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Introducción
El gen ORM1 está localizado en el brazo largo del cromosoma 9 en la región 31-32 (9q31-32), contiene 5 exones y codifica para la glucoproteína alfa-1-ácida (AGP1), que posee funciones inmunomoduladoras tales como la inhibición celular de neutrófilos y linfocitos T, la inhibición de la agregación plaquetaria, la inhibición de interleucina (IL) 2 durante procesos inflamatorios y la inhibición de la producción de IL-1 en macrófagos1,2; todas ellas involucradas en la respuesta inmunológica antitumoral.
Se ha reportado que la variante de un solo nucleótido (SNV) c.113G>A en el exón 1 del gen ORM1 es capaz de producir una alteración fenotípica en la proteína AGP1, originando que esta tenga una migración electroforética lenta (fenotipo S), lo cual se relaciona con una función inmunosupresora más potente en comparación con la isoforma con migración electroforética rápida (fenotipo F), codificada por la variante c.520G>A del exón 5 del mismo gen; por lo que al parecer estas variantes son capaces de modular las características bioquímicas y funciones biológicas de la proteína AGP1, afectando así el progreso y curso clínico de enfermedades como el cáncer3-8.
En el proceso de tumorogénesis del cáncer de mama (CM), por ejemplo, el cual se considera un problema mundial de salud pública9, se han detectado diversas alteraciones estructurales en el DNA, que van desde grandes rearreglos cromosómicos, translocaciones, deleciones, inserciones y variación en el número de copias hasta variantes de un solo nucleótido (SNV) en diversos genes, entre los que se encuentra el gen ORM110-12.
En poblaciones japonesas, alemanas y suecas, se ha descrito que las SNV del gen ORM1 están asociadas a un bloqueo de la respuesta inmunológica antitumoral, contribuyendo así a la preservación y el desarrollo de células tumorales en tejido de la glándula mamaria1,3,4,12.
Por lo anterior, en el mundo diversos grupos destacan la necesidad de estudiar el genoma del CM para ayudar a puntualizar cuáles son los mecanismos biológicos de inicio y progresión del cáncer, y poder hallar biomarcadores que permitan realizar diagnósticos oportunos y prevenir el CM10,13,14.
Debido a lo anterior, el objetivo de este trabajo es determinar la frecuencia genotípica y alélica de las variantes c.113G>A del exón 1 y c.520G>A del exón 5 del gen ORM1, que codifican a las isoformas S y F de la glucoproteína AGP1, para evaluar su asociación clínica con el CM en una muestra de la población mexicana.
Material y métodos
Se realizó un estudio de casos y controles en el periodo 2015 a 2016, el cual fue aprobado por los respectivos comités de investigación y ética de las instituciones participantes. Se incluyeron 101 pacientes referidas de la Consulta de Oncología del Hospital Juárez de México y del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre del Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), con diagnóstico de adenocarcinoma de glándula mamaria confirmado por estudio histopatológico, en cualquier estadio clínico, sin antecedentes de enfermedades concomitantes y que al momento de la toma de la muestra no hubieran recibido tratamiento quirúrgico, ni quimioterapia o radioterapia. Se tomó en cuenta el tiempo de evolución de la enfermedad, el cual se definió como el tiempo que transcurrió desde el diagnóstico de la enfermedad hasta el momento que la paciente fue ingresada al protocolo.
También se incluyeron 104 mujeres sanas referidas de los mismos hospitales antes mencionados, pareadas por edad con los controles, y a las cuales se les realizó una entrevista clínica, exploración física y análisis bioquímico que incluía biometría hemática, química sanguínea, perfil de lípidos y panel viral, los cuales debieron acreditar como exámenes normales para poderlas clasificar como personas sanas. Todas las participantes firmaron un consentimiento informado y de cada una de ellas se obtuvo sangre venosa periférica, que fue colectada en un tubo Vacutainer de 5 ml con ácido etilendiaminotetraacético para la extracción de DNA. El DNA genómico fue obtenido de leucocitos utilizando el método de expulsión salina15.
