Localización del experimento

El experimento se estableció en un invernadero tipo túnel cubierto con plástico de polietileno color blanco lechoso de 700 μm, cuya temperatura media fue 27.7 °C y humedad relativa de 43.7%, durante febrero a marzo de 2023, ubicado en la Facultad de Ciencias Agropecuarias y Ambientales de la Universidad Autónoma de Guerrero, localizada en carretera Iguala-Tuxpan km 2.5, Iguala de la Independencia, Guerrero, México, en las coordenadas geográficas 18° 20’ 38’’ Latitud N y 99° 30’ 04’’ Longitud O, a una altitud de 759 m.

Material vegetal

Se utilizaron semillas de pepino del híbrido Polion F-1 (Starseeds, Intenational, Inc®) con una tasa de germinación de 85%. Las semillas se desinfestaron mediante inmersión en NaCIO al 0.5% durante 1 min, a continuación, las semillas se lavaron con agua destilada para eliminar el NaCIO residual.

Elaboración de nanoestructuras con zinc

Los instrumentos para la elaboración de los precursores de las nanoestructuras se sometieron a esterilización mediante autoclave (AESA®) a 120 °C y 15 lb de presión durante 15 min. La elaboración de las ZnO-NE se realizó con base en la metodología descrita por ^{Martínez-Alonso et al. (2022)} y ^{Quirino-García et al. (2024)}, que consistieron en la síntesis a partir de Zn(O₂CCH₃)₂ y NaOH. Para la reacción se utilizaron dos hornos de microondas, profesional (LG®) y doméstico (casero) (Mars6®). Posteriormente, se realizó un lavado de las nanoestructuras de óxido de zinc (ZnO-NE) para eliminar las impurezas residuales. Las ZnO-NE obtenidas se nombraron de acuerdo con las síntesis realizadas; microondas profesional (MP), microondas doméstico (MD) y precipitación directa (PD).

Diseño de tratamientos

Las soluciones se prepararon con las ZnO-NE sintetizadas y la fuente (fertilizante) comercial con Zn, utilizando agua destilada como solvente, los cálculos para las cantidades se realizó considerando la concentración de Zn en las ZnO-NE provenientes de microondas profesional (51.90% de Zn²⁺), microondas doméstico (43.34% de Zn²⁺) y precipitación directa (49.76% de Zn²⁺), así como de la fuente comercial (sulfato de zinc (ZnSO₄); Cesco, Solution, Inc®; 35.5% de Zn²⁺), para el aporte de 30 mg L^-1 de Zn²⁺, respectivamente (^{Quirino-García et al. 2024}). Las suspensiones se mantuvieron en agitación ultrasónica hasta homogeneizar, después se agregó a cada frasco un imán de teflón cilíndrico y se colocaron individualmente en la parrilla por 5 min, con lo que se obtuvieron cinco soluciones foliares, consideradas como tratamientos T1 (Microondas profesional); T2 (Microondas doméstico); T3 (Precipitación directa); T4 (Sulfato de zinc: fertilizante comercial (testigo positivo: TP)); T5 (Agua: control (testigo negativo: TN)). A continuación, las semillas se colocaron en las soluciones respectivas con un tiempo de inmersión de 2 h (^{Lian et al. 2020}).

Siembra de la semilla y crecimiento de plántulas

La siembra de la semilla se realizó en contenedores de poliestireno de 200 mL de capacidad, llenados con una mezcla de turba y perlita (1:1 v/v). Se colocó una semilla en cada contenedor, a una profundidad de 2.0 cm y se cubrió con el mismo sustrato. A continuación, los contenedores con semilla se regaron con agua de grifo diariamente a las 7:30 y 18:00 h de forma manual, adicionando un volumen promedio de 80 mL en cada contenedor. Una vez que las plántulas emergieron y presentaron de una a dos hojas verdaderas (10 días después de la siembra (dds)), los riegos continuaron con la misma frecuencia, empleando la solución nutritiva universal de ^{Steiner (1984)} al 25% de su concentración original con un pH ajustado a 5.5. Cuando las plántulas presentaron dos hojas verdaderas (12 dds) se inició la aspersión foliar con las ZnO-NE de acuerdo con los tratamientos mencionados. Para ello, las soluciones se llevaron a 1 L a la misma concentración y se agregaron en atomizadores de 1 L de capacidad. A continuación, se realizó la aspersión de las soluciones en las plántulas a punto de escurrimiento, de acuerdo con el tratamiento correspondiente en intervalos de siete días a las 18:00 h durante tres semanas, tiempo en que duró el experimento.

