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ANTECEDENTES
La prevalencia de alergias se ha incrementado vertiginosamente en todo el mundo, convirtiéndose en un problema de salud pública.1 Cada año, la descripción de nuevos alérgenos permite el diagnóstico certero y la implementación de medidas específicas, además de evitar el contacto con alérgeno o el uso de tratamientos moduladores, como la inmunoterapia alergeno-específica.2
Las alergias a artrópodos son respuestas que tienden a ser graves y van desde reacciones cutáneas locales hasta reacciones sistémicas potencialmente mortales, como la anafilaxia, sobre todo las reacciones a venenos de especies del género Hymenoptera.3 Sin embargo, otros artrópodos también poseen componentes capaces de desencadenar alergias. Un ejemplo notable es el género Scolopendra que contiene, entre otras especies, el popularmente conocido "ciempién", que se encuentran distribuidos en zonas tropicales y subtropicales, y cuyas picaduras pueden causar dolor intenso y manifestaciones cutáneas locales: eritema, vesículas hemorrágicas, ampollas, pústulas y necrosis.4,5 Sin embargo, la evidencia de alergias al género Scolopendra es escasa, lo que plantea un desafío para el diagnóstico y tratamiento de estas reacciones. La identificación de nuevas fuentes y alérgenos, además de diversos factores asociados facilita la comprensión y el tratamiento en pacientes con tipo de enfermedades diversas.
En el 2019 se describió un nuevo alérgeno, Sco m 5, una proteína de veneno con alto contenido de cisteína (CAP) en el veneno de Scolopendra subspinipes, con capacidad de unión a la IgE y reacción cutánea demostrada por pruebas intraepidérmicas.6 En 2021, la IUIS enumera 106 nuevos alérgenos de diversas fuentes, incluido el Sco m 5. Se conoce que todos los escolopendromorfos son venenosos y los componentes moleculares son muy parecidos entre las diferentes especies del género.7 Además, otras especies de artrópodos, incluidos los himenópteros, tienen en común proteínas secretoras ricas en cisteínas (CAPs por su siglas en inglés) en sus venenos, por lo que la determinación de la identidad de estas moléculas es relevante para entender su relevancia como desencadenante de alergias. Por lo tanto, es probable que, debido al alto grado de homología entre las CAPs, se plantea la posibilidad de reactividad cruzada a través del mimetismo molecular. Con base en lo anterior, el objetivo de este estudio fue: Evaluar la reactividad cruzada entre Sco m 5 y proteínas de artrópodos mediante análisis in silico e identificar posibles epítopes de unión a IgE.
MÉTODOS
La metodología del análisis in silico se describe en la Figura 1.
Figura 1 Diagrama de flujo para el análisis in silico de mimetismo molecular de Sco m 5 y alérgenos. La selección de secuencias se efectuó con UniProt; el análisis filogenético con MEGA; el alineamiento de secuencias con AllerMatch; y el modelado estructural 3D se genera mediante SWISS-MODEL y AlphaFold. La predicción de epítopes con IEDB. El análisis de mimetismo molecular se apoya en herramientas de modelado estructural y superposición molecular. Finalmente, los resultados obtenidos se interpretan para evaluar la posible reactividad cruzada entre los alérgenos.
Selección de proteínas y alineación
Para la selección de proteínas se realizó el análisis de comparación de la secuencia del alérgeno Sco m 5, obtenida de Uniprot (https://www.uniprot.org) con secuencias de proteínas existentes con el programa de la web Allermatch (https://www.allermatch.org). Se seleccionaron las secuencias con valores de identidad mínima del 39%. El conglomerado de secuencias se obtuvo de la base de datos Uniprot (https://www.uniprot.org) y NCBI, por sus siglas en inglés (National Center for Biotechnology Information). Debido a la variedad de origen y longitud de aminoácidos entre las moléculas estudiadas, se utilizaron de cobertura e identidad para establecer el grado de relación entre ellas. Los valores de identidad y cobertura entre las moléculas se determinaron con EMBOSS Needle (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/), especializado para realizar alineamientos pareados y el servidor web de Praline (https://www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/), que permite construir alineamientos pareados y múltiples. Al momento de realizar el alineamiento se consideró que las secuencias son diferentes y provienen de fuentes diferentes, por lo tanto, los parámetros para realizar el alineamiento se configuraron para BLOSUM62 (que evalúa principalmente la divergencia evolutiva) como matriz de intercambio y un ajuste de la matriz de puntuación condicional.
