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Introducción
Las enfermedades postcosecha causadas por especies del género Colletotrichum, conocidas comúnmente como antracnosis, son uno de los problemas durante la comercialización de cultivos frutícolas, debido a la podredumbre de los frutos, la cual impide su consumo posterior (Zakaria 2021). En México, las especies de Colletotrichum están ampliamente distribuidas en diferentes estados del país afectando cultivos frutícolas de importancia económica (Fuentes-Aragón et al. 2020, Tovar-Pedraza et al. 2020). Entre estos cultivos, la papaya, del cual México es el tercer productor a nivel mundial, enfrenta como principal limitante la antracnosis (Marquez-Zequera et al. 2018). En Oaxaca, principal estado productor de papaya en México, se ha reportado una incidencia postcosecha de antracnosis en frutos del 45 a 60%, ocasionado por C. chrysophilum, C. siamense y C. brevisporum (Pacheco-Esteva et al. 2022a, Pacheco-Esteva et al. 2022b, Pacheco-Esteva et al. 2023). En otros países, como Etiopía, la antracnosis en frutos de papaya causada por C. gloeosporioides presentan una incidencia de entre 21 a 33% en huertos, mientras que en la etapa postcosecha se incrementa de 47 a 60% (Getnet et al. 2024). El uso de fungicidas sintéticos, solos o en combinación (moléculas con diferente modo de acción), son la principal estrategia del manejo integrado de la antracnosis en papaya (Chan-Cupul et al. 2024). Sin embargo, la aparición de cepas de Colletotrichum resistentes y la necesidad de incrementar las dosis para lograr una mayor eficacia representan importantes limitaciones asociadas al uso de estos fungicidas (Schnabel et al. 2021, Chan-Cupul et al. 2024).
El uso de microorganismos y/o de sus metabolitos secundarios bioactivos es una estrategia importante para mitigar los problemas asociados al empleo de fungicidas sintéticos en el manejo integrado de la antracnosis (Hernández-Montiel et al. 2017). Entre estos microorganismos, las actinobacterias, en particular el género Streptomyces, son consideradas agentes potenciales de control biológico de hongos fitopatógenos, además de ser una fuente valiosa de nuevos metabolitos con diferentes actividades biológicas, incluida la antifúngica (Donald et al. 2022, LeBlanc 2022). Debido a estas características, se ha documentado también su aplicación en el control de enfermedades postcosecha. Recientemente, Ma et al. (2025) reportaron que los metabolitos bioactivos de S. albidoflavus SC-3 redujeron la severidad de la podredumbre blanda en frutos de kiwi causado por Botryosphaeria dothidea. De igual manera, Peng et al. (2025) indicaron que la inoculación de Streptomyces sp. N2 en frutos de naranja redujo la incidencia y el diámetro de lesión causado por la coinoculación de Penicillium digitatum y P. italicum, agentes causales de la enfermedad de los mohos verde y azul, respectivamente.
En el caso específico del control biológico de la antracnosis mediante Streptomyces, Evangelista-Martínez et al. (2020) reportaron la actividad antifúngica in vitro de un amplio espectro de Streptomyces sp. CACIS-1.5CA contra hongos fitopatógenos causantes de enfermedades postcosecha, incluido Colletotrichum spp. En experimentos postcosecha, Xiong et al. (2024) demostraron que la inoculación de Streptomyces sp. HNBCa1 en frutos de mango disminuyó la severidad de la antracnosis causado por C. gloeosporioides HNBY27. De forma similar, Renuka et al. (2023) observaron que la inoculación de S. tuirus AR26 o la aplicación de sus metabolitos en frutos de chile redujo la podredumbre ocasionada por C. scovillei. En otro estudio, la inoculación del cultivo liquido de Streptomyces spp. en frutos de chile disminuyó hasta un 85% el tamaño de lesión ocasionado por C. gloeosporioides MPU99 (Liotti et al. 2019).
