoxinas más potentes y si bien no es el único componente tóxico del veneno, es el mayor responsable de la actividad tóxica del mismo.13 En otros vipéridos americanos se pueden encontrar 13–neurotoxinas, como la mojavetoxina de C. scutulatus ("cascabel del moj ave").14–16 Si bien la cantidad de éstas en la masa total del veneno no llega a ser de la misma magnitud que en la "cascabel sudamericana", las mordeduras de estas serpientes pueden igualmente producir cuadros de neurotoxicidad17,18 y a diferencia de C. dterrificus pueden causar lesiones locales.

Debido a esto, la toxicidad de los venenos viperinos, se debe a la sumatoria de la acción de sus componentes sobre diferentes sistemas y tejidos. Esta complejidad de mecanismos pone en evidencia la importancia del conocimiento de las características tóxicas y enzimáticas de los venenos, para entender mejor la fisiopatología de los envenenamientos y evaluar las capacidades neutralizantes de los antivenenos utilizados para tratarlos.1,19

Se han realizado estudios de caracterización de las actividades tóxicas de venenos de serpientes de diferentes regiones del mundo,1,17–19 sin embargo, sólo se dispone de pocos estudios sobre actividades enzimáticas y tóxicas parciales del veneno de algunas serpientes que pueden encontrarse en México.22–24 Hasta la fecha, no se disponen de datos sobre las características bioquímicas y tóxicas de los venenos crudos de las serpientes de mayor importancia sanitaria de México, sobre todo de aquellas actividades relevantes en los procesos fisiopatológicos en los envenenamientos por Vipéridos.1,19

Debido a esto, en este trabajo, se estudiaron ciertas actividades tóxicas y enzimáticas de algunas de las serpientes mexicanas de importancia sanitaria. Se determinaron las potencias letal, hemorrágica, necrotizante, fibrinolítica, procoagulante en plasma, protrombínica, fosfolipásica y fibrinogenolítica. Se trabajó con veneno de Bothrops (B.) asper, Agkistrodon (Agk.) billineatus, Athropoides (Ath., ex Bothrops) nummifer, C. d. durissus, C. scutulatus, C. basiliscus, C. atrox, y Micrurus (M.) nigrocinctus. Adicionalmente se estudió el patrón electroforético de los venenos por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS–PAGE).

Dado que el único tratamiento probado como eficiente para la mordedura de serpientes es el uso de antivenenos25–27 se determinó la capacidad neutralizante de uno de los antivenenos utilizados terapéuticamente en México sobre la potencia letal y las actividades hemorrágica, necrotizante y procoagulante del veneno de B. asper ("nauyaca"), una de las serpientes responsable del mayor número de mordeduras por serpientes venenosas de México.6,9,27

 

Materiales y métodos

 

Venenos

Los venenos utilizados en este estudio provinieron de ejemplares en buen estado de salud de B. asper, Ath. nummfer, C. basiliscus, C. durissus durissus, C. scutulatus, C. atrox, Agk billineatus billineatus y M nigrocinctus, propiedad del Serpentario "La Nauyaca", Cuernavaca, Morelos, México. Los ofidios se mantuvieron alojados en cajas individuales, a una temperatura de 24 – 30°C. Los Vipéridos fueron alimentados con uno o dos ratones o ratas o cobayos quincenales de acuerdo a su tamaño y los ejemplares de Micrurus con un colúbrido semanal o quincenalmente. Todos los ofidios recibieron agua ad libitum. El veneno se extrajo manualmente y fue inmediatamente desecado al vacío y guardado a –20°C.

 

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Las muestras se prepararon con dodecil sulfato de sodio (SDS–PAGE) en condiciones reductoras y no reductoras. Se corrieron 25 u.g de cada veneno en geles homogéneos de acrilamidalbisacrilamida al 12.5 % en el sistema de buffer discontinuo descrito por Laemmli,28 utilizando una cuba Miniprotean II (BioRad). Los geles una vez corridos se fijaron y colorearon con Azul brillante de Coomasie (BioRad).

