3.1 Preparación de los sustratos, siembra del micelio y muestreo

Los sustratos (paja de trigo, yucca, maguey y olote) fueron sometidos a un proceso de esterilización a 120 ºC durante 1 hora en una autoclave. Se colocaron 50 g de las diferentes mezclas de sustrato (Tabla 1) en bolsas de polietileno, en seguida fueron mezcladas con 15% (p/p) de semilla de sorgo, la cual, fue previamente inoculada con micelio del hongo P. ostreatus, las bolsas fueron cerradas y perforadas para permitir la salida de los cuerpos fructíferos al crecer el hongo. Se sembraron 21 bolsas para cada tratamiento y se tomaron tres muestras cada 7 días, se establecieron controles positivos para cada uno de los tratamientos (paja de trigo, yuca, maguey y olote) en base a un trabajo previo, desarrollado por el Departamento de Ciencia y Tecnología de Alimentos de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN), donde se evalúo la producción de enzimas hidrolíticas (amilasas, celulasas y xilanasas) utilizando el hongo Pleorutus ostreatus^[29]. El proceso fue llevado a cabo durante 35 días en un cuarto de cultivo a una temperatura de 23 - 25 ºC y con una humedad relativa de 80 - 90%. Se utilizó un diseño experimental de bloques al azar, el cual se muestra en la Tabla 1. Se realizaron 3 repeticiones para cada tratamiento.

3.2 Obtención del extracto enzimático

Para la obtención del extracto enzimático se agregaron 50 mL de buffer de citratos (0.1 M) pH 5.5 (ácido cítrico 0.1 M / citrato de sodio 0.1 M) a cada tratamiento (bolsa de polietileno inoculada), estas fueron agitadas y su contenido fue filtrado con papel Whatman^® No. 1 usando una bomba de vacío. El filtrado fue recolectado y se mantuvo en congelación hasta su uso. Es importante señalar que la actividad enzimática inicial en las semillas de sorgo (previamente inoculadas con micelio de P. ostreatus), fue inactivada mediante una autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

3.3 Ensayos enzimáticos

3.4 Análisis estadístico

Todas las mediciones fueron realizadas por triplicado y los datos fueron expresados como el promedio ± la desviación estándar. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor, y las medias fueron comparadas mediante la prueba de Tukey con un nivel de significancia de 5% (p ( 0.05), los datos fueron procesados utilizando el software Minitab^®.

4.1 Determinación de la actividad amilasa

En la Figura 1 se presenta la cinética de actividad amilasa durante el desarrollo del hongo P. ostreatus en las diferentes mezclas de sustrato de paja de trigo y yucca. El pico máximo de actividad amilasa se detectó a los 7 días del cultivo del hongo en los sustratos compuestos por 40 y 50% de yucca. Esto coincide con los resultados obtenidos por Ergun y Urek (2017), quienes reportaron que la mayor actividad amilasa de hongos P. ostreatus cultivados utilizando cáscaras de papa generalmente se dio a los 7 días ^[33]. Posteriormente, la actividad disminuyó notablemente, sin embargo, se presentó un ligero incremento en el día 28 y posterior reducción al día 35. En un estudio previo, se reportó que, la máxima actividad amilasa se produjo a los 14 días de la cinética de fermentación, manteniéndose constante hasta los 21 días ^[29]. Se ha reportado que en los primeros días de la cinética de fermentación, los microorganismos fúngicos desarrollan sistemas enzimáticos rápidamente con el objetivo de degradar los azúcares disponibles en el medio, sin embargo, en seguida la actividad enzimática comienza a decrecer debido a la presencia de otras moléculas (como azúcares reductores o aminoácidos) que inhiben la producción enzimática y pueden retardar su crecimiento ^[6]. La mayor actividad enzimática fue de 3896 UE · L^-1 y se presentó en la mezcla con 50% de yucca, de acuerdo al ANOVA se obtuvo diferencia significativa entre los tratamientos 1, 2 y 3 (p<0.05). La enzima amilasa ha sido clasificada como una enzima inducible, ya que la presencia de almidón en los sustratos de fermentación promueve su actividad ^[34].

Figura 1 Cinética de actividad amilasa utilizando paja de trigo y yucca como soporte (media ± desviación estándar representada por las barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05). 

