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Introducción
Uno de los grandes problemas de salud pública en el mundo es la resistencia bacteriana ante los antibióticos, relacionados principalmente con el uso incorrecto y excesivo de antibióticos, lo que ha fortalecido el incremento de patologías de alta duración causado por bacterias (Brüssow 2024). Una alternativa consiste es la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos, principalmente aquellos que son sintetizados por las plantas, como son alcaloides, fenoles, terpenos entre otros, comúnmente conocidos como metabolitos bioactivos (Alsheikh et al. 2020, Keita et al. 2022).
Ante este panorama, las especies del género Piper L (Piperaceae) resultan ser candidatas en la búsqueda de principios activos antibacterianos gracias a su alto contenido de compuestos fenólicos, terpénicos y alcaloides (Mgbeahuruike et al. 2017). Con menos del 10% de las 2 000 especies descritas, se han reportados más 700 compuestos, convirtiéndose en una fuente importante para explorar posibles moléculas bioactivas (Salehi et al. 2019, Carmona-Hernández et al. 2023), que pueden aumentar su concentración por efecto de elicitores tanto bióticos como abióticos, los cuales pueden causar estrés en las plantas induciendo una respuesta de defensa y la producción de metabolitos bioactivos (Caicedo-López et al. 2021, Zeier 2021).
El quitosano se considera un elicitor biótico dada su naturaleza de biopolímero, debido a que es un derivado de la quitina que se caracteriza por su alta biodegradabilidad, bajo costo de aplicación, nula toxicidad y alta eficiencia en la producción de moléculas asociadas al sistema de protección y defensa de las plantas (Lárez et al. 2019, Gallegos-Morales et al. 2022). Fisiológicamente las especies de Piper cuentan con un mecanismo de resistencia sistémica adquirida (SAR por sus siglas en inglés), el cual se activa con el reconocimiento de la quitina o sus polímeros a través de receptores específicos tipo quinasas durante el ataque de hongos fitopatógenos, junto con los segundos mensajeros como lo son las MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos), ROS (especies reactivas de oxígeno) y ácido salicílico (SA) (López-Moya et al. 2019, Kattupalli et al. 2021, Trindade et al. 2021, Fan et al. 2022). La sobreexpresión de SA, es la responsable de regular la síntesis de metabolitos secundarios y principalmente fenoles y flavonoides (López-Moya et al. 2019, Zeier 2021), considerados responsables contra la actividad hongos y bacterias, por su capacidad de disrumpir la membrana y pared celular, así como detener las síntesis de ácido desoxirribonucleico y de proteínas (Gorniak et al. 2018, Aboody y Mickymaray 2020, Shamsudin et al. 2022, Sharma et al. 2023).
Se ha reportado que la aplicación directa de quitosano en plantas de Piper auritum Kunth propicia el aumento en el contenido de fenoles y flavonoides (Fernández 2021), así como de terpenos, pero disminuye los alcaloides, además de incrementar significativamente la actividad biológica. Por tal motivo se evaluó el efecto del quitosano en la producción de metabolitos secundarios de extractos foliares de Piper psilorhachis C.DC. (Piperaceae) y su efecto sobre la actividad antibacteriana en cepas de bacterias patógenas.
Materiales y métodos
Selección de poblaciones y aplicación del quitosano
Se seleccionaron tres poblaciones silvestres de P. psilorhachis de las cuales se tomaron 24 individuos por población en la localidad de Tuzamapan, Veracruz (Tabla 1). Se eligieron 10 individuos al azar por población y cada uno de ellos separados por al menos tres metros de distancia, a estos se les denominó Grupo Q, a los cuales se les aplicó un tratamiento a base de quitosano (polímero de bajo peso molecular, marca VEPINSA: con concentración del 27% de quitosano, 80% de desacetilación, 10% de humedad, 1.8% de ceniza y 1% de viscosidad) disuelto en agua estéril a un pH de 5.5 y Tween 80 al 0.01% a una concentración de 1 mg/mL (Fernández et al. 2021).
