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Introducción
El piojo Haematophinus tuberculatus, es una de las principales especies de ectoparásitos que afectan a los búfalos de agua (Bubalus bubalis) (Ojeda-Robertos et al. 2022). Estos piojos pertenecen al suborden Anoplura y se caracterizan por tener piezas bucales adaptadas para succionar sangre, además son parásitos permanentes de los búfalos con un ciclo de vida simple que se completa entre 21 y 27 días (Egri 2019). Los piojos sólo pueden sobrevivir por cortos periodos de tiempo en el medio ambiente, por lo que su abundancia y presencia está íntimamente relacionada con la presencia del hospedador (Batista et al. 2018). Este género de piojo ocasiona problemas de salud en los rumiantes, entre los que se encuentran, lesiones en la piel, irritación, prurito, intranquilidad, baja de peso, disminución de ganancia de peso y producción de leche (Ojeda-Robertos et al. 2022). H. tuberculatus es un parásito hematófago por lo que su presencia está relacionada con anemia. Además, es vector de patógenos como bacterias, virus y protozoarios que son de interés en la salud animal y pública (Neglia et al. 2013, Veneziano et al. 2013). En México, recientemente, se ha notificado la presencia del piojo en hatos de búfalos criados en los estados de Veracruz y Tabasco (Hernández-Velazco et al. 2020, Ojeda-Robertos et al. 2022), y se ha sugerido como potencial vector de Anaplasma marginale, agente que afecta a los bovinos (Hernández-Velazco et al. 2020).
Por otro lado, los hongos entomopatógenos, son organismos que han sido utilizados como antagonistas naturales de biocontrol de artrópodos (Alonso-Díaz y Fernández-Salas 2021). Los hongos Metarhizium anisopliae sensu lato (s.l.) y Beauveria bassiana s.l. han sido utilizados con éxito como enemigos naturales para el control de artrópodos (Ojeda-Chi et al. 2011, Romo-Martinez 2013, Ebani y Mancianti 2021). En los trópicos húmedos el hongo filamentoso Neurospora spp. es comúnmente encontrado en estrecha asociación con humanos y animales, en lugares tales como fábricas de madera, panaderías, cultivos de maíz, caña de azúcar y arroz, así como en áreas con vegetación quemada. Asimismo, Neurospora spp. también ha sido aislado de insectos como Lucilia cuprina (Benjo et al. 2006).
Algunas especies del género Neurospora presentan actividad biológica mediante la producción de metabolitos que tienen el potencial de ser agentes biológicos anti-tumorales (contra el cancer invasivo de mama) (Jinu y Jayabaskaran 2015, Han et al. 2022), y también se ha notificado que pueden afectar el desarrollo embriogénico (Syed et al. 2008) y la oviposición de insectos (Lou et al. 2019). Debido al promisorio uso de los hongos para el control biológico de artrópodos, el presente estudio tiene como objetivo reportar la presencia e identificar taxonómica y molecularmente a los hongos aislados a partir del cuerpo de piojos H. tuberculatus obtenidos de búfalos de agua en el trópico mexicano.
Materiales y métodos
Área de estudio
El estudio se realizó en un rancho de producción bufalina localizado entre los estados de Tabasco y Chiapas, México (17° 54’ 21” LN, 93° 06’ 07” LO). El clima de la región se caracteriza por ser tropical húmedo, con lluvias en verano, precipitación pluvial anual de 2 550 mm y una temperatura media anual de 27 °C (INEGI 2019). La zona se caracteriza por ser inundable por su cercanía con el río de la Sierra y con un sistema de lagunas que colidan con la unidad productiva.
Colecta de piojos en búfalos con infestación natural
La colecta de piojos se realizó durante un brote que se presentó en un hato de búfalos de agua (B. bubalis). Se seleccionaron al azar 20 búfalas adultas infestadas naturalmente y que previamente no hubieran sido tratados con insecticidas. De los animales seleccionados se colectaron 130 piojos adultos (machos y hembras) y ninfas. El número de piojos incluidos en el estudio dependió del grado de infestación de las búfalas. Los piojos fueron depositados en placas de Petri para su conservación y traslado al laboratorio.
Identificación de presencia de micelio en los piojos
Los piojos colectados se trasladaron al laboratorio con la finalidad de detectar la presencia de crecimiento miceliar en la cutícula de los parásitos, y de corroborar la identidad de los piojos. Los piojos se mantuvieron a temperatura ambiente (25 °C) y se inspeccionaron individualmente cada 4 h durante las primeras 24 h post-colecta. La inspección individual se realizó para detectar la presencia del micelio en el cuerpo de los parásitos para lo que se utilizó un estereoscopio (20X) (Carl Zeiss modelo StemiDV4®).