Parámetros evaluados

A los 24 días después de inicio de tratamientos se registraron en 20 plántulas seleccionadas aleatoriamente por tratamiento, la altura (cm), con un flexómetro desde la base del tallo hasta la terminación del ápice; el diámetro del tallo (mm), con un vernier a 0.5 cm de separación entre el tallo y la raíz; el ancho y largo (cm) de hoja con flexómetro, tomando como referencia la hoja media; índice de área foliar con el software ^{ImageJ (2022)}, versión 1.53. A continuación, las plántulas con sus raíces fueron extraídas y se registró el número de raíces y la longitud de la raíz (cm) con un flexómetro; el volumen de la raíz se determinó con una probeta graduada (mL); el peso fresco de la raíz, tallo y hojas (g) con una báscula de precisión (HR-AZ/HR-A). Los órganos de las plántulas se almacenaron en bolsas de papel con perforaciones y se alojaron en una estufa de secado (NOVATECH HS60-ED®) con aire forzado a 75 °C hasta que las muestras se mantuvieron a peso constante. Enseguida se cuantificó el peso seco (g) de la raíz, tallo y hojas, con la báscula antes descrita.

Diseño experimental y análisis estadístico

Las plántulas con su respectivo tratamiento (fuentes de ZnO-NE) se distribuyeron en diseño completamente al azar con cinco tratamientos y 20 repeticiones; la unidad experimental consistió en un contendor con una plántula, con un total de 100 unidades experimentales. La información recabada se almacenó en una hoja de cálculo de Excel 2010 y se aplicó un análisis de varianza y una prueba de medias de Tukey (α = 0.05) con el programa estadístico SAS (Statistical Analysis System) versión 9.0 (^{SAS 2002}).

Crecimiento de plántulas

La altura de plántula (AP) se estimuló con la aplicación de ZnO-NE y sulfato de zinc, ambas fuentes de Zn produjeron plántulas cuya altura osciló de 20.68 y 23.13 cm (Figura 1A), destacando la aplicación de ZnO-NE provenientes de precipitación directa con respecto al testigo (sin Zn), al superar su altura en 56.91%. Con respecto al diámetro del tallo (DT), el mayor valor (4.65 mm) en plántulas se registró cuando estas se trataron con ZnO-NE provenientes de la síntesis con microondas doméstico (Figura 1B), en comparación con la fuente comercial (T4) (23.01%) y sin Zn (12.69%), al producir plántulas con tallos más delgados. Los resultados también indicaron que las nanoestructuras influyeron significativamente en el tamaño de las hojas (Figura 2A y 2B) (p ≤ 0.05). Las plántulas tratadas con ZnO-NE aumentaron el crecimiento de sus hojas, no obstante, la aspersión con Zn sintetizado mediante microondas profesional no mejoró las dimensiones de estas. Así mismo, el tratamiento con sulfato de zinc produjo plántulas con hojas de menor ancho (11.31%) y longitud (12.64%). En el mismo sentido, también en el índice de área foliar (AF) se obtuvieron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados (p ≤ 0.05), donde la respuesta de las plántulas fue superior con la aplicación de ZnO-NE obtenidas por microondas profesional (43.01%) y microondas doméstico (34.48%) con respecto al testigo sin Zn (Figura 2C), respectivamente (Tabla 1).

Figura 1 Efecto de la aspersión foliar con ZnO-NE y ZnSO₄ en la altura (A) y diámetro del tallo (B) de plántulas de pepino (Cucumis sativus) en invernadero. Valores con letra distinta entre barras dentro del mismo parámetro no son estadísticamente iguales (Tukey, α=0.05). 