Análisis filogenético
La construcción del árbol filogenético se efectuó mediante el programa "Molecular Evolutionary Genetic Analysis" (MEGA) versión 11, utilizando el método de reconstrucción "Neighbor-Joining" soportado por Bootstrap con 100 repeticiones como medida de confiabilidad y robustez y las distancias evolutivas se calcularon con el método de corrección de Poisson. El modelo utiliza una matriz de comparación para encontrar similitudes entre secuencias. La matriz se construyó con todas las secuencias de aminoácidos de las proteínas seleccionadas. Todos los espacios vacíos se eliminaron (supresiones completas). A partir de la comparación global y de las homologías se presentó la suma de longitud de las ramas (SBL), que determina la cantidad y posición de nodos, incluidos los "clusters" de las secuencias evolutivamente más cercanas.8
Modelos 3D de las proteínas
Los modelos de las proteínas evaluadas se adquirieron por Protein Data Bank y AlphaFold. Por su parte, las proteínas sin estructura 3D definida se modelaron por homología con el servidor Swiss Model (https://swissmodel.expasy.org/), tomando en cuenta para la selección de estos parámetros como: GMQE (Global Model Quality Estimate), QMEAN score, porcentaje de identidad y gráfico de Ramachandran; y se refinaron en ModRefiner (https://zhanggroup.org/ModRefiner/), un algoritmo para el refinamiento de la estructura de proteínas de alta resolución a nivel atómico.
Predicción de epítopes
Los modelos se emplearon para identificar los residuos expuestos en la superficie con Ellipro (http://tools.iedb.org/ellipro/), con la intención de predecir epítopos lineales y discontinuos en la Sco m 5 de y las moléculas encontradas. Los epítopos potenciales fueron seleccionados con el criterio de score ≥ 7, porque este valor evalúa qué tan expuesto se encuentra el residuo y la capacidad de unión del epítopo con el paratope.
RESULTADOS
Alergenos obtenidos y análisis de los alineamientos múltiples
Un total de 180 proteínas provenientes de 16 fuentes alergénicas tuvieron homología con Sco m 5. De estas, 15 mostraron identidades superiores al 30%, incluidas las especies de abejas, avispas, hormigas, ácaros y arácnidos (Cuadro 1). Estas proteínas se reportan como alérgenos de veneno tipo 5 (VAS) y/o Proteínas Venenosas Ricas en Cisteína (CRVP), excepto los alérgenos Der f 16, Sol s 2 y Sol i 4, que corresponden a la actividad proteasa de serina y alérgeno de veneno tipo IV, respectivamente, y para Sol i 4 aún no se conoce su actividad biológica.
La longitud de aminoácidos de las secuencias seleccionadas fue heterogénea; las longitudes más cortas fueron las de Solenopsis saevissima (Sol s 2) y Solenopsis invicta (Sol i 4) con 137 aminoácidos cada una, y el alérgeno Der f 6 del ácaro Dermatophagoides farinae tuvo la secuencia más larga con 279 aminoácidos. Las proteínas de las hormigas: Solenopsis invicta y Solenopsis saevissima resultaron con iguales valores de identidad y similitud de 69.2 y 84.6%, respectivamente, y mostraron la conservación más alta de las secuencias primarias, lo que sugiere una notable similitud estructural y funcional respecto a Sco m 5.
En cuanto a las especies del género Vespula (V. flavopilosa, V. vulgaris, V. maculifrons, V. germanica, V. pensylvanica y V. vidua), el grado de conservación fue más moderado, cuya identidad varió del 39 al 42% y las similitudes del 61 al 64%. Dentro de este grupo, Vespula maculifrons y Vespula germanica tuvieron mayores similitudes, con un 63.8%, lo que indica que aunque sus secuencias primarias no muestran una alta identidad con Sco m 5, aún mantienen una estructura funcional considerablemente conservada. Respecto de las especies de Polybia y Polistes, se observó una tendencia similar a la de las especies pertenecientes al género Vespula, con valores de identidad en torno al 39% y similitudes un poco más elevadas, del 64 al 66%.