Después de las 24 h de observación, se seleccionaron 30 piojos positivos a la presencia de micelio. Los piojos con crecimiento micelial abundante fueron separados y transferidos a otra caja de Petri para ser enviados al laboratorio del CENID Salud Animal e Inocuidad del INIFAP, ubicado en Jiutepec, Morelos, México.
Identificación morfológica de los piojos
Con el fin de confirmar la identificación taxónomica de acuerdo con un trabajo previamente publicado (Ojeda-Robertos et al., 2022), se seleccionaron aleatoriamente 10 piojos. Los especimenes fueron transferidos a un vial con alcohol al 70% y posteriormente fueron aclarados con hidróxido de potasio y fijados en bálsamo de Canadá. La identificación se realizó con la ayuda de un microscopio compuesto (20X), y se utilizaron las claves taxonómicas descritas por Meleney y Kim (1974).
Crecimiento del hongo en el laboratorio
Para favorecer el crecimiento de las estructuras fúngicas, los 30 especímenes con abundante crecimiento de micelio desde las primeras horas de la inspección, se colocaron de forma individual en placas de Petri (60 x 15 mm), que contenían agua-agar al 2% con el antibiótico cloranfenicol (Laboratorio Sigma®). Las placas de Petri se incubaron por siete días a temperatura ambiente (18-25°C) y fotoperiodo de 12 h luz/obscuridad (Barron 1977). Diariamente se observaron las placas de Petri bajo un microscopio estereoscópico (10X) con el fin de verificar el proceso del crecimiento del micelio.
Aislamiento e Identificación morfológica de los hongos
De las placas de Petri. con agar agua y con crecimiento de micelio, se obtuvieron muestras que se depositaron e incubaron en 15 placas de Petri con el medio agar papa dextrosa (20%). La incubación se realizó durante cinco días y posteriormente mediante la técnica de cinta pegante (Díaz et al. 1999), se obtuvieron fragmentos del hongo presionando suavemente el lado pegante sobre el micelio del hongo, después se colocó la cinta sobre porta objetos con una gota de azul de lactofenol. Para realizar la identificación morfológica, se observó el micelio teñido con la ayuda de microscopio (Leica DM500®) utilizando los aumentos de 10X, 40X y 100X.
Secuenciación del gen 28S rARN e ITS
La identificación molecular se realizó en las dos cepas aisladas anteriormente, el ADN genómico de los dos hongos se extrajo macerando 100 mg del micelio con nitrógeno líquido y posteriormente usando el kit de extracción de ADN ZR fungal/bacterial DNA Kit™. Para la identificación molecular se utilizó el gen 28S rARN que fue amplificado usando los oligonucleótidos universales eucarióticos D1 y D2 descritos por Boyandin et al. (2013)), de igual manera se amplificaron las secuencias conservadas en eucariotas ITS (Internal transcribed spacer) utilizando los oligonucleótidos ITS1 e ITS4 en las condiciones descritas por White et al. (1990)). Los productos de amplificación se purificaron del gel utilizando el kit GeneJET (Thermo Scientific®) y se secuenciaron en la unidad de secuenciación del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México (Cuernavaca, Morelos, México). Las secuencias obtenidas se depositaron en el GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con los números de accesos 28s: D1D2C1 (ON911454) y D1D2C2 (ON911455) e ITS: ITSC1 (ON911478) y ITSC2 (ON911479). Posteriormente, se realizaron alineamientos múltiples de las secuencias 28S rARN (551 nucleótidos) y para ITS (330 nucleótidos) usando la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information), las secuencias referenciadas fueron alineadas utilizando el software Clustal Omega (Sievers et al. 2011). El análisis filogenético de cada matriz de datos se realizó por separado bajo el criterio de neighbor joining con 1 000 bootstrap con el programa seaview 4.6.1 (Gouy 2010).
Resultados y dicusión
El presente estudio reporta el aislamiento de Neurospora spp. apartir de un organismo biológico como el piojo H. tuberculatus en México. El hongo Neurospora spp. es un organismo que ha sido aislado de distintos vegetales y sustratos como el suelo y maderas quemadas (Lee 2012). Aunque existe escasa información, se ha reportado su aislamiento en algunos organismos biológicos de importancia, como larvas de la mosca Lucilia cuprina (Benjo et al. 2006).