Figura 2 Efecto de la aspersión foliar con ZnO-NE y ZnSO₄ en el ancho (A) y longitud (B) de la hoja y área foliar (C) en plántulas de pepino (Cucumis sativus) en invernadero. Valores con letra distinta entre columnas dentro del mismo parámetro no son estadísticamente iguales (Tukey, α=0.05). 

Para el caso de la longitud de la raíz (LR), también hubo significancia estadística por el efecto de los tratamientos aplicados (p ≤ 0.05), la aspersión foliar con ZnO-NE proveniente de los tres métodos de síntesis incrementaron la longitud de la raíz de las plántulas, en comparación con los testigos positivo (sulfato de zinc) y negativo (sin la aplicación de Zn) (Figura 3A). Con respecto al volumen de raíz (VR), el efecto por la aplicación de Zn proveniente de las diferentes fuentes también fue divergente. La aplicación de sulfato de zinc y ZnO-NE sintetizado por microondas doméstico y precipitación directa produjeron el mismo VR en las plántulas de pepino, pero, ambos tratamientos superaron el VR producido cuando las plántulas se trataron con Zn sintetizado por microondas profesional. En cambio, la aplicación de sulfato de zinc incrementó el VR en 17.71 y 23.97% con respecto a las plántulas sin suministro de Zn y con Zn sintetizado por microondas profesional (Figura 3B).

Figura 3 Efecto de la aspersión foliar con ZnO-NE y ZnSO₄ en la longitud (A) y volumen (B) de la raíz de plántulas de pepino (Cucumis sativus) crecidas en invernadero. Valores con letra distinta dentro del mismo parámetro no son estadísticamente iguales (Tukey, α = 0.05). 

Producción de biomasa fresca y seca

El peso fresco de la raíz, tallo y hojas también mostraron diferencias significativas (Tabla 2). Por un lado, la aplicación ZnO-NE elaborado por microondas doméstico aumentó el peso fresco en la raíz en 21.18 y 20.90% con respecto al control negativo (sin Zn) y microondas profesional, respectivamente (Figura 4A), mientras que las fuentes de Zn provenientes de microondas doméstico, precipitación directa y fertilizante comercial tuvieron un efecto similar en la acumulación de biomasa fresca de hoja. En cambio, el peso fresco del tallo no presentó diferencias entre los tratamientos con ZnO-NE y el sulfato de zinc (testigo positivo) (Figura 4B), no obstante, se encontró que ambos mejoraron el peso fresco del tallo con respecto al control negativo, donde la mayor diferencia (23.4%) se tuvo con la síntesis de ZnO-NE por precipitación directa con respecto al control. En contraste, el peso fresco de las hojas tuvo diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre los tratamientos con ZnO-NE, así como entre los tratamientos con ZnO-NE y los testigos, de manera que las plántulas tratadas con Zn proveniente de precipitación directa registraron el mayor peso (6.50 g/plántula) freso de hojas (Figura 4C), superando en 20.77 y 25.38% el peso fresco de hojas alcanzado en los tratamientos con sulfato de Zn (control positivo) y sin Zn (control negativo); por el contrario, la respuesta en la acumulación de biomasa fresca en las hojas de las plántulas de pepino, tratadas con ZnO-NE del microondas profesional y doméstico y el fertilizante comercial fue similar, con valores de 5.15 a 5.79 g/plántula. Sin embargo, el peso fresco de las hojas fue mayor con ZnO-NE de microondas doméstico en 16.23% que el testigo negativo (sin aplicación de Zn).

Figura 4 Producción de biomasa fresca de raíz (A), tallo (B) y hojas (C) en plántulas de pepino (Cucumis sativus) por la aplicación foliar de ZnO-NE y ZnSO₄ en invernadero. Valores con letra distinta entre columnas no son estadísticamente iguales (Tukey, α=0.05). 