 

Animales de experimentación

Se utilizaron ratones de la cepa CF–1 (18–20 g de peso) provistos por el Instituto Nacional de Producción de Biológicos – A.N.L.I.S. "Dr. Carlos G. Malbrán" (INPB), Buenos Aires, Argentina. Los animales se mantuvieron dentro de condiciones ambientales controladas, recibieron alimento sólido y agua ad libitum. Se cumplieron los requisitos éticos respecto al manejo y cantidad de animales utilizados para las determinaciones de actividades tóxicas y ensayos de seroneutralización.

 

Potencia letal

Se utilizó el método de estimación de la DL50 en ratones descrito por Meier y Theakston.29 La potencia letal intraperitoneal se calculó extrapolando los valores de dosis (1 a 20 µg.g–1 por ratón) en función de la relación dosis/ tiempo de muerte (mg.min–1) mediante análisis por regresión lineal.

 

Actividad hemorrágica y necrotizante

Se determinaron de acuerdo a la técnica descrita por Theakston y Reid,19 con algunas modificaciones. Brevemente, se inyectaron ratones (3 por nivel de dosis), porvíaintradérmica(i.d.) con 100 µl de veneno en dosisque variaron entre 1 y 300 µg en 100 µlde NaCI 0.15 M. Las lesiones fueron medidas tras el sacrificio de los animales con éter etílico a las 3 horas (para la actividad hemorrágica) o a las 72 horas (para la actividad necrotizante). Se definió como Dosis Mínima Hemorrágica (DMH) a la dosis de veneno que produce un halo hemorrágico con diámetro mayor perpendicular de 1 cm promedio y como Dosis Mínima Necrotizante (DMN) a la dosis de veneno que resulta en un área necrótica con un diámetro mayor promedio de 0.5 cm.19

 

Actividad procoagulante en plasma humano y fibrinógeno

Se determinó tratando 0.2 ml de plasma humano normal conteniendo 2.8 g de fibrinógeno o una solución de fibrinógeno bovino al 2% en NaCI 0.15 M (Sigma) con diferentes concentraciones de veneno en 50 u.l de NaCI 0.15 M. Una dosis procoagulante mínima en plasma humano (DMP–P) o en fibrinógeno (DMP–F) se definió como la dosis de veneno que produce la formación de un coágulo evidente en 60 segundos y se expresó en mg/l

 

Determinación de la actividad fibrinogenolítica

Muestras conteniendo 1.8 ml de fibrinógeno bovino al 2.0% (Sigma) se trataron con 200 µl de NaCl 0.15M conteniendo 400 µg de veneno. Las muestras se incubaron a 37°C durante 120 minutos. Tras la incubación se tomaron muestras para realizar el SDS–PAGE y observar el patrón de degradación del fibrinógeno. El SDS–PAGE se realizó en condiciones redactoras y no redactoras, en geles con una concentración de acrilamida de 10%. Tras la electroforesis se realizó la fijación y la coloración con Azul brillante de Coomasie.30

 

Actividad de fosfolipasa A2

El estudio de la actividad de fosfolipasa A2 se realizó mediante la determinación de la hidrólisis radial de fosfolipidos cuan sustento conteniendo agarosa (Sigma) al 1 % y yema de huevo al 2.5%. Se colocó la mezcla anterior en placas de Peen para lograr una capa gelificada de 2.5 mm de espesor; se realizaron perforaciones en las que se colocaron diferentes dosis de cada veneno (1–200 µg en 10 µ1 de NaCl 0.15 M). Tras una incubación de 24 horas a temperatura ambiente se midieron los halos de hidrólisis radial y se estimó la dosis de veneno que produjo un halo de hidrólisis de 2 cm de diámetro mediante el análisis de la curva dosis–respuesta.

 

Seroneutralización de las actividades tóxicas

Para todos los ensayos de neutralización se utilizó el antiveneno Antivipmyn® (Instituto Bioclon, México D.F.), lote B6G02 con vencimiento 07/2001. La concentración proteica de ese antiveneno fue de 20 mg/ml.

Seroneutralización de la actividad letal. Se realizó preincubando varias dosis de antiveneno frente a 5.0 DL50 del veneno de B. asper. Para cada nivel de dosis de antiveneno se utilizaron grupos de 6 ratones CF–1 de 18–22g que se inyectaron por vía i.p. con 5.0 DL50 de veneno diluido en NaCl 0.15 M (control positivo) o con las mezclas de veneno –antiveneno preincubadas 30 min a 37°C. La curva de supervivencia en función de la dosis de antiveneno utilizada se estudió por regresión no lineal y la DE50 se definió como la dosis de antiveneno que protege al 50% de los animales desafiados.