Los estudios antes mencionados evidencian el potencial de los aislados de Streptomyces y/o sus metabolitos secundarios para el control de enfermedades postcosecha. En un estudio previo, el equipo de CIATEJ reportó que Streptomyces spp. aislados de suelo rizosférico de árboles de aguacate presentaron una notable actividad antimicrobiana contra la bacteria fitopatógena Xanthomonas sp. BV801 (Trinidad-Cruz et al. 2024); sin embargo, su potencial como agentes de control biológico contra hongos fitopatógenos como C. gloeosporioides aún se desconoce. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antifúngica in vitro de aislados actinobacterianos contra C. gloeosporioides e identificar aquellos con mayor actividad mediante secuenciación del gen ARNr 16S.
Materiales y métodos
Material biológico
Los aislados actinobacterianos usados en este estudio pertenecen a la colección de actinobacterias del Laboratorio de Fitopatología del CIATEJ, los cuales fueron previamente aislados de suelo rizosférico de árboles de aguacate cv. Hass por Trinidad-Cruz et al. (2024). Los aislados actinobacterianos, criopreservados a −80 °C, se reactivaron en placas (60×15 mm) de agar-extracto de levadura y malta (ISP2 = International Streptomyces Project medio 2: 4 g L−1 de extracto de levadura, 10 g L−1 de extracto de malta, 4 g L−1 de dextrosa y 20 g L−1 de agar, pH 7.3) o agar avena (ISP3 = ISP medio 3: 20 g L−1 de hojuelas de avena, 1 mL L−1 de solución de sales traza y 18 g L−1 de agar, pH 7.2) (Shirling y Gottlieb 1966) (Tabla 1). Las placas de agar se incubaron a 28 °C.
Tabla 1 Aislados actinobacterianos de suelo rizosférico de árboles de aguacate cv. Hass seleccionados para determinar su actividad antifúngica
| Serie | Número de aislados | Código | Medio de cultivo |
|---|---|---|---|
| BVEZ | 76 | BVEZ 01-23 | ISP2 |
| BVEZ 24-76 | ISP3 | ||
| BVEZMW | 122 | BVEZMW 01-61 | ISP2 |
| BVEZMW 62-122 | ISP3 |
La cepa de C. gloeosporioides se cultivó en placas de agar papa dextrosa (PDA, 90×15 mm) a 28 °C por 12 días. La cepa de C. gloeosporioides, previamente aislado de un fruto de papaya con síntomas de antracnosis, fue provista por el Dr. Zahaed Evangelista Martínez investigador de la Subsede Sureste del CIATEJ, la cual fue descrita en Evangelista-Martínez et al. (2020).
Ensayo de actividad antifúngica
La actividad antifúngica de los aislados actinobacterianos se determinó por el método del disco de agar (Shomura et al. 1979) con ligeras modificaciones según lo descrito por Trinidad-Cruz et al. (2021). Los aislados actinobacterianos se cultivaron en agar ISP2 o ISP3 a 28 °C por 7 días. Después de la incubación, los cultivos actinobacterianos se cortaron en discos de agar de 7.5 mm de diámetro usando puntas de micropipeta esterilizadas (100 o 1000 µL). Los discos de agar de cada aislado actinobacteriano estuvieron cubiertos sobre su superficie con micelio aéreo y de sustrato o micelio de sustrato. Los discos de agar se colocaron sobre placas de PDA (90×15 mm) a 1 cm de distancia del borde (cuatro aislados por placa). Luego, un disco de agar de C. gloeosporioides, tomado de la periferia del cultivo, se colocó en el centro de las placas de PDA. Placas de PDA sólo con C. gloeosporioides se usaron como testigo. Las placas de PDA se incubaron a 28 °C por 12 días. La actividad antifúngica se determinó midiendo el radio del halo de inhibición desde el centro del disco de agar hacia el disco de agar de C. gloeosporioides. Los datos se expresaron como el diámetro del halo de inhibición obtenido de la multiplicación del radio por 2. Los experimentos se llevaron a cabo usando un diseño experimental completamente al azar con tres repeticiones por aislado y testigo para cada serie de aislados (BVEZ y BVEZMW).