De acuerdo con los resultados obtenidos para el peso seco de raíz, no hubo diferencias estadísticas entre tratamientos (Tabla 2). Sin embargo, el peso seco del tallo aumentó con las aplicaciones de las nanoestructuras de Zn, con valores en el rango de 37.0 y 41.0 g (Figura 5A); las nanoestructuras de Zn provenientes de microondas profesional y precipitación directa superaron en 51.2% el peso seco del tallo de las plántulas sin la aplicación de Zn, mientras que la aplicación de ZnO-NE de microondas doméstico y fertilizante comercial fueron superiores en 46.3 y 41.4%, respectivamente. En contraste, hubo un efecto diferente en el peso seco de las hojas (PSH); donde las plántulas tratadas con las fuentes nanoestructuradas de Zn aumentaron el peso seco de estas, destacando el ZnO-NE proveniente de precipitación directa (0.85 g) en comparación con las ZnO-NE obtenidas por microondas profesional, sulfato de zinc y sin Zn (Figura 5B), al superar sus promedios en 14.1, 18.8 y 29.4%, respectivamente. En tanto que, la aspersión con ZnO-NE de microondas doméstico también aumentó en 25.0% la acumulación de biomasa seca de las hojas con respecto al testigo negativo.

Figura 5 Producción de biomasa en peso seco del tallo (A) y hojas (B) en plántulas de pepino (Cucumis sativus) por la aplicación foliar de ZnO-NE y ZnSO₄ en invernadero. Valores con letra distinta entre columnas no son estadísticamente iguales (Tukey, α=0.05). 

Crecimiento de plántulas

La altura de la planta se relaciona con la funcionalidad del Zn en el metabolismo de la misma, este elemento activa el metabolismo de ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos al integrarse a las células y su asimilación puede ser favorecida por las diferentes fuentes de aplicación (^{Palmer y Guerinot 2009}). Adicionalmente, se menciona que la aplicación de 150 µmol L⁻¹ de nanopartículas de Se y 100 mg L⁻¹ de ZnO en semillas de Brassica napus aumentó la concentración de ácido giberélico, encargado de promover la elongación celular (^{El-Badri et al. 2021}), lo que se traduce en el alargamiento del tallo y por ende mayor altura de planta. Con respecto al diámetro del tallo se atribuye a que la fuente de Zn proveniente de la síntesis de microondas doméstico tuvo mejor uniformidad de tamaño de partícula, lo que facilitó su absorción al interior de la plántula y por ende a nivel celular, donde promovieron la producción de auxinas, encargadas de la división y elongación celular responsables del crecimiento del tallo (^{Karakeçili et al. 2019}). Lo anterior se debe a que las ZnO-NE son de mayor efectividad y su liberación lenta mejora las propiedades fisiológicas de las plantas, reflejándose en un mayor crecimiento de las mismas, incrementando el diámetro y la altura de plántula (^{Kolenčík et al. 2019}). Al respecto, se ha encontrado que la aplicación de 15 mL L⁻¹ de nanopartículas de Ag incrementaron el diámetro de los brotes en Prunus pérsica (^{Mosa et al. 2021}). También se reportó que el suministro de 50 mg L^-1 de nanopartículas de ZnO aumentó el diámetro del tallo de Oryza sativa (^{Li et al. 2021}). Sin embargo, el aporte de 50 y 100 mg L⁻¹ de nanopartículas de ZnO en Capsicum annuum no afectaron el crecimiento de esta especie (^{Magdaleno-García et al. 2023}), por lo que la respuesta será diferente en función de la especie vegetal y las nanopartículas empleadas (^{Alkhatib et al. 2021}).

En lo que refiere al tamaño de las hojas, el efecto positivo en las plantas por la aplicación de ZnO-NE con respecto al Zn comercial también se ha reportado en Coffea arabica (^{Rossi et al. 2019}). Con respecto al AF, la respuesta pudo estar influenciada por las características de las ZnO-NE que modificaron el tamaño (longitud y ancho) de la hoja y, por consiguiente, el área foliar. En un estudio similar se observó que la aplicación de nanopartículas de ZnO en una concentración de 50 mg L⁻¹ aumentaron el crecimiento de brotes y hojas en Triticum aestivum (^{Awasthi et al. 2017}). Así mismo, se reportó que el suministro de 50 mg L^-1 de nanopartículas de ZnO + Ag promovió el área foliar (30.3%) de Capsicum annuum, esta respuesta se atribuye al Zn y su influencia en la reactividad del ácido indolacético, el cual actúa como fitoestimulante hormonal (^{Méndez-Argüello et al. 2016}).