Seroneutralización de la actividad hemorrágica y de la actividad necrotizante. Cinco grupos de ratones CF–l de 25 g de peso (n = 3 por nivel de dosis) se inyectaron por vía i.d. con 10 DMH o 3 DMN de veneno, preincubados 30 min. a 37° C con NaCl 0.15 M (control positivo) o con distintas cantidades del antiveneno. La determinación de las áreas hemorrágicas o necróticos se realizó de la forma mencionada anteriormente.19,31 Se asignó un valor de 100% a la media del área hemorrágica o necrótica determinada en el grupo control positivo. Se determinó la DE50 (dosis de veneno que reducen la mitad el área hemorrágica o necrotizada) mediante el estadio por regresión no lineal de la curva dosis de antiveneno versus inhibición porcentual de las áreas hemorrágicas o necrotizadas.

Seroneutralización de la actividad procoagulante. Se preincubaron distintas dosis del antiveneno con cinco DMP de veneno durante 30 minutos a 37°C. La mezcla se adicionó a 500 µl de plasma humano normal (contenido de fibrinógeno 2.8 g/dl) y se determinó el tiempo de coagulación de los controles positivos (veneno en NaCl) y de las muestras preincubadas con antiveneno. La inhibición de la actividad procoagulante se estimó a partir del incremento en el tiempo requerido para la formación del coágulo, considerándose la dosis inhibitoria a aquella que retrasó al menos 10 veces la formación de un coágulo evidente respecto a los controles.32,33

Estadísticos. Todos los experimentos fueron realizados al menos por triplicado y los resultados expresados como media ± desviación estándar. Los intervalos de confianza (i.c.) de 95% se expresan entre paréntesis. Para determinar la significación estadística de los resultados se utilizó la t de Student. Los análisis de regresión lineal y regresión no lineal se realizaron por medio de la combinación del software Prisma y Stat Mate (GraphPad Inc. San Diego, California, USA).

 

Resultados

Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS–PAGE). Los venenos de vipéridos presentaron componentes desde los 83 KDa a 6.5 KDa. En condiciones reductoras presentaron bandas fuertemente teñidas entre los 83.0 – 47.5,25 – 32.5 KDa y los 16.5 – 6.5 KDa. Los venenos de B. undulatus y C. scutulatus mostraron menor cantidad de componentes que los otros vipéridos entre los 25 y 32.5 KDa. El veneno de Agk billineatus presentó un perfil muy diferente al de los otros vipéridos, presentando la mayor cantidad de componentes entre los 6.5 – 16.5 KDa y entre 32.5–47.5 KDa (Figura 1 a). En condiciones no reductoras el veneno de Agk billineatus fue también el que presentó el patrón más diferenciado (Figura 1 .b). En estas condiciones el veneno de B. asper presentó las bandas más fuertemente teñidas entre los 16.5 y 25 KDa y el de B. undulatus por debajo de los 32.5 KDa a diferencia de los restantes venenos que mostraron las bandas más fuertemente teñidas entre los 32–47.5 y 16.5–25 KDa. Todos los venenos presentaron material entre los 6.5 y 16.5 KDa, tanto en condiciones reductoras como en no reductoras (Figuras 1 .a y 1 .b). El veneno de M .nigrocinclus mostró un patrón muy diferente al de los vipéridos, observándose la mayor cantidad de material por entre los 16.5 y 6.5 y por debajo de los 6.5 KDa, con muy escaso material entre los 47.5–83 KDa (Figura 1 .c).

Potencia letal. La potencia letal de los venenos fue de 2.3 + 0.5 ug/g pa ra M. nigrocinctus, 5.7 + 0.8 µg/g pa ra C. d durissus, 2.3 + 0.5 µg/g para C. scutulatus, 10.6 + 2.8 µg/ g para C. basiliscus, 5.8 + 1.0 µg/g para Agk. billineatus, 2.4  + 2.0 µg/g para C. atrox, 7.0 + 1.7 µg/g para Ath. nummifer y de 2.9 + 0.2 µg/g para B. asper. Estas actividades se pueden comparar en el cuadro I.