Identificación molecular: extracción de ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación
Los aislados actinobacterianos BVEZ 31, BVEZ 40, BVEZMW 16, BVEZMW 36 y BVEZMW 51 se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 125 mL con 20 mL de caldo ISP2. Los matraces se inocularon con tres discos de agar (7.5 mm de diámetro) y se colocaron en un incubador orbital a 250 rpm a 28 °C por 3 días. La biomasa micelial de los cultivos actinobacterianos se recuperó por centrifugación a 1 3000 rpm por 5 min, luego se congeló con nitrógeno líquido y se liofilizó por 24 h. La biomasa micelial se pulverizó a 25 Hz por 5 min usando un molino mezclador (MM 400, Retsch®, Haan, Germany). La extracción e integridad del ADN genómico se realizó según lo descrito por Trinidad-Cruz et al. (2024). El ADN genómico se extrajo usando el kit Dynabeads® DNA DIRECT™ Universal (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA) como recomienda el fabricante para bacteria y se almacenó a −20 °C hasta su uso.
La amplificación del gen ARNr 16S de los aislados actinobacterianos se realizó por la técnica de la PCR usando los oligonucleótidos fD1 (5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) y rD1 (5′-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3′) (Weisburg et al. 1991). La mezcla de reacción y las condiciones de la PCR, la verificación de la amplificación y la purificación de los fragmentos amplificados se realizaron según lo descrito por Trinidad-Cruz et al. (2024). El producto Platinum® Taq DNA High Fidelity (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) se usó para la PCR. El producto Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA) se usó para la purificación de los fragmentos de ADN. Los fragmentos amplificados se secuenciaron por la técnica de secuenciación de Sanger usando los oligonucleótidos 1100R (5′-GGGTTGCGCTCGTTG-3′), rD1 y fD1 en Macrogen Inc. (Seúl, República de Corea). El programa SnapGene® (versión 4.3.7, GSL Biotech, Chicago, IL, USA) se empleó para obtener la secuencia consenso del gen ARNr 16S de cada aislado actinobacteriano.
Afiliación filogenética de los aislados actinobacterianos
La secuencia consenso del gen ARNr 16S de los aislados BVEZ 31, BVEZ 40, BVEZMW 16, BVEZMW 36 y BVEZMW 51 se compararon con secuencias del material tipo disponibles en la base de datos del GenBank usando el algoritmo megablast del programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) disponible en el sitio web NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Los valores de similitud de secuencias del gen ARNr 16S se calcularon usando la herramienta de alineamiento de secuencias de nucleótidos por pares en línea en EzBioCloud. Para los análisis filogenéticos, se eligieron las secuencias de las cepas tipo que mostraron valores de similitud del gen ARNr 16S mayores al 99%. La secuencia de Allostreptomyces psammosilenae YIM DR4008T (NR_156059.1) y Allostreptomyces indicus YIM 75704T (NR_178391.1) se usaron como grupo externo.
Las filogenias se infirieron mediante el servidor web GGDC usando los parámetros predeterminados en el proceso de filogenómica DSMZ adaptado a genes individuales (Meier-Kolthoff et al. 2014, Meier-Kolthoff et al. 2021). El alineamiento múltiple de secuencias se realizó con MUSCLE (Edgar 2004). Los árboles de máxima verosimilitud y máxima parsimonia se infirieron a partir de la alineación con RAxML (Stamatakis 2014) y TNT (Goloboff et al. 2008), respectivamente. El árbol filogenético se editó usando la herramienta en línea iTOL (Interactive Tree of Life, versión 7) (Letunic y Bork 2024).
