Obtención de material vegetal

Se obtuvieron, del mercado de la localidad, muestras de cada una de las especies, para C. chinense, se utilizaron frutos secos los cuales inicialmente fueron desinfectados con hipoclorito de sodio al 1% durante 3 minutos y secados con toallas de papel estériles. Posteriormente, se enjuagaron con agua destilada estéril y volvieron a secarse. Las muestras se pesaron inicialmente con humedad y se colocaron en una estufa a 50 °C. Se repitió el pesaje y el proceso de secado hasta que las muestras llegaron a peso constante. Se calculó el porcentaje de humedad (%H) utilizando la fórmula propuesta por ^{Nielsen (2003)}:

De D. caryophyllus se utilizaron partes de la planta sin secar, como tallos, hojas y pétalos, mientras que de S. bicolor se utilizaron semillas. Las muestras de cada especie vegetal fueron trituradas de forma individual en un procesador de alimentos tradicional hasta obtener un polvo uniforme.

Extracción de hidroalcohólicos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor

Los polvos obtenidos de C. chinense y S. bicolor se tamizaron, y se obtuvo un tamaño de partícula de 63 μm utilizando un tamiz Ro-tap. Los extractos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor se prepararon siguiendo el método de ^{Castillo et al. (2010)} con algunas modificaciones. Se empleó una disolución de etanol al 85% en agua destilada. Inicialmente se pesaron 42 g de polvo de cada muestra y se mezclaron con 750 mL de solvente en matraces de 500 mL. Estos se llevaron a agitación en una parrilla durante 72 horas a temperatura ambiente. Luego se filtraron los extractos con papel filtro Whatman No. 1. El solvente se separó mediante rotavapor a 150 rpm a 70 °C, y los extractos se secaron en una estufa a 40 °C durante 5 días hasta obtener un polvo homogéneo.

Extracción acuosa de D. caryophyllus. Para la obtención del extracto acuoso se realizó la metodología reportada por ^{Lo et al. (2020)}. Se cortaron flores, tallos y hojas de D. caryophyllus (40 g) y se trituraron en trozos pequeños con un procesador tradicional de alimentos. La muestra se colocó dentro de un matraz bola que se conectó con el destilador por arrastre de vapor para luego añadir 200 mL de agua destilada para generar vapor. Por último, la muestra se calentó a 200 °C y se dejó la extracción durante 6 horas.

Determinación de la actividad antioxidante

Se siguió el método de 2,2'-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) de acuerdo con ^{Martínez-Ávila et al. (2012)}. La formación del radical ABTS se llevó a cabo mezclando una solución de persulfato de potasio a una concentración de 2.45 mM con ABTS a 7 mM en una relación 1:2 (v/v). La mezcla se mantuvo protegida de la luz a temperatura ambiente durante 16 h. Para luego diluir en alcohol etílico hasta alcanzar una absorbancia de 0.70 ± 0.05 a 734 nm. Después de obtener este valor, se tomó 1 mL de la solución ajustada de ABTS y se le añadieron 10 µL de la muestra (extractos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor), y se midió la absorbancia a 734 nm. Se empleó agua destilada como control. Los resultados se calcularon y reportaron en mEq trolox por gramo.

Contenido de fenoles totales

Se utilizó el método descrito ^{Zenil-Lugo et al. (2014)} con modificaciones. Se tomaron 20 μL de cada extracto, blanco y curva de calibración (98, 195, 391, 781, 1563, 3125, mg/L, r² = 0.998), y se mezclaron con 120 μL de NA₂CO₃, 30 μL de Folin-Ciocalteu y 400 μL de agua. La reacción se llevó a cabo a 50 °C por 5 min, el estándar utilizado fue ácido gálico. La absorbancia fue tomada a 700 nm en un espectrofotómetro (Spectronic Genesys® UV10).

RP-HPLC-ESI-MS analítica

Se llevó a cabo el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa utilizando un sistema Varian HPLC. Este sistema consta de un muestreador automático Varian ProStar 410, una bomba ternaria Varian ProStar 230I y un detector PDA Varian ProStar 330. Además, se empleó un espectrómetro de masas con trampa de iones en la cromatografía líquida, conocido como Varian 500-MS IT Mass Spectrometer, el cual estaba equipado con una fuente de iones por electropulverización. Las muestras de los extractos se inyectaron en una columna Denali C18 (150 mm × 2.1 mm, 3 µm, Grace, EE. UU.), manteniendo la temperatura del horno a 30 °C. Los eluyentes utilizados fueron ácido fórmico (0.2%, v/v; disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B), aplicando un gradiente de elución específico. Inicialmente se utilizó un 3% de B, seguido de un aumento lineal a lo largo del tiempo. El caudal se mantuvo constante a 0.2 mL/min, y controló la elución a longitudes de onda de 245, 280, 320 y 550 nm. El efluente se inyectó de forma directa en la fuente del espectrómetro de masas sin divisiones. Todos los experimentos de espectrometría de masas se realizaron en modo negativo [M-H]-1, utilizando nitrógeno como gas nebulizador y helio como gas amortiguador. Los parámetros de la fuente de iones fueron un voltaje de pulverización de 5.0 kV, un voltaje capilar de 90.0 V y temperatura de 350 °C. Los datos generados se procesaron utilizando el software MS Workstation (V 6.9). Inicialmente, se realizaron análisis de escaneo completo en el rango m/z 50-2 000, como describe ^{Cerda-Cejudo et al. (2022)}.