Tabla 1 Ubicación y condiciones abióticas de las poblaciones de Piper psilorhachis.
| Población | Coordenada | Tipo de vegetación | Temperatura media anual (° C) | Clima | Tipo de suelo | Altura (msnm) | Evapotranspiración (mm) | Humedad del suelo en meses |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 19.40561 -96.85747 | Selva baja caducifolia | 22 | Semicálido húmedo a subhúmedo | Luvisol | 843 | 900 | 9 |
| 2 | 19.405501 -96.85610 | Selva baja caducifolia | 22 | Semicálido húmedo a subhúmedo | Luvisol | 821 | 900 | 9 |
| 3 | 19.40511 -96.85716 | Selva baja caducifolia | 22 | Semicálido húmedo a subhúmedo | Luvisol | 844 | 900 | 9 |
Datos obtenidos del mapa interactivo del Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI, 2022)
Para el Grupo T (Testigo) fueron seleccionadas 10 individuos al azar por población y cada uno de ellos separados por al menos tres metros de distancia, los cuales fueron asperjados con solución Tween 80 al 0.01% en agua estéril con pH de 5.5. Ambos tratamientos se aplicaron una vez por semana durante un mes.
Colecta y extracción
Al término del ensayo se colectaron aproximadamente 5 kg de hojas de los individuos tratados y no tratados, en total se obtuvieron 6 muestras de P. psilorhachis correspondientes a cada población. Estas fueron secadas a 45 ± 5 °C y posteriormente se trituraron hasta lograr un polvo ligeramente fino. Los extractos etanólicos se obtuvieron por reflujo continuo en soxhlet durante 10 h, la proporción utilizada de material vegetal y de solvente fue 1:10 y se concentraron a presión reducida (Carmona-Hernández et al. 2014, Fernández et al. 2021).
Cuantificación de fenoles, flavonoides, terpenos y alcaloides totales
Los fenoles totales se cuantificaron por el método de Folin-Ciocalteu, usando de referencia una curva patrón de ácido tánico a 760 nm. Los resultados se expresaron en microgramos equivalente de ácido tánico por mg de extracto (µg EAT/mg) (Blainski et al. 2013, Fernández et al. 2021). Los flavonoides totales se estimaron por el método de reducción de aluminio, teniendo como referencia una curva patrón de quercetina a una longitud de onda de 420 nm. Los resultados se expresaron como microgramos equivalentes de quercetina por mg de extracto (µg EQ/mg) (Blainski et al. 2013, Fernández et al. 2021). Los alcaloides totales se cuantificaron por el método verde de bromocresol a una absorción de 470 nm y los resultados se expresaron en microgramos equivalente de cafeína (µg EC/mg) por mg de extracto, para este caso se utilizó una curva patrón de cafeína (Tiwari et al. 2016, Fernández et al. 2021). Los terpenos totales se obtuvieron siguiendo la metodología de Ghorai et al. (2012) por el método de reducción de isoprenos y los resultados se expresaron como mg equivalente de mentol por 10 mg de extracto (mg EM/ 10 mg); estas concentraciones se estimaron con base a una curva patrón de mentol a una absorbancia de 538 nm.
Cuantificación de ácido salicílico
El contenido de ácido salicílico (SA) en las poblaciones se determinó por el método de reducción férrica (Rahman et al. 2016). A una solución de 1 mg mL-1 de extracto etanólico se le añadió 50 µL de solución de cloruro férrico al 1% y 950 µL de agua, el complejo formado se midió a 450 nm. Se utilizó como referencia una curva patrón de ácido salicílico, los resultados se expresaron como microgramos equivalentes de ácido salicílico por mg de extracto (µg EAS mg-1). Para todos los casos se realizaron cinco repeticiones.