Análisis estadístico
Los aislados actinobacterianos sin actividad antifúngica no se consideraron en el análisis estadístico. Previo al análisis de la varianza (ANOVA), se evaluó la homocedasticidad y la distribución normal de los residuos de los datos mediante las pruebas de Bartlett y Shapiro-Wilk, respectivamente. Los datos del diámetro del halo de inhibición de C. gloeosporioides para cada serie de aislados (BVEZ o BVEZMW) se analizaron con un ANOVA de una vía y las medias se compararon con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05). Todos los procedimientos estadísticos se llevaron a cabo usando el programa StatGraphics Centurion XVI (versión 16.2.04, Statgraphics Technologies, Inc., The Plains, VA, USA).
Resultados y discusión
Aislados actinobacterianos con actividad antifúngica
A partir de 76 aislados actinobacterianos de la serie BVEZ y 122 aislados actinobacterianos de la serie BVEZMW, se seleccionaron aquellos con actividad antifúngica contra C. gloeosporioides. Entre estos, el 28% de los aislados de la serie BVEZ exhibieron actividad antifúngica contra C. gloeosporioides con halos de inhibición de 12.85 mm a 43.44 mm de diámetro (Figura 1), mientras que el resto de los aislados (55) no mostraron actividad. Entre los aislados con actividad, el aislado actinobacteriano BVEZ 40 exhibió una inhibición del crecimiento micelial significativa contra C. gloeosporioides, seguido por el aislado BVEZ 31 (Figura 1). Para la serie BVEZMW, el 21% de los aislados inhibieron el crecimiento micelial de C. gloeosporioides con halos de inhibición de 12.08 mm a 43.28 mm de diámetro (Figura 2), mientras que los otros 96 aislados no mostraron actividad. El aislado actinobacteriano BVEZMW 16 mostró una actividad antifúngica significativa contra C. gloeosporioides, seguido por los aislados BVEZMW 51 y BVEZMW 36.
Figura 1 Actividad antifúngica de los aislados actinobacterianos de la serie BVEZ contra C. gloeosporioides en PDA. Los datos del diámetro del halo de inhibición son el promedio de tres repeticiones biológicas ± desviación estándar. Letras distintas sobre las barras indican diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05).
Figura 2 Actividad antifúngica de los aislados actinobacterianos de la serie BVEZMW contra C. gloeosporioides en PDA. Los datos del diámetro del halo de inhibición son el promedio de tres repeticiones biológicas ± desviación estándar. Letras distintas sobre las barras indican diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (p ≤ 0.05).
Durante la búsqueda de agentes de control biológico y/o de sus metabolitos bioactivos uno de los métodos principales es la evaluación de su actividad contra el fitopatógeno de interés, para descartar aquellos que no muestren actividad. Similarmente, Mendoza-Herrera et al. (2020) reportaron que el 22% de los aislados actinobacterianos (25 de 112) exhibieron actividad antifúngica contra Colletotrichum sp., además, la identificación molecular indicó que los aislados con mayor actividad pertenecieron al género Streptomyces. Renuka et al. (2023) indicaron que los aislados actinobacterianos que mostraron las mayores zonas de inhibición contra C. scovillei (23 a 32 mm de diámetro) y C. truncatum (21 a 28 mm de diámetro) también pertenecieron al género Streptomyces.
Identificación molecular y análisis filogenético de los aislados actinobacterianos
Los aislados actinobacterianos se identificaron dentro del género Streptomyces con base en el análisis comparativo de las secuencias parciales del gen ARNr 16S usando el programa BLAST. Streptomyces sp. BVEZ 40 (1424 pb) y Streptomyces sp. BVEZMW 16 (1231 pb) exhibieron la mayor similitud del gen ARNr 16S con S. antimycoticus NBRC 12839T (100%) y S. yatensis NBRC 101000T (100%), respectivamente. Streptomyces sp. BVEZ 31 (1259 pb), Streptomyces sp. BVEZMW 36 (1233) y Streptomyces sp. BVEZMW 51 (1256) mostraron las mayores similitudes de secuencia con S. antimycoticus NBRC 12839T del 99.84%. Las secuencias parciales del gen ARNr 16S de los Streptomyces spp. (BVEZ 31, BVEZ 40, BVEZMW 16, BVEZMW 36 y BVEZMW 51) se depositaron en la base de datos del GenBank con los números de accesión de PQ790587 a PQ790591, respectivamente.