Los piojos H. tuberculatus son ectopásitos que han sido reportados como causantes de brotes en bufálos en la región (Ojeda-Robertos et al. 2022). En este estudio, además de confirmar la identidad del piojo por medio de claves taxónomicas, se reporta la presencia de micelio blanco y escaso en el cuerpo de los ectoparasitos desde el momento de la colecta; sin embargo, a las 24 h post-colecta, se observó crecimiento e invasión con mayor cobertura (Figura 1), lo que indicó la capacidad del hongo para colonizar este insecto. Del total de piojos colectados el 76.1%, tuvieron la presencia de crecimiento micelial blanco en su cuerpo (Tabla 1).
Figura 1 Piojo adulto Haematopinus tuberculatus invadido por el micelio de Neurospora spp. (40X) al momento de la colecta. La flecha roja indica zonas en el cuerpo del piojo invadidas con micelio blanco.
Tabla 1 Número y porcentaje de H. tuberculatus con crecimiento micelial de Neurospora spp. en búfalos de Tabasco, México.
| Número de animal | Total de piojos colectados | Número de piojos con crecimiento de micelio | Porcentaje de piojos con crecimiento de micelio (%) |
|---|---|---|---|
| 1 | 5 | 1 | 20.0 |
| 2 | 5 | 1 | 20.0 |
| 3 | 7 | 6 | 85.7 |
| 4 | 5 | 1 | 20.0 |
| 5 | 5 | 1 | 20.0 |
| 6 | 8 | 8 | 100 |
| 7 | 5 | 1 | 20.0 |
| 8 | 10 | 10 | 100 |
| 9 | 10 | 10 | 100 |
| 10 | 10 | 8 | 80.0 |
| 11 | 5 | 5 | 100 |
| 12 | 6 | 5 | 83.3 |
| 13 | 7 | 5 | 71.4 |
| 14 | 5 | 5 | 100 |
| 15 | 5 | 5 | 100 |
| 16 | 7 | 6 | 85.7 |
| 17 | 4 | 1 | 25.0 |
| 18 | 5 | 5 | 100 |
| 19 | 10 | 10 | 100 |
| 20 | 6 | 5 | 83.3 |
| Total | 130 | 99 | 76.1 |
El origen del micelio en el cuerpo de los piojos colectados es dificil de explicar, aunque existen algunas posibilidades, los búfalos de agua como parte de su proceso de termorregulación corporal requieren refrescarse en agua y lodo (Khongdee et al. 2011), posiblemente, en el lodo de las lagunas donde los búfalos se termoregulan, entran en contacto junto con sus ectoparásitos con otros organismos vivos como es el caso de los hongos. Aunque también, se ha reportado que, otra fuente del hongo es el suelo y zonas con áreas quemadas (Lee 2012). Sin embargo, algo importante de considerar, es que el ciclo de vida del piojo es corto, se desarrolla de 21 a 27 días y sucede en su totalidad encima del hospedador lo que podría sugerir la capacidad invasiva y el rápido crecimiento del hongo en el cuerpo de los parásitos (Batista et al. 2018).
Morfología macroscópica y microscópica de los hongos
El género Neuroespora es un grupo de hongos ascomicetos que son comunes en áreas tropicales y subtropicales y su presencia ha sido reportada en varias regiones y paises del mundo (Turner et al. 2001). En este género, se han identificado varias especies con caracteristicas morfológicas macroscópicas y microscópicas, las cuales varían dependiendo de la región y del lugar de colecta. En el crecimiento miceliar de las cepas C1 y C2 en el medio PDA, se detectó un micelio blanco, mientras que por microscopiá se pudo observar la formación de hifas septadas y la presencia de conidios (de origen asexual), por lo que de acuerdo con estas características macroscópica y microscópica son representativas del género Neurospora (Turner et al. 2001).