En los sustratos compuestos por paja de trigo combinada con maguey (Figura 2) la mayor actividad amilasa fue detectada a los 28 días del cultivo del hongo, de acuerdo al ANOVA se obtuvo diferencia significativa entre los tratamientos a los 28 días (p<0.05). El hecho de que la mayor producción de amilasas se diera casi al final del periodo de cultivo del hongo puede deberse a que los azucares solubles son los principales consumidos durante el desarrollo del micelio ^[35]. El bagazo de maguey es un sustrato con una alta concentración de azucares reductores (5559.2 mg · L^-1) ^[36], cuando disminuye la concentración de azucares en el medio, aumenta la producción de otras enzimas hidrolíticas. La mayor actividad alcanzada fue de 3889 UE · L^-1 en el sustrato compuesto de paja de trigo combinada con maguey al 50%. Se han reportado niveles de producción de enzima amilasa alrededor de 495 UE · L^-1 a los 21 días de la cinética de fermentación, sin embargo, en el presente estudio se obtuvieron mayores niveles (3889 UE · L^-1), debido a efectos sinérgicos que pueden presentar los microorganismos en sistemas de fermentación sólida ^[29].

Figura 2 Cinética de actividad amilasa utilizando paja de trigo y maguey como soporte (media ± desviación estándar representada por las barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05). 

En los sustratos compuestos por paja de trigo y olote de maíz (Figura 3) se presentó un crecimiento exponencial de los 0 a los 28 días, alcanzando su pico máximo al final de este periodo en los sustratos que contenían olote al 30 y 50%, de acuerdo al análisis de varianza ANOVA se obtuvo diferencia significativa entre los 3 tratamientos (p<0.05). Los sistemas heterogéneos, compuestos por uno o más sustratos, favorecen el efecto sinérgico, alcanzando su mayor actividad ente los 20 y 30 días de la fermentación, debido a que el microorganismo induce la activación de diversas rutas metabólicas (ej. glucólisis, gluconeogénesis), en consecuencia, se acelera el aprovechamiento de cada una de las fuentes de carbono presentes ^[34]. En el sustrato con olote al 40%, se presentó un pico de actividad amilasa a los 14 días, posteriormente descendió a los 21 días, mostrando después un crecimiento exponencial y alcanzando la mayor actividad enzimática a los 35 días del experimento. El olote de maíz está compuesto en su mayoría por celulosa, hemicelulosa y lignina ^[14], lo cual puede inhibir la actividad amilasa durante los primeros días de la cinética de fermentación, sin embargo, la acción de otros complejos enzimáticos puede liberar azúcares más simples que pueden inducir la actividad amilasa durante los últimos días de la cinética de fermentación ^[37]. La actividad enzimática máxima en cada uno de los sustratos que contenían olote fue muy similar, presentándose una actividad de 3572 UE · L^-1 en el sustrato con 50% de olote y 3650 UE · L^-1 en los sustratos que lo contenían en un 30 y 40%.

Figura 3 Cinética de actividad amilasa utilizando paja de trigo y olote como soporte (media ± desviación estándar representada por las barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05). 

Determinación de la actividad celulasa

En la Figura 4 se puede observar el comportamiento cinético de la celulasa en los sustratos que contenían paja de trigo y yucca, el cual fue muy variado dependiendo de la proporción utilizada. Los mecanismos de producción de la enzima celulasa, varían ampliamente dependiendo de la constitución de los materiales, mostrando mayores rendimientos en algunos sistemas ^[37]. En el sustrato que contenía yucca en un 30%, la mayor actividad celulasa (6514 UE · L^-1) fue alcanzada a los 14 días de cultivo, sin embargo, después se presentó un descenso de actividad hacia los 28 días y nuevamente un crecimiento exponencial que se mantuvo hasta el final del periodo de fermentación. En el tratamiento con yucca al 40% se presentaron dos picos de actividad enzimática, el primero a los 7 días (5618 UE · L^-1) seguido por una disminución de la actividad a los 14 días, posteriormente volvió a aumentar hasta alcanzar su actividad máxima a los 28 días (5750 UE · L^-1). Finalmente, el sustrato con 50% de yucca fue el que presentó mayor actividad celulasa, esto puede deberse a su importante contenido de fibra (85 g · kg^-1) ^[10]. En el sustrato con mayor proporción de yucca, se exhibió un crecimiento exponencial a partir del inicio de la fermentación hasta los 21 días, y después se presentó un descenso notable de la actividad enzimática a los 28 días y creciendo nuevamente hasta alcanzar un máximo de actividad enzimática (7360 UE · L^-1) a los 35 días. En un estudio desarrollado para obtener enzima celulasa, utilizando paja de sorgo como soporte por fermentación sólida utilizando P. ostreatus se reportó un comportamiento similar, presentándose un crecimiento exponencial hasta los 21 días, sin embargo no se evaluó la producción enzimática en los días posteriores de la fermentación ^[29].