Los datos de las secuencias de nueve cepas tipo del género Streptomyces que mostraron una alta similitud del gen ARNr 16S (> 99%) a las cepas de Streptomyces spp. de este estudio, se usaron para reconstruir los árboles filogenéticos. En el árbol filogenético de máxima verosimilitud (Figura 3), Streptomyces sp. BVEZMW 16 compartió un clado con S. yatensis NBRC 101000T y S. niphimycinicus 4503T. Similarmente, Streptomyces sp. BVEZ 40 se agrupó en un clado con S. antimycoticus NBRC 12839T, S. geldanamycininus NRRL 3602T y S. melanosporofaciens NBRC 13061T como sus parientes más cercanos. Caso contrario, Streptomyces sp. BVEZ 31, Streptomyces sp. BVEZMW 36 y Streptomyces sp. BVEZMW 51 formaron un clado con S. asiaticus subsp. ignotus DSM 41524T, S. rhizosphaericus NBRC 100778T, S. asiaticus NBRC 100774T, S. indonesiensis A4R2T y S. cangkringensis NBRC 100775T como sus parientes más cercanos (Figura 3).
Figura 3 Árbol de máxima verosimilitud inferido según el modelo GTR+GAMMA y enraizado mediante enraizamiento de grupos externos. Las ramas se escalan en términos de la cantidad esperada de sustituciones por sitio. Los números a lado de las ramas son valores de soporte: se muestran los valores mayores al 60% del bootstrap para máxima verosimilitud (izquierda) y máxima parsimonia (derecha).
Los Streptomyces spp. de este estudio exhibieron una alta similitud de secuencia del gen ARNr 16S (99.84 a 100%) a cepas tipo del género Streptomyces y en el árbol de máxima verosimilitud se observó las relaciones filogenéticas con sus parientes más cercanos. Los resultados anteriores demuestran que el gen ARNr 16S es confiable para identificar aislados a nivel de género. Sin embargo, asignar los Streptomyces spp. a nivel de especie usando un solo marcador molecular (gen ARNr 16S) no es adecuado para especies de este género (Kiepas et al. 2024). A pesar de lo anterior, se ha reportado previamente la actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos de sus parientes más cercanos. Koch y Löffler (2009) y Saintpierre et al. (2003) reportaron la actividad antimicrobiana de S. antimycoticus FZB53 y S. yatensis SFOCin 76T (= NBRC 101000T) contra Fusarium culmorum y F. oxysporum, respectivamente. S. niphimycinicus 4503T, aislado de sedimentos de manglares, produce un compuesto conocido como niphimycin C (Huang et al. 2023). Al respecto, Kim et al. (2013) y Chen et al. (2022) reportaron la actividad antifúngica de amplio espectro de niphimycin C contra hongos fitopatógenos entre los cuales se encuentran especies del género Colletotrichum. Además, Chung et al. (2021) y Nouioui et al. (2024) indicaron que varias de las cepas tipo de Streptomyces, estrechamente relacionadas a los Streptomyces spp. de este estudio, muestran una gran abundancia de grupos de genes biosintéticos implicados en la producción de metabolitos secundarios entre los cuales se encuentra antibióticos.
Los resultados obtenidos de la confrontación de los aislados actinobacterianos contra C. gloeosporioides permitió seleccionar los aislados con actividad antifúngica de la serie BVEZ (21 de 76) y BVEZMW (26 de 122) de aquellos que no mostraron actividad en PDA. Entre los aislados actinobacterianos con actividad antifúngica, los aislados BVEZ 31, BVEZ 40, BVEZMW 16, BVEZMW 36 y BVEZMW 51 exhibieron actividad antifúngica sobresaliente con respecto a otros aislados de su misma serie, esta actividad podría deberse a la producción de metabolitos secundarios. La identificación molecular de los aislados confirmó que pertenecen al género Streptomyces.