GC-MS/MS analítica

La metodología utilizada para los análisis cromatográficos mediante el sistema de cromatografía de gases acoplado a masas se llevó a cabo en un cromatógrafo marca Agilent Technologies modelo 7890B equipado con un detector selectivo de masas 5977B. Las muestras fueron introducidas utilizando helio como gas portador, con una rampa de temperatura que se incrementó de 80 °C a 300 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min, manteniéndose a 300 °C durante 15 min. Se empleó el modo Split con una temperatura de división de 280 °C y una duración de 40 min. El análisis de espectrometría de masas se efectuó en un rango de masas que abarcó desde 32 hasta 750 unidades de masa atómica, manteniendo la temperatura de la línea de transferencia a 280 °C y utilizando un volumen de inyección de 2 µL.

Bioensayo de germinación

Una porción del extracto pulverizado se diluyó en un volumen de etanol para preparar tres concentraciones de ensayo: 1 250, 2 500, 5 000 ppm de cada extracto y luego se añadió una concentración de agar bacteriológico estéril en cajas Petri. Una vez solidificado el medio de cultivo, se colocaron semillas de Avena sativa y semillas de Phaseolus vulgaris como semillas indicadoras, se realizaron tres replicas por cada extracto y concentración, sobre el medio sólido. También se mantuvieron cajas Petri de control en cada experimento, utilizando sólo medio de cultivo. Posteriormente las cajas Petri se incubaron en oscuridad a temperatura ambiente. La germinación se midió cada intervalo de 0.5 días durante 4 días (el momento en que no germinaron más semillas), las semillas fueron consideradas como germinadas cuando las radículas emergieron al romper la cubierta como describe ^{Tucuch-Pérez et al. (2023)}.

El porcentaje de germinación (PG) se calculó a partir de los mismos datos obtenidos de la germinación utilizando la ecuación siguiente.

El índice PG indicó el porcentaje de germinación total de un lote de semillas después de cierto período de tiempo en el que la germinación aumentó constante.

Bioensayo de crecimiento

Las cajas Petri y los extractos se prepararon como se describió anteriormente. Se colocaron diez semillas de A. sativa y P. vulgaris germinadas en la oscuridad a 25 °C durante siete días, en placas de Petri. Se midieron las longitudes (mm) de los brotes y las raíces de cada plántula después de la incubación en condiciones de oscuridad durante siete días a 25 °C. También se mantuvieron placas de Petri de control como bioensayo de germinación.

Análisis estadístico

Los experimentos de bioensayo se realizaron según un diseño completamente al azar con tres repeticiones por cada extracto y concentración. Los datos generados en cada experimento se analizaron utilizando el paquete estadístico SAS, versión 9.01 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). Las medias de los tratamientos se compararon mediante la prueba de Tukey con un nivel de probabilidad del 5% (^{Steel y Torrie 1981}). La concentración requerida para una inhibición del crecimiento del 50%, es decir, CL50 de las especies de prueba en los ensayos, se calculó a partir de la ecuación de regresión de las curvas de respuesta de concentración mediante el programa Minitab (Minitab Statistical Software).

Determinación de la capacidad antioxidante

En la Tabla 1 se presentan los resultados de la actividad antioxidante y el contenido de fenoles totales determinado por el método de Folin-Ciocalteu destacando el extracto de C. chinense con mayor concentración de antioxidantes (6.70 ± 0.03), sin embargo, los extractos con mayor cantidad de fenoles fueron D. caryophyllus acuoso y S. bicolor (1.06 ± 0.03, 1.07 ± 0.05). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias en los valores de ABTS y fenoles entre los diferentes extractos. Para comparar las medias entre los extractos, se utilizó el test de Tukey con un nivel de significancia de α = 0.05.

Identificación de compuestos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor mediante CG-MS

Los compuestos hallados en los extractos (Tabla 2), con mayor número de compuestos identificados fueron C. chinense y D. caryophyllus.

