En Yucatán crecen numerosos cultivares criollos de cucurbitáceas con relevancia económica, nutricional y cultural. El pepino blanco o pepino indio (Cucumis sativus L.) se caracteriza por sus frutos blancos, claviformes o piriformes, ampliamente comercializados y consumidos en el estado. El calabazo o calabacito (Lagenaria siceraria (Molina) Standl.) produce frutos botuliformes, globosos o claviformes, empleados en la manufactura de utensilios de cocina, juguetes o instrumentos musicales ^{(Lira Saade 2001)}.

Los hongos endófitos (HE) son organismos benéficos que se encuentran en los tejidos de las plantas, en los cuales pueden habitar durante parte de su ciclo de vida o de forma permanente ^{(Bacon y White 2016)}. Su diversidad varía con el hospedero, la edad de la planta, el ecosistema, la ubicación geográfica y factores climáticos ^{(Kim et al. 2013)}. En las zonas tropicales es donde suele existir mayor diversidad y abundancia, así como una aparente menor especificidad de hospederos ^{(Gamboa-Gaitán 2006)}.

Al menos 90 géneros de HE se asocian con especies de cucurbitáceas, siendo frecuentes Fusarium, Colletrotrichum y Alternaria ^{(Huang et al. 2020)}. La mayoría de los aislamientos de HE de cucurbitáceas se han obtenido en regiones templadas ^{(Mu et al. 2010}, ^{Xue et al. 2015}, ^{González et al. 2020}, ^{Tymon et al. 2020)}; seguido de regiones semi-áridas ^{(Boughalleb-M’Hamdi et al. 2018)}. Por lo que las cucurbitáceas tropicales representan microhábitats inexplorados, reservorios de una diversidad fúngica desconocida. El objetivo del presente estudio fue aislar hongos endófitos de diferentes órganos de cultivares criollos de pepino blanco y calabazo cultivados en Yucatán.

Entre junio y julio de 2022, se tomaron muestras de hojas, tallos, raíces y flores de plantas de pepino blanco y calabazo, de tres meses de edad y sin síntomas aparentes de enfermedades, de un huerto familiar de Caucel, Yucatán (21°01’16.9” LN, 89°42’04.5” LO) y sin tratamiento fungicida. Para el aislamiento de HE de semillas, estas se adquirieron a través de productores de las localidades yucatecas de Kancabdzonot (20°30’33” LN, 88°42’38” LO), Muna (20°28’00” LN, 89°45’00” LO) y Sotuta (20°37’00” LN, 89°00’00” LO). Los órganos se colectaron y depositaron en bolsas plásticas resellables trasparentes y estériles, para su transporte al Laboratorio de Fitopatología del Tecnológico Nacional de México (TecNM), Campus Conkal, Yucatán. Se procesaron ca. 2 h después de colectados.

Los órganos se lavaron previamente con agua corriente para eliminar residuos de tierra o sustrato, seguido de una inmersión en hipoclorito de sodio comercial al 1.5% por 2 min, luego se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril y se secaron con papel absorbente estéril. Las siembras se hicieron en condiciones asépticas, colocando fragmentos de tejido vegetal de 1 cm² en cajas Petri estériles de 10 cm de diámetro, en cuatro medios de cultivo: Papa-Dextrosa-Agar (PDA), Harina de Maíz-Agar (HMA), Jugo de 8 Vegetales-Agar (V8A) y Extracto de Cucurbitáceas-Agar (ECA). El V8A se preparó con jugo de vegetales V8 mixto marca Campbell’s®. Para la preparación del ECA se hicieron modificaciones a la metodología propuesta para el cultivo de hongos fitopatógenos de trigo y cebada ^{(Gilchrist-Saavedra et al. 2005)}, con hojas y tallos frescos de los cultivares muestreados.

Para las hojas, tallos, raíces y flores se hicieron cuatro réplicas por cada órgano de cada planta por cada medio de cultivo. En el caso de las semillas, fueron cuatro réplicas por localidad de procedencia y medio de cultivo. Los cultivos se sellaron e incubaron a 28 ± 2 °C y se conservaron durante 2 meses; se hicieron re-aislamientos cada vez que se observó crecimiento micelial hasta la obtención de cultivos puros. Para garantizar la efectividad de la metodología de purificación, se tomaron alícuotas del agua del último enjuague de algunas de las muestras, se vertieron en los medios de cultivo y se incubaron en las mismas condiciones que las siembras (en ninguno se registró crecimiento de microorganismos). Con la abundancia registrada para cada órgano y medio de cultivo, se realizaron análisis de varianza con comparaciones de medias con la prueba de Tukey (p≤0.05) mediante el software Minitab Statistical. Las cepas aisladas se conservaron en agua destilada, glicerol al 20 % y PDA con aceite mineral para su resguardo en el cepario del TecNM Campus Conkal.

Las cepas cultivadas que desarrollaron estructuras reproductivas y esporas se observaron en el microscopio para su caracterización a nivel de género. Muestras de micelio y esporas se colocaron en un portaobjetos con una gota de ácido láctico y se observaron en un microscopio óptico (Carl Zeiss, Primo Star, Madrid, España). Las estructuras observadas se compararon con las reportadas en claves taxonómicas ^{(Barnett y Hunter 1998)}.