También las raíces de las plántulas tuvieron un comportamiento diferente por la aspersión de las ZnO-NE. La respuesta en la longitud de raíz se atribuye a que el Zn participa en la síntesis de ácido indolacético (AIA) encargado de la división celular, lo que aumenta el crecimiento de los diferentes órganos de la planta (Álvarez et al. 2019), entre ellos la raíz. Al respecto, algunos reportes indican que el efecto positivo de los fertilizantes nanoestructurados en la longitud de la raíz aumenta según la concentración del elemento implicado en la nanoestructura, como se ha observado con TiO₂ nanoestructurado en Arabidopsis, cuya aplicación en bajas concentraciones (100 y 250 mg L⁻¹) no influyó en la longitud de la raíz, en cambio, a concentraciones altas (500 y 1000 mg L⁻¹) la incrementaron (^{Wei et al. 2020}). Así mismo, el volumen de la raíz se modificó por los tratamientos aplicados, dicha respuesta reafirma que la composición, tamaño, forma y condiciones físico-químicas de las fuentes fertilizantes provoca diferentes efectos en el crecimiento de plántulas (^{Bandeppa et al. 2019}), efectos que incluso pueden ser desfavorables para su crecimiento. En este sentido, ^{Vargas-Martínez et al. (2023)} encontraron que la aplicación de Zn mediante nanoestructuras de ZnO (30 mg L^-1) en Solanum lycopersicum disminuyó el volumen de la raíz en esta especie.

Producción de biomasa fresca y seca

De acuerdo con los resultados de peso fresco del tallo, se encontraron resultados similares con la aplicación de 50 mg L⁻¹ de nanoestructuras de ZnO, al aumentar la biomasa fresca en Triticum aestivum (^{Awasthi et al. 2017}). Por otro lado, la respuesta del PFH se atribuye a la interacción que existe entre las hojas (dimensiones de los tricomas y superficie de las hojas) y al tamaño y estructura de la fuente de Zn (^{Kolenčík et al. 2020}); este comportamiento también se observó con la aplicación foliar de Fe como nanofertilizante, cuya adición provocó una distribución uniforme dentro de la planta y una asimilación más rápida y por consecuencia mayor peso fresco (^{Bastani et al. 2018}). Del mismo modo, se reportó que la aplicación de nanoestructuras de ZnO y SiO₂ tuvo mayor efectividad en las hojas de Solanum lycopersicum (^{Gao et al. 2021}). Esta tendencia también se observó en Dracocephalum moldavica al incrementarse la producción de biomasa con la aplicación de 160 mg L⁻¹ de ZnO-NE (^{Nekoukhou et al. 2022}); por tanto, uno de los parámetros importantes para medir la eficiencia del Zn aplicado en sus diferentes formas es la acumulación de biomasa (^{Ramírez et al. 2018}).

El incremento de los parámetros de peso seco del tallo y de hoja descritos anteriormente se atribuye al tamaño nanométrico de las ZnO-NE aplicadas, ya que tienen la característica de penetrar con mayor facilidad a través de los estomas de las hojas y llegar a otros tejidos vasculares y posteriormente ser translocados a otros órganos de la planta (^{Rossi et al. 2019}). Estudios similares reportaron que la aplicación de 10 mg L⁻¹ de nanoestructuras con ZnO produjeron mayor peso seco de raíces y hojas en Curcuma longa (^{Khattab et al. 2023}). En el mismo contexto, la aplicación de nanoestructuras de KH₂PO₄ al 50% de la concentración de fósforo (P) también mejoró la biomasa seca de los brotes de Oryza sativa (^{Miranda-Villagómez et al. 2019}), mientras que en dicha especie el aporte de nanoestructuras de Zn en concentraciones de 0.4, 1.0 y 2,0 g L⁻¹ incrementaron la materia seca (^{Alvarez et al. 2019}).