Actividad hemorrágica: Las actividades hemorrágicas halladas expresadas como DMH fueron 77.0 + 16.0 u.g para el veneno de C. durissus durissus, 29.0 + 4.0 mg para C. basiliscus, 63.8 + 5.9 para C. atrox, 11.5 + 4.1 µg para Agk billineatus, 44.0 + 9.4 µg para C. scutulatus scutulatus, 28.0 +4.8 µg para B.nummifery 5.8 +2.0 µg para B. asper. Estas actividades se pueden comparar en el cuadro I. La actividad hemorrágica no se determinó en el veneno de M. nigrocinctus ya que es predominantemente neurotóxico y con éste se alcanzan dosis letales antes que se observe alguna alteración en el lugar de inoculación.

Actividad Necrotizante. Las actividades necrotizantes determinadas se expresaron en DMN fueron de 90 + 30 µg para Agk billineatus 59 + 7 µg para B. asper, 82+24 µg pa ra Ath. nummifer, 107 + 10 µg para C. basiliscus y de 91 + 6 µg para C. d. durissus. Aunque se ensayó la medición de los venenos de M . nigrocinctus y C. scutulatus, no se pudo determinar la dosis de veneno requerida para producir necrosis dérmica dado que se produjo la muerte de los animales antes de observar alguna lesión necrótica en la zona de inoculación. (Cuadro I).

Actividad procoagulante en plasma humano. Las dosis halladas para los diferentes venenos fueron de 1.2 mg/l para B. asper, 456 mg/l para C. d. durissus, 262 mg/l para Agk billineatus y 56 mg/l para Ath. nummfer. Los venenos de C. basiliscus, C. atrox y C. scutulatus aun con dosis de veneno de 1,500 mg/l fueron incapaces de producir un coágulo evidente antes de un minuto. (Cuadro I).

Actividad procoagulante en fibrinógeno bovino. Las dosis halladas para los diferentes venenos fueron de 259 mg/l para B. asper, 623 mg/l para C. d durissus y 386 mg/l para Ath. nummifer; los venenos de C. basiliscus, C. scutulatus, C. atrox y Agk billineatus no formaron coágulos tras 20 minutos de observación aun con dosis de 7500 mg/l. (Cuadro I).

Actividad fosfolipásica. Todos los venenos mostraron actividad de fosfolipasa A2. Las potencias expresadas como la cantidad de veneno (u.g) necesaria para producir un halo de hidrólisis de 2 cm de diámetro, fueron 5.8 + 0.1 µg para M. nigrocinctus, 5.6 + 0.2 u.g para B. asper, 7.1 + 1.4 µg para C. basiliscus, 7.9 + 2.5 µg para Agk. billineatus, 11.0 + 4.5 µg para C. scutulatus, 14.2 + 4.2 µg para C.d durissusy 34.4 + 9.5 µg para Ath. nummifer. Los venenos que produjeron la mayor hidrólisis fueron los de M. nigrocinctus y B. asper, y los que produjeron menor hidrólisis fueron los de C. scutulatus y Ath. nummifer. Los venenos de Agk. billineatus, C. basiliscus y C. scutulatus mostraron actividades muy parecidas. (Cuadro I).

Determinación de la actividad sobre el fibrinógeno. Todos los venenos probados hidrolizaron al fibrinógeno (Figura 2 ). Los venenos de B. asper y Ath. nummifer fueron los que produjeron la mayor degradación de fibrinógeno, la que se pudo visualizar fácilmente en los geles corridos tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Los controles en condiciones reductoras presentaron bandas mayores en el orden de los 40–70 KDa, en correspondencia a las subunidades a, b y g del fibrinógeno bovino, mientras que en las muestras tratadas con veneno, las bandas más fuertemente teñidas fueron inferiores a los 45 KDa. (Figura 2 ).

Seroneutralización de las actividades biológicas. Las DE50 del antiveneno probado frente a las diferentes actividades biológicas estudiadas del veneno de B. asper fueron: 68 µl (41 –114 µl) para la potencia letal (1.36 mg de proteína), 10 + 3 µl para la potencia hemorrágica (0.2 mg de proteína) y 17 + 3 µl para la potencia necrotizante (0.34 mg de proteína). La formación de un coágulo evidente en las condiciones de estudio fue inhibida con 200 µ1 de antiveneno (4mg de proteína).