El pepino blanco presentó 155 aislamientos. Las flores fueron las estructuras con mayor abundancia (62 aislamientos), seguidas de tallos (38), hojas (27), raíces (26) y semillas (2). En el calabazo, de los 164 aislamientos, la mayoría se obtuvieron de tallos (51), seguidos de raíces (43), hojas (26), flores (23) y semillas (21). Con excepción de las semillas de pepino, no hubo diferencia significativa en la abundancia registradas en el resto de los órganos (Tabla 1). El medio de cultivo que favoreció la mayor cantidad de crecimientos miceliales fue el ECA (92 aislamientos), seguido de PDA (88), HMA (80) y V8A (59). Aunque no hubo diferencia significativa (P≤0.01) en las abundancias entre medios de cultivo (Tabla 1), algunas cepas se mostraron selectivas hacia algunos de ellos (Tabla 2). De la totalidad de aislamientos, 131 cepas se clasificaron en 16 géneros. Aspergillus fue el género con más registros, con 46 aislamientos en casi todos los órganos de ambas especies. Lasiodiplodia también se reportó en todos los órganos estudiados. Contrariamente, algunos géneros se observaron en una sola estructura vegetal (Tabla 2).

Las hojas de peino verde suelen ser el órgano con mayores tasas de colonización por parte de los HE ^{(Mu et al. 2010)}. Sin embargo, en pepino blanco y en calabazo criollo, los tallos, las raíces y las flores fueron igualmente importantes. Los HE en flores de cucurbitáceas solo tenían reportes en melón amargo (Momordica charantia L.), destacando en abundancia sobre los aislamientos de otras estructuras como las raíces ^{(Huang et al. 2012)}. La efimeridad de las flores de estas especies podría ser un factor por el cual no se contemplan en las bioprospecciones. Las semillas han demostrado poseer una eficiente tasa de colonización ^{(Panaccione et al. 2014)}, aunque no había reportes para cucurbitáceas. La escasez de crecimientos encontrados en las semillas del cultivar criollo de pepino probablemente se deba a algún manejo fitosanitario aplicado a las plantas de procedencia.

El PDA es el medio de cultivo recurrente para el aislamiento de HE en cucurbitáceas ^{(Mu et al. 2010}, ^{Xue et al. 2015}, ^{González et al. 2020}, ^{Tymon et al. 2020)}. El HMA también ha sido empleado, aunque con menor frecuencia, en estudios similares, al igual que medios preparados con harina de avena y extracto de malta. Estos medios de cultivo han demostrado buenos resultados en el aislamiento de endófitos para cucurbitáceas ^{(Su et al. 2016}, ²⁰¹⁷, ^{Su y Niu 2018)}. El PDA y el HMA se seleccionaron para este estudio a modo de complemento de aquellos medios de cultivo que no habían sido utilizados para el muestreo de endófitos en estas plantas. El V8A no se había probado en estudios bioprospectivos con cucurbitáceas, pero ha sido mayormente empleado para el aislamiento de microorganismos con requerimientos importantes de esteroles como Phytophthora spp. ^{(Machado et al. 2013)}. El exceso de nutrientes, resultante de la combinación de los extractos vegetales que componen este medio, puede limitar el crecimiento de HE, cuyos requerimientos nutricionales son menores.

El uso de medio de cultivo preparado a partir de la misma especie vegetal de la cual se obtienen los aislamientos (ECA), resultó una estrategia eficiente. Esto tampoco se había probado para aislamientos de cucurbitáceas, pero sí para HE relacionados con tabaco, obteniendo resultados similares ^{(González-Peña et al. 2014)}. A pesar de las abundancias similares reportadas para los medios de cultivo utilizados, es importante destacar que algunas cepas tienen preferencias por algún medio de cultivo. Por ejemplo, Gymnascella y Monosporascus solo crecieron en ECA, Diaporthe en HMA y ninguna cepa de hoja de calabazo creció en PDA.

Considerar las diferentes estructuras de la planta es parte fundamental de la metodología para aislar sus HE y considerar la mayor diversidad de especies cultivables, principalmente en regiones tropicales donde existe mayor especialización en cuanto a tejidos vegetales colonizados ^{(Gamboa-Gaitán 2006)}. Así mismo, es recomendable el uso de diferentes medios de cultivo para obtener diversidad confiable, así como para determinar cuáles pueden favorecer mayor velocidad de crecimiento y esporulación. Con la finalidad de optimizar el tiempo dedicado a este tipo de estudios, disminuir la presencia de contaminantes y ahorrar insumos, conviene optar por medios de cultivo selectivos con bajo contenido nutricional ^{(Cotilla et al. 2007)}.

Los géneros aislados en este trabajo se han reportado como especies endófitas con una gran utilidad biotecnológica para el control de patógenos en condiciones de laboratorio y campo, destacando cepas de Aspergillus ^{(Rashad et al. 2022)}, Lasiodiplodia ^{(Segaran y Sathiavelu 2023)}, Penicillium ^{(Toghueo y Boyom 2020)} y Trichoderma ^{(Khan y Javaid 2020}, ^{Khan et al., 2020)}. Es conveniente explorar los efectos antagónicos y antibióticos de las cepas aisladas frente a los fitopatógenos locales, así como sus efectos promotores de crecimiento en cultivos de cucurbitáceas o de otras especies vegetales de importancia comercial.