Análisis por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrómetro de Masas con Impacto Electrónico (GC-MS)
El análisis de GC-MS se realizó usando un cromatógrafo de gases Perkin-Elmer 580, asociado a detector de masas Perkin Elmer 560s. La separación de los compuestos se realizó en una columna Aligent J&W-1MSUI (60 m x 250 µm x 0.25 µm), el gas acarreador fue helio a flujo constante de 1 mL/min. La temperatura de inyección fue de 270 °C. La programación de la corrida fue la siguiente: inicio 50 °C por cinco minutos, una rampa de temperatura con aumento de 8°C min-1 hasta 100 °C por dos minutos. Después, una segunda rampa consistió en el aumento de 15°C min-1 hasta 280 °C durante cuatro minutos, manteniendo esas condiciones por 4 minutos. Finalmente se aplicó una rampa con aumento de 20°C min-1 hasta 310 °C manteniéndose esta temperatura durante 10 min. La temperatura de la línea de transferencia se ajustó a 230 °C. Los espectros de masas se obtuvieron a 70 eV de energía. Las mediciones se realizaron en modo SCAN con el de m/z (masa cargas) ajustado a 40-500. La temperatura de la fuente de iones y del cuadrupolo fue de 190 °C, con 2.9 escaneos por segundo.
Los datos obtenidos por el GC-MS fueron analizados por el software TurboMass (Perkin Elmer, Inc.). Para la anotación tentativamente de los compuestos se utilizó el software AMDIS y la base de datos NIST MS Search verison 2.0 (National Institute Standard and Technology).
Actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana de los extractos de ambos tratamientos se evaluó con las cepas de Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Enterococcus faecalis ATCC (29212) y Pseudomonas fluorescens (ATCC 15635). Las cepas utilizadas para el ensayo se encontraban a una concentración 0.5x108 en la escala de McFarland (Roman et al. 2023). Para la prueba de sensibilidad se inocularon cajas Petri con agar Mueller-Hinton y se colocaron sensidiscos con concentraciones de 2, 3, 4, 5 y 6 mg ml-1, más un control positivo (rifaximina 0.2 mg por disco) y el vehículo (etanol) como control negativo. Se realizaron 3 réplicas para cada cepa bacteriana, así como por población y tratamiento. Las cajas fueron incubadas a 28 °C durante 24 h, transcurrido el tiempo se realizó la medida de los halos de inhibición (Balfe et al. 2023).
El porcentaje de inhibición se calculó con la fórmula propuesta por Corzo (2012):
La concentración mínima inhibitoria fue interpretada como la concentración mínima del antimicrobiano, contenida en el tubo de la serie que inhibió el crecimiento visible de la bacteria, misma que se sometió a espectrofotometría a 575 nm (Wong et al. 2015).
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza no paramétrico (Kruskall Wallis) y una prueba de post hoc de Dunn, para los datos obtenidos en las concentraciones de metabolitos. Mientras que los porcentajes de inhibición bacteriana se analizaron mediante Anova y una prueba de Tukey en el programa Paleontological Statistics (PAST.4) (Hammer y Harper 2001, Little y Hills 2008).
Resultados
Contendido total de fenoles, flavonoides, terpenos y alcaloides totales
El análisis de resultados mostró diferencias significativas en la producción de metabolitos secundarios entre los extractos de las poblaciones de P. psilorhachis con y sin aplicación de quitosano. La población Q uno incrementó su concentración de fenoles en 116.39 μg EAT mg-1 respecto a su testigo con 45.87 μg EAT mg-1, la población Q tres fue la que presentó menor concentración de fenoles (76.02 μg EAT mg-1), sin embargo, los individuos tratados aumentaron la concentración de estos compuestos respecto al testigo. Los flavonoides se vieron favorecidos en las poblaciones uno y dos con 74.17 y 59.63 μg EQ mg-1, respectivamente; por el contrario, la población tres presentó menor concentración. Para el caso particular de terpenos, se observó que en las tres poblaciones aumentó su concentración respecto a los testigos, siendo la población tres la que presentó una concentración estimada de 2.93 mg EM 10 mg-1 (Tabla 2).