 

Discusión

Los venenos poseen las principales actividades tóxicas descritas para los venenos de vipéridos americanos.19–21 Las potencias de las actividades tóxicas en general estuvieron dentro de los rangos descritos para venenos de vipéridos de América.19–21

Los patrones electroforéticos mostraron diferencias entre los Géneros y entre las especies, tanto en los estudios realizados en condiciones reductoras (Figura 1 .a) como en condiciones no reductoras (Figura 1 .b). El veneno de Agk. billineatus muestra un patrón muy diferente al resto de los Vipéridos. El veneno de M. nigrocinctus presentó un patrón muy diferente al de los vipéridos (Figura 1 .c), mostrando la mayoría del material por debajo de los 16 KDa, posiblemente debido a la presencia de a–neurotoxinas las que poseen alrededor de 7 KDa y de fosfolipasas, las que poseen una masa molecular de 13–15 KDa.

Los venenos de M. nigrocinctus y C. scutulatus fueron los de mayor potencia letal, hecho relacionado con sus características neurotóxicas. El veneno de C. scutulatus posee una β–neurotoxina ("mojavetoxina") en cantidades variables, mientras que los componentes neurotóxicos mayores de los venenos de los Elápidos son las a–neurotoxinas que serían las principales causantes de la muerte en estos envenenamientos.34

El veneno de C. scutulatus scutulatus puede variar mucho en su composición16,35 y esta diferencia puede existir inclusive entre el veneno de la madre y el de sus crías.36 Los venenos de C. scutulatus tipo A poseen una cantidad importante de mojavetoxina y su actividad hemorrágica es baja o nula mientras que los del tipo B poseen alta actividad hemorrágica y poca cantidad de esa neurotoxina.37–39 Por la presencia de actividad hemorrágica parecería que el veneno con que se trabajó aquí sería del tipo B.

Los venenos de vipéridos que mostraron mayor actividad tóxica en general fueron los de B. asper y C. atrox. El veneno de B. asper en general fue el que presentó las actividades tóxicas más potentes (Cuadro I).

Uno de los fenómenos más conspicuos en el envenenamiento por Vipéridos es la presencia de hemorragias incoercibles por lesiones vasculares e incoagulabilidad sanguínea por afibrinogenemia y/o inhibición de los sistemas hemostáticos y/o trombocitopenia. Todos los venenos estudiados mostraron actividad hemorrágica, hecho esperable si consideramos que los venenos de vipéridos son ricos en hemorraginas40–42 y dado que del veneno de algunas de las especies estudiadas se han aislado y caracterizado varias hemorraginas.38,43–47

Los venenos mostraron actividad coagulante por mecanismos directos (sobre el fibrinógeno) y directos e indirectos (sobre plasma), siendo especialmente destacable la actividad del veneno de B. asper. Los venenos de B. asper, C. d. durissus y Ath. nummifer mostraron tener capacidad coagulante sobre el plasma y sobre el fibrinógeno poniendo en evidencia la presencia de enzimas similares a la trombina. El veneno de Agk b. billineatus solamente mostró actividad coagulante sobre el plasma tal como se observa con el veneno de Agk. contortrix que no posee actividad similar a la trombina pero sí posee enzimas que actúan sobre esta última.48 En el veneno de Agk. billineatus se ha descrito la presencia de una enzima (la bilineobina) que convierte al fibrinógeno en fibrina pero por un mecanismo diferente al de la trombina.49 Sin embargo, nosotros no pudimos observar actividad coagulante sobre el fibrinógeno con el veneno de Agk. billineatus estudiado. Una explicación pudiera ser una acción fibrinogenolítica en el veneno que no le permita al fibrinógeno formar puentes para convertirse en fibrina estable, tal como se observa con factores hemorrágicos provenientes del veneno de Lachesis muta muta, que no forma coágulo con el fibrinógeno pero sí lo hid rol iza.50–52 Otra posibilidad pudiera ser que este veneno posea factores que inhiban su acción tipo trombina in vitro o que estas enzimas necesiten de algún factor plasmático para poder actuar sobre el fibrinógeno. Los venenos de C. basiliscus, C. atrox y C. scutulatus no produjeron la formación de coágulos sobre plasma o fibrinógeno en las condiciones de estudio.