El alérgeno de Dermatophagoides farinae (Der f 6), con una identidad del 48.1% y similitud del 63%, y el alérgeno de la araña Phoneutria keyserlingi con una identidad del 40.2% y similitud del 56.1%, reportó el menor grado de conservación con Sco m 5. Esto refleja una mayor divergencia evolutiva, por lo que, aunque pueda compartir ciertos elementos funcionales básicos, la estructura general del alérgeno es significativamente diferente comparada con Sco m 5.
Cuadro 1 Secuencias de proteínas seleccionadas por Allermatch comparadas con Sco m 5
| Organismos | Nombre del alérgeno | Uniprot o NCBI entrada | Uniprot, Alphafold, PDB (estructura 3D) | Aminoácidos | Identidad | Similitud |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Scolopendra subspínipes | Sco m 5 | A0A5B8TW80 | AF-A0A5B8TW80-F1 | 210 | N/A | N/A |
| Vespula flavopliosa | Ves f 5 | P35783 | AF-P35783-F1 | 204 | 41.3% | 62.5% |
| Vespula vulgaris YJ | Ves v 5 | Q05110 | 1QNX X-ray | 227 | 41.8% | 63% |
| Vespula maculifrons | Ves m 5 | P35760 | AF-P35760-F1 | 204 | 42% | 63.8% |
| Vespula germanica | Ves g 5 | P35784 | AF-P35784-F1 | 204 | 42% | 63.8% |
| Vespula pensylvanica | Ves p 5 | P35785 | AF-P35785-F1 | 204 | 39.9% | 61.2% |
| Vespula vidua | Ves vi 5 | P35787 | AF-P35787-F1 | 206 | 39% | 61% |
| Polybia scutellaris | Pol s 5 | Q72156 | AF-Q72156-F1 | 207 | 39.2% | 65.9% |
| Polybia paulista | Poly p 5 | D4P2Y4 | AF-D4P2Y4-F1 | 206 | 39.4% | 64.6% |
| Polistes gallicus | Pol g 5 | P83377 | AF-P83377-F1 | 206 | 39.8% | 65.2% |
| Polistes dominula | Pol d 5 | P81656 | AF-P81656-F1 | 227 | 39.8% | 65.7% |
| Brachyponera chinensis | Pac c 3 | COITL3 | AF-COITL3-F1 | 199 | 39.7% | 64.4% |
| Solenopsis invicta | Sol i 4 | P35777 | AF-P35777-F1 | 137 | 69.2% | 84.6% |
| Solenopsis saevissima | No Allergen Name | D4P8F3 | AF-D4P8F3-F1 | 137 | 69.2% | 84.6% |
| Dermatophagoides farinae | Der f 6 | P49276 | AF-P49276-F1 | 279 | 48.1% | 63% |
| Phoneutria keyserlingi | VA_PHOKE | P85860 | AF-P85860-F1 | 147 | 40.2% | 56.1% |
*Alérgenos con identidad mayor del 30% en relación con Scolopendra subspinipes. Los alergenos con identidad mayor del 50% se resaltan en color morado. N/A: no aplica, porque es la secuencia de referencia.