Tabla 2 Concentración de metabolitos secundarios y ácido salicílico en extractos etanólicos de Piper psilorhachis con/sin quitosano.
| Metabolito | Tratamiento | Población 1 | σ |
Población 2 | σ |
Población 3 | σ |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fenoles | Q | 116.39a | 2.51 | 112.41a | 2.74 | 76.02a | 0.92 |
| T | 45.87b | 2.12 | 67.63b | 0.96 | 58.92b | 1.19 | |
| Flavonoides | Q | 74.17a | 4.56 | 59.53a | 1.34 | 38.03a | 1.41 |
| T | 57.74b | 0.39 | 37.33b | 0.39 | 34.90b | 2.23 | |
| Alcaloides | Q | 462a | 6.04 | 123a | 8.45 | 541a | 11.02 |
| T | 528b | 17.4 | 121a | 8.71 | 73b | 6.40 | |
| Terpenos | Q | 2.22a | 0.15 | 2.74a | 0.16 | 2.93a | 0.11 |
| T | 1.10b | 0.15 | 1.29b | 0.10 | 0.85b | 0.11 | |
| Ácido Salicílico | Q | 176.76a | 2.27 | 176.5a | 3.11 | 136.44a | 2.53 |
| T | 191.92b | 6.28 | 128.13b | 0.98 | 261.92b | 3.17 |
Q: con quitosano, T: sin quitosano. Fenoles: μg EAT/mg, Flavonoides: μg EQ/mg, Alcaloides: μg EC/mg, Terpenos mg EM/10 mg, Ácido salicílico: μg ESA/mg. Las diferentes letras en los superíndices indican diferencias significativas (KW post hoc Dunn p < 0.05).
La cantidad de alcaloides presentes en los extractos de las poblaciones uno (462 μg EC mg-1) y dos (123 μg EC mg-1), tratadas con quitosano disminuyeron su contenido respecto a sus testigos (528 y 121 μg EC mg-1); por el contrario, la población tres aumentó su concentración (451 μg EC mg-1) comparada con el resto de las muestras y su testigo. Este mismo fenómeno ocurrió con el ácido salicílico que solo incrementó su concentración en la población dos, en el resto hubo disminución tras la aplicación del quitosano.
Análisis GC-MS
En la caracterización química tentativa de los extractos etanólicos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), se registraron compuestos de naturaleza terpénica, lactonas y amidas. En el caso particular de la población Q uno, se encontraron cinco compuestos, entre los que destacan 2-propenamida 3-glicoxilamida, oxima y O-benziloxima pentanal, ambas consideradas amidas, grupo característico del género Piper. Por el contrario, en la población T uno se obtuvo siete compuestos, de los cuales sobresalen el (-)-espatulenol y benzenehexamina. Para la población T dos, se identificó δ-valerolactona, α-cadinol, particularmente en el grupo experimental se encontró β-eudesmeno y un precursor de la ruta de fenoles el ácido malónico, 2-(2,3-dihidrobenzo[b]furano). Finalmente, la población Q tres se determinaron tentativamente metilglioxal, talifolin y 2-piperrazina; por el contrario, en la población no tratada se presentaron α-gurjuneno, 6-piperidinediona, 4-etil-4-meti entre otros terpenos (Tabla 3).
Tabla 3 Compuestos químicos identificados tentativamente por GC-MS en los extractos de P. psilorhachis
| Población | Tratamiento | Nombre | TR | PM | Fórmula | CAS |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Q | 2-Propenamida, 3-glicoxilamido-, oxima | 20.4073 | 157 | C5H7N3O3 | 3552-37-2 |
| 3,4,4-Trimetil-isozazol-5(4H)-ona | 22.3145 | 127 | C6H9NO2 | 15731-98-3 | ||