La genotipificación de la variante c.113G>A del exón 1 fue realizada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación automatizada. Mientras que la determinación de la variante c.520G>A del exón 5 fue realizada por PCR-RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) de acuerdo con García-Ortiz16.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el programa GraphPhad Prism® versión 4.0 para Windows® (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.), utilizando una base de datos de Excel®. De los datos se obtuvieron las frecuencias genotípicas y alélicas de las SNV del exón 1 y exón 5 del gen ORM1, así como el equilibrio de Hardy-Weinberg. La asociación entre las variantes genéticas y las características clínicas se realizó utilizando la prueba de χ2 para tendencias, calculando el intervalo de confianza y la odds ratio (OR) según correspondiera. Las características clínicas cuantitativas fueron evaluadas utilizando la prueba t de Student, no pareada, con post-test de Wilcoxon o ANOVA, según correspondiera y la asociación entre variables por medio del coeficiente de Spearman. Para todos los análisis la significancia estadística fue asumida con un valor de p < 0.05.
Resultados
Se incluyeron 101 pacientes con diagnóstico de CM que cumplieron con los criterios de inclusión para este protocolo y 104 mujeres sanas del grupo control. La edad promedio de las pacientes con CM fue de 52.83 ± 0.85, mientras que la edad promedio para el grupo control fue de 55.76 ± 0.85. Los promedios de la edad de la menarca, edad de la primera gestación, el número de gestaciones, abortos y edad de la menopausia, no tuvieron diferencias significativas entre ambos grupos (Tabla 1).
Tabla 1 Características generales de las pacientes con cáncer de mama (CM) y el grupo control
| Parámetro | CM (n = 101) | Controles (n = 104) |
|---|---|---|
| Edad (años) | 52.83 ± 0.85 (28-80) | 55.76 ± 0.85 (25-78) |
| Edad de menarca | 12.81 ± 0.83 (10-16) | 12.03 ± 0.87 (11-14) |
| Edad 1.ª gestación | 22.78 ± 2.30 (15-37) | 21.52 ± 3.01 (16-36) |
| Gestaciones | 2.59 ± 1.20 (0-12) | 3.02 ± 1.50 (0-10) |
| Abortos | 0.48 ± 0.42 (0-3) | 1.02 ± 0.25 (0-4) |
| Edad de menopausia | 44.48 ± 5.23 (0-65) | 43.95 ± 4.21 (0-58) |
Todos los resultados están expresados en promedios ± error estándar (rango).
Para conocer si las variantes c.113G>A del exón 1 y c.520G>A del exón 5 del gen ORM1, que codifican a las isoformas S y F, respectivamente, de la glucoproteína AGP1, están asociadas con el CM, se realizó un primer análisis de las frecuencias genotípicas y alélicas de estas variantes, las cuales estuvieron en equilibrio de Hardy-Weinberg (Tabla 2). Como puede observarse, las frecuencias genotípicas de la variante c.113G>A del exón 1 fueron similares para las pacientes con CM y el grupo control, en ambos grupos se presentó una mayor proporción del genotipo AG, seguido del AA y el GG.
Tabla 2 Frecuencia genotípica y alélica del polimorfismo c.113G>A del exón 1 y c.520G>A del exón 5 del gen ORM1 en pacientes con cáncer de mama (CM) (n = 101) y el grupo control (n = 104)
| Exón 1 A/G (c.113G>A) | Frecuencia genotipo | OR (IC 95%) | p | Alelo | Frecuencia alélica | p | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| n (%) | n (%) | |||||||
| CM | Controles | CM | Controles | |||||
| AA | 34 (0.337) | 42 (0.404) | ||||||
| 1.44 (0.79-2.62) | N.S. | A | 0.609 | 0.634 | ||||
| AG | 55 (0.544) | 47 (0.452) | N.S. | |||||
| 0.98 (0.4-2.4) | N.S. | G | 0.391 | 0.366 | ||||
| GG | 12 (0.119) | 15 (0.144) | ||||||
| Exón 5 G/A (c.520G>A) | ||||||||
| GG | 100 (0.990) | 93 (0.894) | ||||||
| 24.7 (1.4-4.25) | < 0.05 | G | 0.99 | 0.951 | ||||
| GA | 0 (0.000) | 11 (0.106) | < 0.05 | |||||
| 0.014 (0-1.04) | < 0.05 | A | 0.01 | 0.049 | ||||
| AA | 1 (0.010) | 0 (0.000) | ||||||
Todos los grupos estuvieron en equilibrio de Hardy-Weinberg.
OR: odds ratio; IC 95%: intervalo de confianza del 95%; N.S.: no significativo.