Figura 4 Cinética de actividad celulasa utilizando paja de trigo y yucca como soporte (media ± desviación estándar representada por barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05. 

En los sustratos que contenían maguey en diferentes proporciones (Figura 5), se observó un comportamiento similar entre sí caracterizado por un crecimiento exponencial a partir del inicio de la fermentación hasta los 7 días en los sustratos que contenían maguey en un 40 y 50%, y hasta los 14 días en el tratamiento con 30% de maguey, seguido por una disminución de la actividad celulasa, que se prolongó hasta los 14 días en el sustrato con maguey al 40% y hasta los 21 días de fermentación en los otros dos tratamientos. Dentro de los residuos utilizados en esta investigación, el bagazo de maguey, es el que presenta un mayor contenido de celulosa, pues se han reportado valores entre 42 y 46% ^[38], esto permite explicar el hecho que se obtuvieran altos rendimientos de producción de actividad celulasa en mezclas compuestas con bagazo de maguey, en comparación con los sustratos que contenían yucca y olote. Posteriormente, se observó un crecimiento exponencial de actividad enzimática presentando un pico máximo a los 28 días en los 3 tratamientos. La mayor actividad celulasa (7918 UE · L^-1) se determinó en el sustrato compuesto en un 50% de maguey, de acuerdo al análisis de varianza ANOVA se obtuvo diferencia significativa entre los 3 tratamientos (p<0.05). En un estudio en el que se utilizó bagazo de maguey para analizar la eficiencia biológica y crecimiento del hongo P. ostreatus, se obtuvo una alta producción de enzimas celulasas después de los 28 días de la cinética de fermentación, los autores reportan que los hongos aprovechan totalmente la pared celular de los residuos de bagazo de maguey, la cual es rica en lignina y celulosa ^[38].

Figura 5 Cinética de actividad celulasa utilizando paja de trigo y maguey como soporte (media ± desviación estándar representada por barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05. 

El comportamiento de la actividad celulasa en los sustratos que contenían paja de trigo y olote de maíz (Figura 6) fue variado según la proporción presente en cada tratamiento. En el sustrato que contenía olote en un 30%, se detectó un crecimiento exponencial del inicio de la fermentación a los 14 días, alcanzando su máxima actividad enzimática (3503 UE · L^-1) al término de ese periodo, seguido de un descenso de la actividad celulasa y nuevamente un crecimiento hacia el final del periodo de fermentación. El contenido de celulosa en el olote es de aproximadamente del 30 al 32% ^[39], lo cual se relaciona directamente con los altos índices de actividad celulasa obtenidos en la mezcla que contenía olote al 50%. En los tratamientos con olote al 40 y 50%, se presentaron dos picos de actividad enzimática. En el sustrato con olote al 40%, la magnitud de ambos picos fue similar, el primero a los 14 días (3958 UE · L^-1) y el segundo a los 28 días (4001 UE · L^-1). En el sustrato con olote al 50%, el primer pico se presentó a los 7 días de fermentación, seguido por una reducción de la actividad enzimática hacia los 14 días y un crecimiento exponencial que alcanzó un máximo de actividad (6178 UE · L^-1) a los 28 días, la cual fue notablemente mayor que en los tratamientos con una proporción mas baja de olote. Se ha reportado que las poblaciones microbianas en dichos sistemas consumen primero las fuentes de fácil fermentación y se desarrollan a gran velocidad. Sin embargo, van quedando otros azucares más complejos, como la celulosa, que necesitan de la acción previa de sistemas enzimáticos que degraden dichas macromoléculas en sus azúcares simples, para ser utilizados posteriormente por los microorganismos ^[34].

Figura 6 Cinética de actividad celulasa utilizando paja de trigo y olote como soporte (media ± desviación estándar representada por barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05. 