Resultados de árbol filogenético
El árbol filogenético de las secuencias proteicas alergénicas de cada especie se realizó teniendo en cuenta el vecino más cercano y no en relación con el ancestro común. La distancia de las ramas del árbol filogenético fue de 0.2 (divergencia baja) y se utilizó como referencia para agrupar las especies más cercanas en tres clados: A, B y C. Por su cercanía en el clado A (6 secuencias) se agruparon todas las especies de Vespulas, en el clado B (5 secuencias) todas las especies de Polistes, Polybia, y Brachyponera, y en el clado C (3 secuencias) las especies de Solenopsis y Dermatophagoides. La secuencia de la especie Phoneutria Keyserlingl y Sco m 5 fueron las más distantes y no se agruparon en ninguno de los tres clados. Figura 2
Se realizaron siete alineamientos múltiples, un primer alineamiento de las 15 secuencias alergénicas seleccionadas con Sco m 5, los otros seis de los clados, 3 de ellos para las secuencias de cada clado y los otros tres para las secuencias de cada clado con Sco m 5. El alineamiento múltiple de la comparación de Sco m 5 con los 15 homólogos alergénicos arrojó una identidad de 50%, con regiones que mostraron un grado mediano de conservación entre las proteínas estudiadas. Figura 3
Los alineamientos de los clados A, B, y C arrojó valores de identidad del 88, 72 y 50% respectivamente, con un alto grado de identidad entre las secuencias de los clados A y B. Figura 4, A, B, C
El alineamiento múltiple de Sco m 5 con los alérgenos de los clados A, B y C reportó valores de identidad del 77, 64 y 33%, respectivamente. Se observaron regiones conservadas (en rojo y naranja) entre las proteínas comparadas, predominando estas regiones en los clados A y B, donde se encontró mayor similitud con Sco m 5. Figura 5 A, B, C
Figura 2 Árbol filogenético de las secuencias alergénicas, llevado a cabo con el método del vecino más cercano. Se obtuvieron tres clados designados con las letras A, B y C.
Figura 3 Alineamiento múltiple de secuencias alergénicas. El alineamiento de las secuencias alergénicas se realizó con el programa Praliné (http://www.ibi.vu.nl/). Los colores representan el grado de conservación: el azul indica el menos conservado y el rojo el de mayor conservación.
Figura 4 Alineamientos múltiples de los clados A, B, C y el alérgeno Sco m 5. Identidad entre el alérgeno rico en cisteína Sco m 5 de Scolopendra subspinipes y proteínas alergénicas de distintos grupos de artrópodos, incluidas abejas (72%), avispas (88%), hormigas y ácaros (50%), y arañas (40.2%).
Predicción de epitopes
En la predicción de epítopes se identificaron un total de 16 posibles epítopes de unión a IgE en el alérgeno Sco m 5, de los que siete fueron lineales y nueve conformacionales. De acuerdo con el puntaje, la ubicación y exposición de estos epítopes, solo 2 lineales y 1 conformacional cumplieron con los criterios para incluirse en el estudio. Figura 6 A y B
De los tres epítopes obtenidos, dos se encontraron en regiones conservadas entre los alérgenos estudiados de los clados A y B. Esto refuerza la hipótesis de reactividad cruzada por mimetismo molecular, en particular con los componentes proteicos del veneno de Vespula, Polistes, Polybia y Brachyponera.
Figura 6 Epítopes lineales y conformacionales en la superficie de Sco m 5. Los modelos de superficie representan la posición por los epítopes predichos en Sco m 5. Todos los epítopes se indican en color, según el nivel de confianza (de mayor a menor; rojo, verde y azul) en los patrones de la superficie.
DISCUSIÓN
Las picaduras de insectos contienen una compleja mezcla de proteínas y péptidos tóxicos que pueden reconocerse por la IgE y desencadenar una respuesta alérgica. Dentro de las principales fuentes de sensibilización se encuentran las especies pertenecientes al género Hymenoptera, y su principal componente de sensibilización son las fosfolipasas.3 Otros artrópodos, como los miriápodos, también contienen venenos con componentes capaces de desencadenar alergia, como es el caso del ciempiés del género Scolopendra sp.9
El veneno del ciempiés está compuesto por diversas sustancias bioactivas que afectan a diferentes sistemas en el humano.9 Algunos componentes del veneno tienen capacidad antimicrobiana, toxicidad hematológica y enzimas (metalopeptidasas, serinas peptidasas, γ-glutamil transpeptidasa, fosfolipasa A2, hidrolasas glucosídicas, quitinasa, lisozima y hialuronidasa). Los componentes moleculares son similares entre el veneno de las diferentes especies del género. Por lo tanto, es probable que, debido al alto grado de identidad con componentes del veneno de otras especies exista reactividad cruzada por mimetismo molecular. Esta hipótesis se respalda por los resultados de nuestro estudio, en donde describimos por primera vez un total de 16 alérgenos que mostraron identidades superiores al 30% con Sco m 5.