Por otra parte, el análisis de las frecuencias genotípicas y alélicas de la variante c.520G>A del exón 5 mostró que tanto las pacientes con CM como las del grupo control tuvieron una mayor frecuencia del genotipo GG (99 y 89.42%, respectivamente) en comparación con los genotipos GA y AA, que mostraron una menor proporción en ambos grupos; no obstante, estas diferencias fueron estadísticamente significativas entre los grupos estudiados: GA vs. GG (OR: 24.7; intervalo de confianza [IC]: 1.4-4.25; p = 0.008) y AA vs. GG (OR: 0.014; IC: 0-1.04; p = 0.0005).
Debido a que la distribución de los genotipos del exón 5 se concentró prácticamente en el genotipo GG, tanto en pacientes con CM como en el grupo control, solo se consideró realizar el análisis de las características clinicopatológicas en las pacientes con CM y su relación con los diferentes genotipos para el exón 1 del gen ORM1.
Al realizar el análisis de las características ginecoobstétricas divididas por genotipo AA, AG y GG del exón 1 en pacientes con CM y el grupo control, no se encontró diferencia significativa entre la menarca, edad de la primera gestación, número de gestaciones, partos, abortos, fecha de última menstruación ni menopausia. Solo se encontró que las pacientes con CM y genotipo GG tuvieron una mayor edad al momento de su fecha del último parto, en comparación con las pacientes de genotipo AA y AG (36.44 ± 0.83 vs. 32.35 ± 0.98 y 31.44 ± 0.83, respectivamente), siendo estos resultados estadísticamente significativos (p < 0.05) (Tabla 3).
Tabla 3 Características ginecoobstétricas en pacientes con CM divididas por genotipo del exón 1 del gen ORM1
| Variable | AA (n = 34) | AG (n = 55) | GG (n = 12) | Comparación de genotipos | Valor de p |
|---|---|---|---|---|---|
| Menarca (edad) | 12.94 ± 0.28 (10-16) | 12.78 ± 0.16 (10-16) | 12.78 ± 0.16 (10-16) | AA vs. AG | 0.591 |
| AA vs. GG | 0.494 | ||||
| AG vs. GG | 0.603 | ||||
| Edad 1.ª gestación | 21.53 ± 0.88 (16-37) | 21.75 ± 1.12 (0-36) | 21.75 ± 1.12 (0-36) | AA vs. AG | 0.078 |
| AA vs. GG | 0.495 | ||||
| AG vs. GG | 0.608 | ||||
| Gestaciones (n) | 4.18 ± 0.43 (1-13) | 3.35 ± 0.32 (0-15) | 3.345 ± 0.32 (0-15) | AA vs. AG | 0.277 |
| AA vs. GG | 0.932 | ||||
| AG vs. GG | 0.392 | ||||
| Paras (n) | 2.97 ± 0.45 (0-12) | 2.15 ± 0.28 (0-11) | 2.15 ± 0.28 (0-11) | AA vs. AG | 0.521 |
| AA vs. GG | 0.562 | ||||
| AG vs. GG | 0.222 | ||||
| Abortos (n) | 0.5 ± 0.15 (0-3) | 0.51 ± 0.12 (0-3) | 0.51 ± 0.12 (0-3) | AA vs. AG | 0.963 |
| AA vs. GG | 0.545 | ||||
| AG vs. GG | 0.525 | ||||
| FUP (edad) | 32.35 ± 0.98 (24-41) | 31.44 ± 0.83 (20-48) | 36.44 ± 1.48 (31-46) | AA vs. AG | 0.4916 |
| AA vs. GG | < 0.05 | ||||
| AG vs. GG | < 0.05 | ||||
| FUM (edad) | 45.32 ± 0.84 (33-54) | 44.73 ± 0.80 (26-59) | 44.73 ± 0.80 (26-59) | AA vs. AG | 0.626 |
| AA vs. GG | 0.117 | ||||
| AG vs. GG | 0.076 | ||||
| Menopausia (edad) | 45.63 ± 1.02 (35-62) | 47.11 ± 1.05 (26-65) | 47.11 ± 1.05 (26-65) | AA vs. AG | 0.335 |
| AA vs. GG | 0.506 | ||||
| AG vs. GG | 0.961 |
Los resultados están dados en promedios ± error estándar (rangos).
FUM: fecha de última menstruación; FUP: fecha del último parto.
El análisis de las características histopatológicas del tumor, divididas por genotipos, mostró que las pacientes con CM y genotipo AA presentaron un menor promedio de tamaño de tumor (2.57 ± 0.25 cm) en comparación con las que tenían genotipo AG (3.51 ± 0.35 cm) y GG (3.18 ± 0.46 cm), sin embargo no hubo diferencias estadísticamente significativas.
