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Introducción
En la ganadería, el metano (CH4) se emite principalmente por fermentación entérica en los rumiantes y es producido por arqueas metanógenas y asociaciones simbióticas de protozoos durante la fermentación del alimento (Caicedo et al. 2023). Para mitigar la emisión de este gas, actualmente, se han evaluado el uso de ionóforos, nitratos, aceites de diferentes semillas u oleaginosas y el uso estratégico de metabolitos secundarios, cuyo objetivo es mejorar al aprovechamiento de los alimentos, así como disminuir la actividad y proliferación de microbiota productoras de metano, sin limitar la función del rumen (Beauchemin et al. 2022). Así mismo, diversas investigaciones señalan que el uso de follaje y frutos de especies arbóreas tienen la capacidad de mitigar las emisiones de metano entérico, debido a su calidad nutritiva y alto contenido de metabolitos secundarios (Aragadvay-Yungán et al. 2022). Se ha reportado que el contenido de metabolitos secundarios en follaje y frutos de Leucaena collinsii y G. ulmifolia tienen la capacidad de mitigar las emisiones de metano entérico (Alatorre-Hernández et al. 2018) lo cual puede ayudar a establecer estrategias de su uso en la alimentación de rumiantes. Por otro lado, estas emisiones se han cuantificado por diversas técnicas, entre las que destacan el uso de cámaras respiratorias, la técnica del gas trazador hexafluoruro de azufre (SF6), espectroscopía infrarroja (Bekele et al. 2022), no obstante, se ha señalado que una de las técnicas más exactas para medir emisiones de GEI in vitro es por cromatografía de gases (Ribessi et al. 2020), sin embargo, el uso de esta técnica es limitada, principalmente por los altos costos de implementación. Por su parte, la Técnica de Producción de Gas in vitro (TPG), es una técnica económica que se ha utilizado ampliamente para evaluar el efecto de diferentes forrajes, dietas y aditivos en la fermentación ruminal, y degradación de la materia seca y, recientemente, también se ha utilizado para estimar la emisión de GEI (Pereyra et al. 2022). Por lo anterior, es de mucha utilidad realizar trabajos que evalúen la existencia de una relación entre la TPG y cromatografía de gases al estimar la emisión de metano. Uno de los pocos trabajos realizados al respecto es el presentado por Fievez et al. (2005), en el cual predijeron la producción de ácidos grasos de cadena corta y metano (energía perdida) en dietas compuestas, considerando la inclusión de frutos arbóreos (33.7%) y paja de trigo (66.3%), sin embargo, esta relación no se ha evaluado con el uso de frutos arbóreos por si solos. Por ello, el objetivo del siguiente trabajo fue evaluar modelos predictivos de la producción potencial de gas metano medido a través de la técnica de producción de gas in vitro y cromatografía de gases.
Materiales y métodos
Características del área en donde se llevaron a cabo los estudios
La producción de gas in vitro y análisis químicos de las muestras se realizaron en el Laboratorio de Nutrición Animal perteneciente a la Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad Autónoma de Chiapas, localizada en el municipio de Villaflores, Chiapas, México. Por otro lado, el contenido de metano se determinó en el laboratorio de Cromatografía de gases del Colegio de la Frontera Sur, unidad San Cristóbal de las Casas, Chiapas.
Selección y obtención de los frutos evaluados
Los frutos de Leucaena collinsii y Guazuma ulmifolia, se encuentran de manera abundante en la región de estudio, y fueron cosechados una vez que estaban fisiológicamente maduros, de manera manual y al azar en distintos árboles. Posteriormente, se depositaron en bolsas de papel con la identificación respectiva y se trasladaron al laboratorio de Nutrición Animal, en donde se determinó el contenido MS, una estufa de aire forzado a 55 °C por 48 h (peso constante) (AOAC 2000).
Producción de gas in vitro
La fermentación se realizó con la técnica de producción de gas in vitro (Menke y Steingass 1988). Para ello, se colocó 0.5 g de cada uno de los frutos arbóreos evaluados en viales de vidrio color ámbar de 125 mL de capacidad. Posteriormente, y bajo flujo continuo de bióxido de carbono (CO2) se adicionó 90 mL de inóculo ruminal diluido (1:10), el cual, se obtuvo de tres ovinos cánulados de la raza Katahdin. El inóculo ruminal fue filtrado a través de ocho capas de tela de gasa y se adicionó en una proporción de 1:10 a una solución mineral reducida, compuesta de KH2PO4 (0.45 g L-1), NaCO3 (0.6 g L-1), (NH4)2SO4 (0.45 g L-1), NaCl (0.9 g L-1), MnSO4 (0.18 g L-1), CaCl2 (0.12 g L-1), L-cisteína (0.25 g L-1) y Na2S (0.25 g L-1) (Meyer, Ciudad de México, México). Se incluyeron seis frascos como blancos (sin sustrato). Con el uso del manómetro se extrajo el exceso de CO2 para igualar la presión a cero, y se colocaron en baño maría a 39 °C (Prendo®, BM; Ciudad de México, México).