4.2 Determinación de la actividad xilanasa

En la Figura 7 se puede observar la cinética de la actividad xilanasa en las diferentes mezclas de paja de trigo y yucca. Se observó un crecimiento exponencial en los tres tratamientos a partir del inicio de la fermentación hasta los 7 días en los tratamientos con yucca al 30 y 40%. De la misma manera, en un estudio realizado utilizando cáscara de sandía, se reportó un incremento gradual de la actividad xilanasa hasta los siete días de la fermentación, sin embargo, después de este tiempo se observó una reducción en su rendimiento de producción ^[40]. En el sustrato con yucca al 50%, el crecimiento exponencial se prolongó hasta los 14 días, al final de los cuales se observó el pico máximo de actividad. En un trabajo previo desarrollado utilizando P. ostreatus, se obtuvo la actividad máxima de enzima xilanasa a los 21 días de la cinética de fermentación, debido a que la cinética de producción enzimática puede variar dependiendo de la composición de los sustratos ^[29]. En el sustrato con yucca al 30%, la mayor actividad enzimática no se presentó en el primer pico como en los otros tratamientos, a éste le siguió una disminución de la actividad enzimática y posteriormente un incremento, alcanzando su mayor actividad a los 28 días de la fermentación. El sustrato con mayor proporción de yucca fue en el que se presentó la mayor actividad xilanasa (17636 UE · L^-1). En otro estudio, realizado en Aspergillus niger, en el cual utilizaron, sustratos con alto contenido de materiales lignocelulósicos, tales como, cáscara de arroz y salvado de trigo, en una relación del 50%, se reportaron niveles altos de producción de enzima xilanasa ^[6].

Figura 7 Cinética de actividad xilanasa utilizando paja de trigo y yucca como soporte (media ± desviación estándar representada por barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05. 

Los sustratos compuestos por paja de trigo en combinación con maguey (Figura 8) tuvieron comportamientos distintos en función de su proporción. En el sustrato compuesto por maguey en un 30% se observaron dos picos de magnitud similar, el primero presentado a los 14 días (14911 UE · L^-1) y el segundo a los 28 (15159 UE · L^-1) seguido de una disminución de la actividad enzimática hacia el final de la fermentación. Se ha reportado que la actividad xilanasa puede ser inhibida durante los primeros días de la cinética de fermentación debido a la presencia de algunos azúcares como maltosa o sacarosa ^[32]. En el sustrato con un contenido de 40% de maguey, se observó un comportamiento en forma de parábola, mostrándose un incremento de la actividad enzimática desde el inicio de la fermentación, la mayor actividad xilanasa se presentó a los 21 días (15812 UE · L^-1), mostrándose una disminución hacia el final del periodo de fermentación. En el sustrato compuesto por maguey en un 50% se observó un crecimiento exponencial a partir del inicio de la fermentación, logrando un pico máximo de actividad enzimática a los 14 días (15817 UE · L^-1), posteriormente la actividad xilanasa disminuyó hacia los 28 días y se volvió a detectar un incremento hacia el final de la fermentación. Se ha reportado un contenido de lignina del 15 al 19% en el maguey ^[38], lo cual puede influír directamente sobre la producción de enzima xilanasa en las mezclas que lo contienen.

Figura 8 Cinética de actividad xilanasa utilizando paja de trigo y maguey como soporte (media ± desviación estándar representada por barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05. 

En los sustratos compuestos por paja de trigo y olote (Figura 9) la actividad xilanasa fue menor que en los sustratos que contenían maguey o yucca. Los rendimientos de obtención de actividad xilanasa varían ampliamente dependiendo de la naturaleza bioquímica, fisiológica y nutricional de los sustratos empleados para la fermentación ^[40]. El comportamiento de la cinética de fermentación fue similar en los tres tratamientos que contenían olote en diferentes proporciones. Se presentó un crecimiento exponencial a partir del inicio de la fermentación hasta los 7 días en el sustrato con olote al 40%. En un estudio realizado en Aspergillus niger, donde se evalúo la producción de la enzima xilanasa, utilizando residuos agroindustriales, se obtuvieron rendimientos de producción hasta los 10 días de la cinética de fermentación ^[6]. En otro estudio, donde se utilizó una cepa de Aspergillus ficum, se obtuvó una producción máxima de xilanasa al cuarto día, utilizando bagazo y salvado de trigo, como soporte ^[41]. En los otros dos tratamientos la actividad xilanasa aumentó hasta los 14 días, alcanzando la mayor actividad enzimática al final de ese periodo y posteriormente decreciendo y aumentando nuevamente. El sustrato con menor cantidad de olote presentó una mayor actividad xilanasa (7296 UE · L^-1) que aquellos con mayor proporción de éste.

Figura 9 Cinética de actividad xilanasa utilizando paja de trigo y olote como sustrato (media ± desviación estándar representada por barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05). 