Identificación molecular
Las secuencias de los genes 28 rRNA y secuencias ITS se analizaron utilizando el algoritmo BLASTn en la base de datos NCBI, donde se alinearon y mostraron una alta similitud con especies del género Neurospora. Los árboles filogenéticos se construyeron utilizando fragmentos de las secuencias del gen 28s rRNA y secuencias ITS referenciadas obtenidas del NCBI. Como se observa en la Figura 2, el análisis filogenético de las secuencias ITS muestra que las cepas C1 y C2 están relacionadas con las especies N. crassa, N. hapsidophora, N. tetraspora y N. saitoi con un soporte del 99%, mientras que el análisis filogenético de las secuencias del gen 28s rRNA, muestra que las cepas C1 y C2, están relacionadas con las especies N. crassa y N. pannonica con un soporte del 93% (Figura 3 y 4). Al respecto, Perkins et al. (1976), mencionan que es un hongo común en áreas tropicales, y por lo general, se encuentra en zonas de vegetación quemada. Al parecer las ascoesporas, permanecen durante un tiempo hasta que las altas temperaturas o incluso ciertos químicos las activan (Ferreira et al. 2016). Por otra parte, Ferreira et al. (2016) mencionan que algunos hongos ascomicetos filamentosos, como Aspergillus spp., Fusarium spp., Monascus spp. y Neurospora spp., son versátiles y de distribución cosmopolita y son capaces de crecer en diferentes sustratos, sin embargo, hasta el momento, solo ha sido reportado a partir de un organismo vivo (Bejo et al 2006). Los macroconidios de Neurospora spp. se caracterizan por tener una amplia dispersión aérea, pero tienen corta duración de vida en la naturaleza (Lee 2012), lo que posiblemente explique la presencia en el suelo de las praderas y charcas donde los búfalos se refrescaron para termoregularse y ser la vía para la invasión y colonización de los piojos.
Figura 2 Caracterización macroscópica y microscópica de dos cepas de Neurospora spp. Crecimiento micelial de las cepas C1 y C2 en caja de Petri agar dextrosa (40X) (a y e). Caracteristicas microscópicas con aumento 10X (b y f), 40X (c y g) y 100X (d y h) respectivamente. La flecha roja indica la presencia de conidios.
Figura 3 Análisis filogenético de las cepas C1 (ITS1) y C2 (ITS2) según los resultados de BLAST de las secuencias ITS.
Figura 4 Análisis filogenético de las cepas 1 (D1 COM1) y 2 (D1 COM2) según los resultados de BLAST de las secuencias del gen 28S rARN.
Algunas especies pertenecientes al género Neurospora spp. han sido descritas en la literatura por su actividad saprobia y su relación con la degradación de plantas (Piontelli y Diaz 2004) lo que explica su actividad menos especializada cuando se compara con otras especies de hongos con actividad entomopatógena (St. Leger y Wang et al. 2000). En el presente estudio no fue posible determinar el efecto letal (mortalidad) o subletal (desarrollo embriogénico y oviposición) del hongo sobre la especie de piojo. De acuerdo a lo mencionado anteriormente, estos son parásitos obligados y mueren a las pocas horas después de ser colectados (Egri 2019), por lo que no podemos atribuir la muerte a la presencia e invasión del hongo, sino a la falta del hospedero.
En un estudio realizado por St Leger et al. (1997) se comparó la habilidad de hongos saprófitos, entre ellos N. crassa y A. nidulans, con otros hongos oportunistas, patógenos de plantas y entomopatógenos para utilizar los componentes de las paredes celulares de las plantas y cutícula de insectos en diferentes medios nutritivos y se reportó que N. crassa a pesar de ser un saprófito, secreta proteasas capaces de degradar mucina (Leger et al. 1997), por lo que podría tener una actividad entomopatógena, sin embargo, esto debe ser estudiado. Estudios previos han demostrado que la mucina es esencial para el desarrollo embriogénico (Syed et al. 2008) y la oviposición de los insectos (Lou et al. 2019), en futuros estudios será necesario evaluar el efecto letal y subletal que podría producir Neurospora spp. sobre H. tuberculatus y conocer su papel en el control biológico de este piojo que afecta a la producción bufalina de México. Al respecto, Liu y Yang (2023), mencionan que las interacciones entre los microroganismos y algunos invertebrados del suelo pueden establer relaciones predador-presa y dar origen a interacciones más complejas, sin embargo, dada la biodiversidad de la biota muchas de estas interacciones aún no han sido estudiadas, por lo que este estudio presenta el aislamiento de un hongo en un sustrato no estudiado previamente.
El presente estudio reporta el hallazgo de un hongo perteneciente al género Neurospora encontrado en el cuerpo de piojos H. tuberculatus, los cuales fueron colectados de búfalos de agua. La identidad del hongo fue confirmado mediante morfología y secuenciación de marcadores moleculares, por lo que es importante continuar con estudios que ayuden a comprender la relación biológica entre el hongo y los piojos.