Solo pudimos observar una tendencia significativa en el subtipo histológico, cuando las muestras eran triple negativo y estaban agrupadas en el genotipo GG; así como para la presencia de metástasis y su relación con el genotipo GG del exón 1 del gen ORM1 (Tabla 4).
Tabla 4 Características histopatológicas del tumor en pacientes con cáncer de mama divididas por genotipos del exón 1 del gen ORM1
| Variables | AA (n = 34) | AG (n = 55) | GG (n = 12) | Genotipos | OR (IC 95%) | p |
|---|---|---|---|---|---|---|
| *Tamaño del tumor (cm) | 2.57 ± 0.25 (0.5-5) | 3.51 ± 0.35 (0.9-14) | 3.18 ± 0.46 (1-6) | AA vs. AG | 0.72 (0.30-1.70) | 0.45 |
| AA vs. GG | 1.03 (0.42-2.23) | 0.94 | ||||
| AG vs. GG | 0.97 (0.39-2.37) | 0.94 | ||||
| Subtipo histológico (%) | ||||||
| Luminal A | 23.5 | 25 | 0 | AA vs. AG | 0.79 (0.20-3.04) | 0.93 |
| Luminal B | 17.7 | 21.9 | 20 | AA vs. GG | 2.80 (0.20-157.11) | 0.73 |
| Triple negativo | 58.8 | 53.1 | 80 | AG vs. GG | 3.52 (0.30-32.54) | 0.52 |
| Estadio (%) | ||||||
| I | 8.8 | 12.7 | 8.3 | AA vs. AG | 0.45 (0.12-1.98) | 0.12 |
| II | 38.2 | 52.7 | 41.7 | AA vs. GG | 0.98 (0.22-4.27) | 0.97 |
| III | 53 | 29.1 | 50 | AG vs. GG | 2.9 (0.11-7.1) | 0.45 |
| IV | 0 | 5.5 | 0 | |||
| Metástasis (%) | ||||||
| Sí | ||||||
| Local | 91.2 | 81.8 | 91.7 | AA vs. AG | 0.84 (0.35-2.0) | 0.7 |
| Distal | 0 | 5.5 | 0 | AA vs. GG | 2.53 (0.63-10) | 0.18 |
| No | 8.8 | 12.7 | 8.3 | AG vs. GG | 3 (0.8-11.2) | 0.09 |
*Los resultados están dados en promedios ± error estándar (rangos).
El estudio en las pacientes con CM del tiempo de evolución de la enfermedad, dividido por genotipos AA, AG y GG, mostró que las pacientes con genotipo AG presentaron el mayor promedio en el tipo de evolución de la enfermedad en comparación con las pacientes con genotipo AA (3.9 ± 0.6 vs. 2.53 ± 0.36 años, respectivamente; p < 0.05) y genotipo GG (3.12 ± 0.92 años) (Fig. 1).
Discusión
Nuestro trabajo es el primero que estudia la relación que existe entre las características clínicas del CM y las variantes c.113G>A del exón 1 y c.520G>A del exón 5 del gen ORM1 en población mexicana, las cuales pueden modificar la estructura primaria de la proteína que codifican la AGP1. Esta proteína está relacionada con procesos biológicos tales como la respuesta de fase aguda e inflamación, regulación negativa de la producción de IL-6 y del factor de necrosis tumoral, así como la desgranulación de neutrófilos y plaquetas; todos ellos asociados a respuesta antitumoral2,8,17-21.
Estas variantes del gen ORM1, de igual forma, pueden modificar funciones que tiene la proteína AGP1 relacionadas con el transporte de fármacos, ya que estas variables difieren entre sí en el sitio activo de unión a fármacos, afectando finalmente el curso clínico de enfermedades como el CM2,8,17-21.
En regiones del norte de Suecia se ha reportado que el genotipo GG de la variante c.113G>A del exón 1 de este gen tiene una frecuencia significativamente mayor en pacientes con CM en comparación con el grupo control de la misma área geográfica. Similares resultados se obtienen para la población del sur de Alemania en diferentes tipos de cáncer, incluido el CM3,22. Sin embargo, en nuestro estudio los genotipos de esta variante se distribuyen de manera similar entre las pacientes con CM y el grupo control.