Si bien las técnicas utilizadas no pueden discriminar si las enzimas fibrinogenolíticas son también fibrinolíticas, es posible afirmar que todos los venenos estudiados poseen actividad fibrinogenolítica directa importante, sin intervención de la plasmina. Los venenos que produjeron mayor degradación del fibrinógeno fueron los de B. asper y Ath. nummifer, es decir, aquéllos con mayores potencias coagulantes sobre el plasma y sobre el fibrinógeno. Por otro lado, estos dos venenos fueron los que presentaron mayor actividad hemorrágica.

En algunos de estos venenos ya se han descrito enzimas fibrinolíticas como es el caso de la basilasa en C. basiliscos,53 la atroxasa en C. atrox y otras en el veneno de Agk billineatus.54–56 Por otro lado las enzimas hemorrágicas (hemorraginas) poseen actividad sobre el fibrinógeno y se les atribuye un papel importante en la génesis y mantenimiento de los procesos hemorrágicos.41,42,57–59

Si bien los venenos de C. basiliscus, C. scutulatus y C. atrox no produjeron coágulos evidentes por las técnicas utilizadas, todos fueron capaces de actuar sobre el fibrinógeno hid rolizándolo. Por otro lado, en los venenos de C. atrox y C. basiliscus se han descrito la presencia de componentes con fuerte actividad protrombínica60 y también la de componentes fuertemente fibrinolíticos.56 Esto complica el análisis de los resultados obtenidos con estos venenos, siendo que pudimos observar actividad fibrinolítica o fibrinogenolítica, pero no la actividad protrombínica descrita para los mismos. Una explicación parcial podría encontrarse en la alta variabilidad descrita para los venenos provenientes de diferentes regiones,61 aun considerando una misma especie de serpiente.

Por los métodos de estudio utilizados todos los venenos mostraron al menos dos de las actividades relacionadas con los procesos hemorrágicos en los envenenamientos por viperinos (actividad hemorrágica, coagulante en plasma, protrombínica y fibrinolítica).

Exceptuando el veneno de Ath. nummifer, el estudio de la regresión lineal entre las potencias necrotizantes y las fosfolipásicas mostró una buena correlación (r2=0.9). Sin embargo, en los venenos de Bothrops existen miotoxinas que, aun perteneciendo a la familia de las fosfolipasas A2, no tienen actividad catalítica (fosfolipasas K49).62,63 Por otro lado, los fenómenos necróticos pueden deberse no sólo a la acción de componentes citotóxicos sino también a fenómenos isquémicos.64,65 Adicionalmente, los venenos de Crotálidos de Norteamérica son una fuente rica de alfamiotoxinas,66 componentes que se encuentran en mucha menor cantidad en los venenos de los Crotálidos de Sudamérica.67 A causa de esto, no se debe correlacionar necesariamente a la actividad fosfolipásica con la ocurrencia de necrosis in vivo. Por otro lado, la técnica utilizada para la determinación de la necrosis en piel no indica necesariamente la actividad miotóxica del veneno.

La potencia letal de los venenos viperinos tuvo una buena correlación con la capacidad necrotizante en piel de los venenos (r2 = 0.8) de manera similar a la que se observa con algunos venenos de Crotálidos de Sudamérica.20,68 No se encontró buena correlación entre las demás actividades y la potencia letal de estos venenos.

El antiveneno inhibió de forma eficiente las actividades tóxicas probadas del veneno de B. asper, un hecho esperable, dado que éste es uno de los antivenenos de uso rutinario para tratar los envenenamientos por serpientes en México, y se produce utilizando como uno de sus inmunógenos principales el veneno de B. asper.

Los resultados contenidos en este trabajo son un aporte para el mejor conocimiento de la toxicidad de los venenos de serpientes de esta parte de Norteamérica y posiblemente alienten y brinden una base a los interesados en el estudio de la toxicidad de los venenos de serpientes mexicanas y de la capacidad neutralizante de los antivenenos utilizados para el tratamiento de sus mordeduras.

 

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