| O-benziloxima pentanal | 22.8597 | 191 | C12H17NO | 72399-21-4 | ||
| α-Cadinol | 23.2274 | 222 | C15H26O | 481-34-5 | ||
| Terpinoleno | 23.2529 | 136 | C10H16 | 586-62-9 | ||
| T | Pinocarvona | 19.721 | 150 | C10H14O | 30460-92-5 | |
| Propanamida, N-metil- | 23.341 | 87 | C4H9NO | 1187-58-2 | ||
| (-)-Espatulenol | 22.6522 | 220 | C15H24O | 77171-55-2 | ||
| Benzenehexanamina | 23.6431 | 177 | C12H19N | 17734-20-2 | ||
| Elaol | 25.1312 | 278 | C16H22O4 | 84-74-2 | ||
| 4-metil-2,4-bis(4'-trimetilsililoxifenilo)penteno-1 | 25.4588 | 412 | C24H36O2Si2 | |||
| 4-Piridona | 26.8263 | 95 | C5H5NO | 626-64-2 | ||
| 2 | Q | 1,2-benzenodiol, O-acetoxiacetilo-O'-(4-butilbencilo)- | 21.3521 | 370 | C21H22O6 | |
| β-Eudesmeno | 21.8938 | 204 | C15H24 | 17066-67-0 | ||
| 2,3-Dioxabiciclo[2.2.1]heptano | 22.1529 | 100 | C5H8O2 | 279-35-6 | ||
| Ácido malónico, 2-(2,3-dihidrobenzo[b]furano) | 25.9544 | 266 | C13H14O6 | |||
| 4-Metil-2,4-bis(4'-trimetilsililoxifenilo) penteno | 27.5450 | 412 | C24H36O2Si2 | |||
| T | δ-Valerolactona | 22.5571 | 100 | C5H8O2 | 542-28-9 | |
| α-Cadinol | 23.2199 | 222 | C15H26O | 481-34-5 | ||
| 4-metil-2,4-bis(4'-trimetilsililoxifenilo)penteno-1 | 25.2287 | 412 | C24H36O2Si2 | |||
| Metilglioxal | 25.5938 | 72 | C3H4O2 | 78-98-8 | ||
| Trimetil[4-(1,1,3,3,-tetrametilbutil) fenoxi]silano | 27.2349 | 278 | C17H30OSi | 78721-87-6 | ||
| 3 | Q | cis-3-Hexenilactato | 22.2330 | 172 | C9H16O3 | 61931-81-5 |
| 2-Piperazinona | 22.5921 | 100 | C4H8N2O | 5625-67-2 | ||
| Metilglioxal | 25.6988 | 72 | C3H4O2 | 78-98-8 | ||
| 4-Metil-2,4-bis(4'-trimetilsililoxifenilo)penteno-1 | 26.1445 | 412 | C24H36O2Si2 | |||
| Quinuclidona | 27.0299 | 125 | C7H11NO | 3731-38-2 | ||
| Talifolin | 27.3044 | 207 | C11H13NO3 | 21796-15-6 | ||
| T | α-Gurjuneno | 22.0184 | 204 | C15H24 | 489-40-7 | |
| 2,6-Piperidinediona, 4-etil-4-metil- | 22.0784 | 155 | C8H13NO2 | 64-65-3 | ||
| 2-Propanono, 1,1,3,3-tetrabutoxi- | 22.1224 | 346 | C19H38O5 | 113358-61-5 | ||
| α-Cubebeno | 22.2474 | 204 | C15H24 | 17699-14-8 | ||
| Espatulenol | 22.6556 | 220 | C15H24O | 6750-060-3 | ||
| γ-Eudesmol | 23.0848 | 222 | C15H26O | 1209-71-8 | ||
| Cyclopentanona, 2-acetil-3,3-dimetil-2 | 23.1233 | 167 | C8H13NOSi | |||
| Ácido Malónico 2-(2,3-dihidrobenzoil [b] furan 5)-2 | 25.9744 | 266 | C13H14O6 | |||
| Fitol | 26.2645 | 296 | C20H40O | 150-86-7 |
Similitud: con el espectro reportado con máxima similitud en la base de datos NIST.
Actividad antibacteriana
La actividad biológica de las plantas incrementó tras la aplicación del elicitor, los extractos etanólicos de P. psilorhachis mostraron mayor porcentaje de inhibición sobre los extractos de las poblaciones T (Tabla 4). En particular los extractos de P. psilorhachis a 6 mg mL-1 fueron efectivos contra P. fluorescens, S. aureus, E. faecalis y E. coli; contrario a los extractos de las poblaciones T. Estadísticamente se encontraron diferencias significativas (KW p < 0.05) entre las concentraciones de los extractos provenientes de poblaciones tratadas y no tratadas.