Las proteínas de veneno ricas en cisteínas (CAPs) son un componente importante del veneno de diversas especies, por ejemplo: el alérgeno principal de Scolopendra sp (Sco m 5), que representa una proteína altamente conservada. A diferencia de la fosfolipasa, no se han realizado evaluaciones extensivas de una posible reactividad cruzada con otras proteínas de la misma familia, perteneciente a otras fuentes alérgicas. A la fecha, este es el primer trabajo que evalúa a través de diversas herramientas bioinformáticas la posible reactividad cruzada entre Sco m 5 y proteínas de diversas fuentes alérgicas y la identificación de posibles epítopes de unión con IgE. Los accidentes de inoculación de venenos por Scolopendra sp reportan efectos menores: dolor moderado a grave, asociado con inflamación local,10 incluso se han reportado casos esporádicos de anafilaxia,4 confundiendo la posible reacción alérgica con las reacciones adversas por envenenamiento. El género Scolopendra es cosmopolita y de acuerdo con nuestros resultados, los individuos expuestos al veneno pueden desencadenar respuestas alérgicas con diferentes fuentes de veneno provenientes de otras especies, como abejas y avispas, por reactividad cruzada.6
Los análisis filogenéticos mostraron distancias evolutivas muy cortas, con alta conservación entre las diferentes secuencias y apoyan la posibilidad de reactividad cruzada por mimetismo molecular. El mimetismo molecular juega un papel fundamental en la reactividad cruzada entre alérgenos de artrópodos, debido a la alta similitud estructural y secuencial que muestran ciertas proteínas en diferentes especies. Este fenómeno se origina cuando los epítopes de alérgenos en una especie, como los ácaros del polvo o ciertos insectos, comparten estructuras similares con alérgenos de otras especies de artrópodos, lo que provoca respuestas inmunológicas cruzadas en individuos sensibilizados. En estudios previos se ha informado el alto grado de conservación entre las fosfolipasas de diferentes especies (uno de los componentes más representativos en el veneno de los artrópodos, incluidas las especies de abejas, avispas, hormigas, arañas y escorpiones), con identidades en las secuencias superiores al 79% y, además, caracterizando posibles epítopes que explican la reactividad cruzada.3,11 Respecto a las CAPs, la identidad entre la Sco m 5 y los 15 alergénos fue menor a lo reportado con las fosfolipasas, pero al formar los clados, el A mostró identidades del 77%, lo que sugiere una mayor identidad entre las CAPs de vespulas y Scolopendra, y evidencia que estas proteínas pueden tener regiones funcionales comunes y, en consecuencia, reactividad cruzada. En el clado C, las fuentes alergénicas del ácaro Dermatophagoides y hormigas no reportaron alta identidad (33%). Esto coincide con los resultados de las fosfolipasas, donde la proteína de la hormiga tiene identidades cercanas al 37% con las avispas y abejas, y baja probabilidad de reactividad cruzada.12
Dentro de las limitantes de este estudio se encuentran: existe poca información acerca de este alérgeno, y la evaluación del papel de este alergeno en pacientes alergénicos a los artrópodos, a la fecha, es limitada. También, es importante considerar que las aproximaciones de los resultados in silico deben evaluarse con estudios in vivo e in vitro para confirmar los hallazgos obtenidos. Sin embargo, los análisis in silico son herramientas robustas que permiten establecer el curso de investigaciones futuras para disminuir costos y tiempo.
CONCLUSIÓN
Existe elevada probabilidad de reactividad cruzada entre Sco m 5 y proteínas de otros artrópodos, especialmente himenópteros. La identificación de potenciales epítopes en regiones conservadas sustenta esta idea y pueden ser puntos importantes para blancos terapéuticos en las alergias desencadenadas por venenos de artrópodos, especialmente en los poco estudiados (especies del género Scolopendra spp).