C. chinense presentó varios compuestos identificados, con picos significativos en las posiciones 3 a 7. Entre los compuestos identificados, se incluyen el 2,2,4-trimetil-1,3-pentanodiol diisobutirato (pico 3, 13.7 min), un éster isobutílico de hept-4-ilo del ácido ftálico (pico 4, 16.8 min), y homosalato (pico 5, 17.0 min). También se identificaron α-N-Normetadol (pico 6, 17.03 min) y ftalato de dibutilo (pico 7, 17.06 min). D. caryophyllus mostró una distribución similar de compuestos en los picos 4 a 8. El salicilato de 2-etilhexilo (pico 4, 16.1 min) y versalide (pico 5, 16.8 min) se repiten en los diferentes extractos, al igual que el α-N-Normetadol (pico 7, 17.3 min) y ftalato de dibutilo (pico 8, 17.6 min).

El extracto acuoso de D. caryophyllus compartió la mayoría de los picos con el extracto no acuoso de D. caryophyllus, indicando que no hay una gran diferencia en la composición química entre estos dos tipos de extractos. Los mismos compuestos como el salicilato de 2-etilhexilo, versalide, α-N-Normetadol y ftalato de dibutilo se identificaron en las mismas posiciones de pico, lo que indica una relativa estabilidad en la composición de los extractos acuosos y no acuosos.

S. bicolor presentó un perfil ligeramente diferente, con salicilato de 2-etilhexilo (pico 3, 16.1 min) y un 1,2-ácido bencenodicarboxílico (pico 4, 16.21 min) como los compuestos más relevantes identificados en su cromatograma.

Identificación de compuestos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor mediante HPLC-M

Los cromatogramas en la Tabla 3, revelan que los extractos con el mayor número de compuestos detectados pertenecen a C. chinense, destacando la presencia significativa de escopoletina, una cumarina biosintetizada por la ruta de los fenilpropanoides.

C. chinense destaca por la presencia de escopoletina (hidroxicumarinas) y kaempferol 3-O-glucosil-ramnosil-glucósido (flavonoles), D. caryophyllus sobresale por una amplia gama de compuestos, entre los cuales se destacan las antocianinas como cianidina 3-O-glucósido y pelargonidina 3-O-glucósido, así como flavonoles y ácidos fenólicos, D. caryophyllus acuoso comparte algunos de los compuestos de su variante no acuosa, con énfasis en el ácido cafeico, S. bicolor resalta por el cafeoil glucosa, un compuesto antioxidante relevante.

Efectos sobre la germinación

El efecto de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor sobre la germinación se evaluó mediante el porcentaje de germinación sobre semillas de P. vulgarius y A. sativa. Los resultados revelaron una disminución en el crecimiento, con diferencias significativas entre los tratamientos, como se muestra en las Tablas 4 y 5 se observó que la menor germinación se encontró en las dosis de 5 000 ppm en todos los extractos evaluados para P. vulgarius (Figura 1), mientras que, para A. sativa, el extracto con mejores resultados fue el de C. chinense, en comparación con el control no tratado (Figura 2).

Figura 1 Crecimiento de P. vulgaris frente a los distintos tratamientos utilizados. 

Figura 2 Crecimiento de A. sativa frente a los distintos tratamientos utilizados. 

Se observó que las concentraciones inhibitorias para reducir la germinación en un 50% para P. vulgarius fueron de 1 109.23 ppm, según se muestra en la Tabla 6. En cuanto a la germinación de A. sativa, se puede observar que la concentración letal 50 fue de 2 502.08 ppm (Tabla 7).

Determinación de la capacidad antioxidante

Los resultados obtenidos de la actividad antioxidante en los extractos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor revelan diferencias significativas en la composición de los compuestos activos que podrían estar relacionados con su capacidad para neutralizar los radicales libres. En el caso de C. chinense, su capacidad antioxidante puede ser atribuida a compuestos como los capsaicinoides, carotenoides y ácidos orgánicos, los cuales se han relacionado con la neutralización de radicales libres en varias especies vegetales (^{Kothari et al. 2010}, ^{Sora et al. 2015}). Los capsaicinoides, por ejemplo, tienen una estructura molecular que incluye un grupo fenólico que puede donar electrones para neutralizar los radicales (^{Reyes-Escogido et al. 2011}). Este tipo de actividad antioxidante podría ser de gran relevancia en la protección celular frente al estrés oxidativo (^{Balbi y Devoto 2008}). Es importante destacar que, en concentraciones altas, algunos antioxidantes pueden tener efectos negativos sobre el crecimiento de las plantas, lo que resalta la necesidad de estudios adicionales para comprender mejor las dosis óptimas para su uso (^{Ratnayaka et al. 2003}).