Tabla 4 Porcentajes de inhibición de los extractos de Piper psilorhachis tratados con y sin quitosano
| Sin tratamiento de quitosano | Con tratamiento de quitosano | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Cepa | Concentración | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Población | |||||||||||
| P. fluorescens | 1 | 18.52ª | 13.08ª | 22.52a | 13.04ª | 19.14ª | 21.27ª | 19.99ª | 20.58ª | 23.14ª | 20.26a |
| 2 | 22.97ª | 27.34ª | 28.80ª | 18.54ª | 20.27ª | 22.06ª | 33.46ª | 37.93ª | 24.60ª | 23.36ª | |
| 3 | 25.44ª | 12.70ª | 24.63ª | 15.67ª | 7.39ª | 35.12ª | 36.05ª | 17.24ª | 15.63ª | 25.05ª | |
| S. aureus | 1 | 32.69b | 54.95b | 39.62ª | 45.05ª | 33.23ª | 25.77ª | 47.28ª | 41.64ª | 65.39ª | 57.29ª |
| 2 | 29.19c | 40.87ª | 50.42ª | 53.40ª | 44.69ª | 47.88ª | 46.92ª | 63.69ª | 59.66ª | 57.54ª | |
| 3 | 26.02ª | 25.66ª | 32.57ª | 20.59ª | 27.85ª | 36.52ª | 29.68ª | 39.76ª | 26.78ª | 22.89ª | |
| E. faecalis | 1 | 11.32ª | 17.13c | 19.13b | 8.88b | 22.11b | 29.48b | 32.06ª | 31.43ª | 30.36ª | 35.63ª |
| 2 | 14.86ª | 15.98d | 14.06c | 11.49c | 19.64c | 28.51c | 36.27ª | 37.27ª | 28.19ª | 48.11ª | |
| 3 | 19.60ª | 23.15ª | 17.58ª | 34.14d | 15.7d | 28.49ª | 51.22b | 39.26ª | 55.37ª | 29.38ª | |
| E. coli | 1 | 37.95ª | 23.72ª | 24.29d | 25.05e | 26.76e | 28.32d | 20.89a | 41.77ª | 37.97ª | 34.18a |
| 2 | 20.33ª | 19.62ª | 18.91ª | 25.30f | 36.17f | 47.52ª | 26.71c | 28.13a | 50.12ª | 69.2ª | |
| 3 | 16.67d | 5.49e | 17.62e | 17.30a | 19.30g | 53.89e | 25.05d | 34.54b | 66.03b | 28.84b | |
Concentración en: mg/mL de extracto crudo. Inhibición en: %. Letras diferentes indican diferencias significativas (KW post hoc Dunn p < 0.05).
La concentración mínima inhibitoria fue de 0.5 mg mL-1 para P. fluorescens en las tres poblaciones con el tratamiento de quitosano. En el testigo la CMI fue de 2 mg mL-1 en la población uno, un mg mL-1 para la población dos y 0.5 mg mL-1 en la población tres. En S. aureus la CMI fue para ambos tratamientos de 2 mg mL-1. Mientras para E. coli fue de 0.5 mg mL-1 en los extractos de P. psilorhachis tratados, y de 2 mg mL-1 en los extractos testigos. Para finalizar, E. faecalis se inhibió con 0.5 mg mL-1 para tratamiento con quitosano, respeto a los testigos.
Discusión
El tratamiento con quitosano mostró efectos significativos sobre los metabolitos secundarios de las poblaciones de P. psilorhachis, siendo los flavonoides, fenoles y terpenos los grupos que aumentaron su concentración en las tres poblaciones después de la aplicación del elicitor, mientras que los alcaloides y el ácido salicílico aumentaron en al menos una población. Lo anterior concuerda con lo reportado para P. auritum donde el quitosano indujo mayor síntesis de terpenos, flavonoides, fenoles, pero difiere en el incremento de ácido salicílico, pues en ese estudio aumentó la concentración de esta molécula, mientras que los alcaloides tuvieron una disminución tras la aplicación del tratamiento con elicitor (Fernández et al. 2021). Los resultados también concuerdan con lo reportado para Mentha piperita L (Lamiaceae) y Coffea arabica L., Sp. Pl. (Rubiaceae)donde el quitosano incrementó la producción de fenoles y flavonoides (Salimgandomi y Shabrangi 2016, López-Velázquez et al. 2023), en Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) incrementaron los terpenos (Kim et al. 2005) y para los alcaloides en dos poblaciones hubo modificación en la concentración como se ha reportado en Catharanthus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae) (Pliankong et al. 2018).