En relación con los parámetros clínicos asociados con las variantes del exón 1, existe en general escasa información en la literatura. No obstante cuando se estudia al CM y su relación con variantes genéticas, debemos tomar en cuenta en el análisis, factores como la edad y antecedentes ginecoobstétricos (edad de la primera gestación, número de gestaciones, partos, abortos, etc.), ya que se ha descrito que estas variables pueden aumentar la concentración plasmática de proteínas proinflamatorias y/o cambiar la expresión génica de proteínas relacionadas con la respuesta inmunitaria, favoreciendo y/o anulando la presencia de mecanismos antitumorales a largo plazo23-25.
Así, nuestro estudio muestra que las pacientes con CM y genotipo GG del exón 1 presentaron una mayor edad al momento de su fecha de último parto; lo que posiblemente indica que esta variante podría estar aumentando la concentración plasmática de la proteína AGP1, favoreciendo su actividad inmunomoduladora durante la progresión de la enfermedad.
Por otro lado, estudios de la variante c.520G>A del exón 5 en estirpe europea, americana y asiática, muestran que el genotipo GG, es el genotipo predominante26, tal como sucedió para la población mexicana. Esta distribución es difícil de explicar, sin embargo especulamos que el fenómeno podría ser parte de una deriva génica, donde se ha fijado o extinguido uno de los alelos, lo que provoca de manera general una disminución de la variabilidad genética en la población humana.
Nuestro estudio también muestra que en pacientes con CM, el genotipo GG del exón 5, el cual codifica la isoforma F1 de la proteína AGP1, es predominantemente significativo con respecto a los genotipos GA, AA del mismo grupo, así como con los genotipos del grupo control. Por lo que en nuestra población la variante GG del exón 5 (isoforma F1) podría estar asociada a cáncer, al contrario de lo que se publica para la población europea, en la cual aunque la variante GG del exón 5 también es predominante, al parecer la variante c.113G>A del exón 1 (es decir, la isoforma S) está asociada con cáncer, al ser más inmunosupresora que la isoforma F3,4.
Estos resultados discrepantes pueden estar determinados por las diferencias étnicas de las poblaciones estudiadas. En México los antecedentes históricos de mestizaje se han descrito desde el periodo virreinal; de la convivencia de los tres principales grupos étnicos primarios (indígenas, españoles y negros) emergieron nuevos grupos secundarios creando un mestizaje vasto. Por lo que conocer la variabilidad genética de esta y otras variantes que se presentan en nuestra población permitirá establecer las bases biológicas para comprender su relación con enfermedades e influir en el pronóstico de estas27.
El gen ORM1 presenta diversas variantes genéticas, que pudieran funcionar como sitios blanco para microRNA y regular la expresión del gen ORM128; ya que algunos trabajos publicados en proteómica reportan la relación que existe entre la proteína AGP1 y el pronóstico de pacientes con CM29, así como la correlación que existe entre esta proteína y los diferentes estadios clínicos del cáncer7,17,30,31.
Debido a lo anterior, consideramos que una limitación de nuestro estudio es, entonces, la falta de correlación entre el genotipo del gen ORM1 y el fenotipo (definido por los niveles séricos de AGP1 que presentan las pacientes con CM), además de cómo estos diferentes genotipos podrían estar influenciando la efectividad de la quimioterapia y la tasa global de supervivencia, por lo que se tendrán que realizar estudios longitudinales que nos permitan resolver estas incertidumbres hasta ahora existentes.
Como podemos observar, las variantes del gen ORM1 podrían intervenir en CM, afectando el curso clínico y progresión de la enfermedad8,29. Sin embargo, serán necesarios futuros estudios en diferentes poblaciones, que nos ayuden a vincular a estas variantes con las características clínicas del CM.
Así, las variantes del gen ORM1 y su proteína AGP1 parecen ser potenciales componentes de una red biológica de señalización en padecimientos como el cáncer, por lo que estudiarlos podría servir para el seguimiento, pronóstico y tratamiento de pacientes con CM18,28,32-34.
Conclusiones
Nuestro estudio muestra que en pacientes con CM, el genotipo GG de la variante c.520G>A del exón 5 (isoforma F de la proteína AGP1) es más frecuente en comparación con los genotipos GA y AA, siendo por lo tanto más inmunosupresor que los otros genotipos. Contrario a lo que se publica para otras regiones del mundo, en donde se asevera que la variante c.113G>A del exón 1 (isoforma S de la proteína AGP1) es más inmunosupresora que la isoforma F.