Identificación de compuestos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor mediante CG-MS

El análisis mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-MS) indentificó diversos compuestos activos en los extractos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor. En C. chinense, destacan compuestos como la escopoletina, una cumarina conocida por sus propiedades antioxidantes y herbicidas (^{Razavi 2011}), y el kaempferol 3-O-glucosil-ramnosil-glucósido, un flavonoide con potentes propiedades antioxidantes. Estos compuestos contribuyen no solo a la actividad antioxidante, sino también a la acción de inhibición de la germinación de semillas. En D. caryophyllus, la cianidina 3-O-glucósido y la pelargonidina 3-O-glucósido son antocianinas con reconocidas propiedades antioxidantes y pueden actuar como aleloquímicos, inhibiendo la germinación de semillas y el crecimiento vegetativo (^{Al-Snafi 2017}). El ftalato de dibutilo (DBP) identificado en este extracto es un disruptor endocrino, lo que indica que podría influir en las interacciones hormonales durante la germinación, afectando el desarrollo de las semillas. Para S. bicolor, destacó la presencia de cafeoil glucosa, un compuesto de la familia de los ácidos hidroxicinámicos, que también puede contribuir a las propiedades fitotóxicas observadas (^{Shajib et al. 2012}).

Identificación de compuestos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor mediante HPLC-M

El análisis mediante HPLC-M también permitió identificar compuestos relevantes en los extractos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor. en C. chinense, la escopoletina y el kaempferol 3-O-glucosil-ramnosil-glucósido fueron nuevamente identificados, reforzando su posible contribución a la actividad antioxidante y a las propiedades bioherbicidas del extracto. En D. caryophyllus, se identificaron varias antocianinas, como la cianidina 3-O-xilosil-rutinósido y la quercetina 3-O-rutinósido, los cuales están asociados con propiedades antioxidantes y fitotóxicas (^{Liu et al. 2016}). Estos compuestos, junto con las flavonas y cumarinas, podrían ejercer un efecto inhibidor sobre la germinación y el crecimiento vegetal, lo que sugiere que el extracto de D. caryophyllus tiene un gran potencial como bioherbicida (^{Ding et al. 2020}). Diversos estudios han evaluado la actividad de compuestos individuales aislados de plantas, como flavonoides, alcaloides y terpenoides. Estas diferentes clases de metabolitos secundarios varían en su relevancia en términos de actividad bioherbicida (^{Morra et al. 2018}) . En los extractos de las mismas especies, las proporciones de estos compuestos pueden diferir dependiendo del tipo de extracto y del método de extracción utilizado (^{De-Mastro et al. 2021}).

Efectos sobre la germinación

El estudio de los efectos de los extractos sobre la germinación de semillas mostró que los extractos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor presentan propiedades fitotóxicas que afectan la germinación y el crecimiento de las semillas. En particular, los compuestos identificados en C. chinense, como los capsaicinoides y salicilatos, pueden interferir con la germinación y el desarrollo de las raíces, lo que es consistente con la literatura sobre sus efectos bioherbicidas (^{Vlot et al. 2009}, ^{Loake y Grant 2007}). De manera similar, el extracto de D. caryophyllus presentó efectos inhibitorios en la germinación, posiblemente debido a la presencia de antocianinas y el ftalato de dibutilo, un disruptor endocrino que interfiere en el equilibrio hormonal necesario para la germinación (^{Waliszewski et al. 2002}).

Por último, el extracto de S. bicolor, con la presencia de cafeoil glucosa, mostró un efecto negativo sobre la germinación de las semillas, sugiriendo que sus compuestos activos tienen potencial para ser utilizados en el control de malezas. Estos hallazgos respaldan la evidencia de que las fitotoxinas derivadas de plantas, como los aleloquímicos y aceites esenciales, tienen un alto potencial para controlar malezas (^{Islam y Kato-Noguchi 2014}, ^{Dos Santos et al. 2019}, ^{De-Mastro et al. 2021}). Los aleloquímicos, metabolitos secundarios que inducen cambios perjudiciales en las enzimas y procesos metabólicos de otras plantas, pueden causar estrés y muerte gradual (^{Nazemi et al. 2018}, ^{Roberts et al. 2022}, ^{Dos-Santos et al. 2019}). Los compuestos bioactivos en los extractos de C. chinense, D. caryophyllus y S. bicolor muestran efectos antioxidantes y fitotóxicos significativos, lo que sugiere su potencial como bioherbicidas naturales. No obstante, se requieren más investigaciones para determinar las concentraciones óptimas y su seguridad en aplicaciones agrícolas.