Cabe mencionar que el ácido salicílico tiene la capacidad de inducir y modular muchos genes en las plantas asociados a la respuesta sistémica adquirida, por lo que puede estimular la síntesis de diferentes metabolitos bioactivos (Klessing et al. 2018) como los flavonoides y fenoles que pueden ser responsables de la actividad microbiana, sin descartar a los alcaloides y terpenos. Se ha asociado que los compuestos fenólicos tienen la capacidad de penetrar la membrana bacteriana y provocar lisis (Rodríguez et al. 2017). También se sabe que pueden disrumpir la membrana, detener el cuórum bacteriano, así como la síntesis de DNA y proteínas, por la inhibición de helicasas y topoisomerasas (Gorniak 2019). Los alcaloides, en especial las amidas de Piper suelen causar mutaciones en secuencias diana que conducen a la apoptosis celular si no son reparadas (Bezarra et al. 2009). Por lo anterior, se puede asociar que los extractos de las poblaciones tratadas con quitosano se vieron favorecidas con el aumentó de fenoles. Particularmente la población tres tratada con quitosano presentó los porcentajes más altos de inhibición en las cuatro bacterias evaluadas, resaltando que en el extracto se identificó tentativamente talifolin un flavonoide que pudiera ser responsable de dicha actividad (Alois et al. 2022) y que se encuentra presente en aristoloquias, parientes filogenéticos de las piperáceas. Por último, en este extracto se determinó metilglioxal una molécula que señala estrés celular, que se presenta en plantas cuando son alteradas por factores bióticos y abióticos, por lo cual se puede sugerir que el quitosano indujo alguna respuesta en las plantas (Li 2016). Aunado a esto, se tienen reportes de que esta molécula es capaz de inducir la muerte celular en bacterias (Rabie et al., 2016). A pesar de que en la población dos del testigo presentó este compuesto, quizá la interacción sinergética con otros compuestos bioactivos inhibió su capacidad antibacteriana.
Cabe mencionar que, en los perfiles fitoquímicos, los compuestos identificados tentativamente difirieron en las mismas poblaciones, así como entre los tratamientos, esto pude deberse a la expresión y supresión por parte del quitosano (elicitor) en la fisiología de la planta. Se ha documentado que algunas especies de Piper sp., modifican la expresión de metabolitos dependiendo del estrés al cual han sido sometidos, un caso particular es el de P. nigrum, en el cual se ha documentado que bajo el estrés de micorrizas arbusculares y Phytophthora capsici se reduce la producción de aceites esenciales y otros metabolitos, esto se debe a variaciones metabólicas específicas espacio-temporales de los tejidos que se encuentra bajo una infección (Kattupalli et al. 2021, Fan et al. 2022, Sarathambal et al. 2023) e inclusive en el desarrollo vegetal se regula la expresión de ciertos metabolitos, que pueden verse afectados por la presencia de un elicitor, como se reporta en Peperomia pellucida Kunth (Alves et al. 2022). Lo anterior pudiera explicar por qué la presencia de fitoquímicos varió entre las poblaciones, dado que estas son silvestres y presentaban diferentes estadios fisiológicos e interacciones medioambientales no controladas.
Conclusiones
La aplicación de quitosano mostró efecto positivo en la producción de metabolitos secundarios como fenoles, flavonoides y terpenos, en todas las poblaciones de P. psilorhachis tratadas y en al menos en una población se incrementó el ácido salicílico. El análisis por GC MS se identificaron tentativamente metabolitos bioactivos que podrían estar asociados a la actividad antibacteriana que mostraron, especialmente en el extracto de la población tres tratada con quitosano contra S. aureus, E. faecalis, P. fluorescens y E. coli. Finalmente se sugiere que el quitosano podría estimular la producción de metabolitos bioactivos con potencial antibacteriano, que posiblemente pueda atribuirse a la inducción de una respuesta sistémica.