4.3 Comparación de actividad enzimática máxima de los diferentes sustratos en fermentación en estado sólido

En la Figura 10 se puede observar que la mayor actividad amilasa y xilanasa fueron obtenidas en sustratos compuestos por paja de trigo y yucca en un 50% a los 7 y 14 días, respectivamente, del desarrollo del hongo P. ostreatus. La mayor actividad celulasa fue alcanzada en el sustrato con un contenido de maguey del 50%. El olote presentó los menores rendimientos enzimáticos. No se presentó diferencia estadística significativa (p ≥ 0.05) en la producción enzimática en los tres sustratos utilizados, sin embargo, se obtuvo un mayor rendimiento de producción enzimática en los sustratos que contenían yucca y maguey.

Figura 10 Comparación del máximo rendimiento de actividad enzimática en los distintos sustratos (media ± desviación estándar representada por las barras de error; las medias dentro de la cinética del mismo tratamiento que no comparten una letra son significativamente diferentes a p ≤ 0.05). 

El comportamiento de la producción enzimática varía en cada sustrato, debido, a la composición química de éstos ^[42]. La lignocelulosa es el componente principal de la biomasa vegetal y es el más abundante de los recursos renovables. Se compone de tres tipos de polímeros: celulosa, hemicelulosa y lignina. La celulosa y la hemicelulosa son macromoléculas construidas a partir de diferentes azúcares. La lignina es un heteropolímero amorfo, insoluble en agua y ópticamente inactivo, se forma a partir de subunidades de fenilpropano interconectadas mediante enlaces no hidrolizables carbono-carbono y carbono-oxígeno-carbono. La composición y las proporciones de estos tres compuestos varían entre cada sustrato ^[43]. Por su parte, el almidón es la principal fuente energética de reserva en la mayoría de los vegetales y se puede encontrar en forma de amilosa o amilopectina, la yucca es una fuente importante de almidón ^[44]. En la Tabla 2 se muestra la proporción de cada uno de estos polisacáridos presentes en los distintos materiales utilizados como soporte en el presente estudio.

Se ha reportado que, P. ostreatus tiene la capacidad de producir enzimas hidrólíticas (como la amilasa, celulasa y xilanasa) que degradan polisacáridos y ligninolíticas (como la lacasa o las oxidasas y peroxidasas de fenol). Durante el crecimiento y el desarrollo P. ostreatus se presenta una producción de enzimas que degradan los componentes insolubles y gran cantidad de material lignocelulósico en compuestos solubles de bajo peso molecular que el hongo aprovecha para su nutrición ^[45].

La yucca fue el material utilizado con mayor contenido de almidón, es por esto que el pico máximo de actividad amilasa se presentó al inicio de la fermentación en los sustratos que la contenían, a comparación de los sustratos que contenían maguey, los cuales presentaron la mayor actividad amilasa a los 28 días, y los que contenían olote a los 14 y 35 días de fermentación. Los microorganismos suelen utilizar durante los primeros días de cultivo los polisacáridos mas simples como los azúcares reductores y el almidón, mientras se encuentren disponibles en el sustrato, posteriormente comienzan a degradar moléculas mas complejas como la celulosa, la hemicelulosa y la lignina conviertiéndolas a moléculas simples que puedan utilizar para su nutrición ^[34], ^[40], ^[46].

El maguey es el sustrato que tiene mayor contenido de celulosa, y también en el que se presentó una mayor actividad celulasa, teniendo dos grandes picos de actividad enzimática durante el periodo de fermentación. En la yucca también se mostró una actividad amilasa importante, estadísticamente similar a la del maguey, en ambos sustratos la mayor actividad se dio con la mayor proporción de yucca o maguey (50%) en relación a la paja de trigo, lo cual denota que dichos materiales promueven una mayor producción de celulasas que la paja de trigo.

A pesar de que el olote de maíz posee una gran cantidad de hemicelulosa, la actividad xilanasa fue menor que en los otros sustratos, esto puede ser debido a su alto contenido de lignina que dificulta el acceso a las hemicelulosas, por lo que es necesario que el hongo utilice primeramente su complejo enzimático ligninolítico para poder acceder a este sustrato ^[47].

Hay diferentes factores que deben ser considerados para cultivar y producir comercialmente el hongo P. ostreatus, por ejemplo, el rendimiento de producción de cuerpos fructíferos en relación al sustrato utilizado y la producción enzimática. En un estudio previó se reportó una eficiencia biológica de hasta 69.4% en el cultivo de P. ostreatus sobre bagazo de yucca combinado con paja de trigo ^[48] y de hasta un 141.29% al ser cultivado en paja de trigo con maguey ^[47].