Se realizaron tres series de incubación de manera simultánea, cada serie comprendía tres repeticiones (viales) por cada fruto y fue repetida tres veces a través del tiempo, según recomienda Udén et al. (2012).
Determinación de la producción de metano
En técnicas de sistema cerrado, como la TPG, la producción de gas en las primeras 24 h son más representativas de lo que sucede en el animal. Por ello, para conocer la producción de metano por la Técnica de producción de gas in vitro y por cromatografía de gases, se midió el gas de fermentación (mL g-1) cada 6 h durante las primeras 24 h con la primera y segunda serie de incubación.
Para estimar CH4 por la técnica de producción de gas in vitro (TPG), se estimó el metano más gases menores (CH4+GM). Para ello, al gas de fermentación se le realizó la separación del CO2 por medio de una trampa (frasco de vidrio herméticamente sellado con tapón de hule y aro de aluminio) que contenía 40 mL de hidróxido de potasio (KOH) a una concentración de uno molar y una dilución de 56.10 g de KOH en un litro de agua destilada (Bartha y Pramer 1965). El volumen residual fue considerado como mL de CH4+GM y fueron ajustados como metano teórico (CH4) multiplicando cada valor por 0.77 (Zhong et al. 2016).
Por otro lado, para estimar CH4 por cromatografía de gases, el gas de fermentación que se obtuvo de la fermentación de los frutos cada 6 h por 24 h, se colocó al vacío en viales estériles que contenían una solución salina saturada con NaCl, en los que se conservó y traslado para su posterior análisis. Para cuantificar la producción de CH4 se utilizó un cromatógrafo de gases (Agilent Modelo 7890 B GC, Wilmington, EE. UU), con inyección manual que posee un detector de ionización por llama (FID, fíame ionization detector), Software Versión 01.07SR2, diámetro de columna 2 mm y 1.83 m de largo, con una temperatura de inyección de 75 °C. Se inyectaron 3 mL de gas de fermentación de cada una de las 12 muestras analizadas. En ambos métodos de estimación de metano, las concentraciones de este gas se corrigieron restando la producción de metano promedio de tres blancos. La producción de CH4 se expresó en mL de CH4 g-1 de MS.
Análisis químico de los frutos arbóreos tropicales
Se midió el contenido de materia seca (MS) de los frutos arbóreos según la NOM-116-SSA1-1994, posteriormente fueron molidos en un molino tipo Wiley con malla de 1 mm (modelo 3; Arthur H. Thomas, Filadelfia, PA). Se determinó el contenido de proteína cruda (PC), de materia orgánica (MO) y cenizas (Ce) siguiendo la metodología descrita por la AOAC (2000). También se analizaron los valores de Fibra Detergente Neutro (FDN) y Fibra Detergente Acido (FDA) (Van-Soest et al. 1991) y la presencia de Fenoles Totales (FT) y Taninos Condensados (TC) (Makkar 2003).
Parámetros y fracciones de fermentación in vitro
Para explicar el comportamiento en la producción de metano derivado de la técnica in vitro, se evaluaron los parámetros de fermentación in vitro con las muestras de la tercera serie de incubación. Para conocer los parámetros de fermentación, la presión de gas se midió con un manómetro (Infra; modelo 63100/1-4; Ciudad de México, México; 0 a 1 kg-1 cm2) a 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 34, 40, 48, 54, 60 y 72 h de incubación. Los valores de presión (kg-1 cm2) se transformaron a volumen de gas (mL g-1 de sustrato) con la ecuación de regresión (volumen = presión/0.019 con R2 = 0.98) y se estimaron los parámetros de la cinética de producción de gas: volumen máximo (Vmáx; mL g-1), tasa (S; h) y fase lag (L; h), para el modelo logístico V = Vmx/1 + e (2−4∗S T−L ) (Schofield y Pell, 1995), utilizando el paquete estadístico SAS. Las fracciones de fermentación se obtuvieron mediante el volumen fraccional (Vf) de gas de fermentación producido a tres intervalos de tiempo: 0 h a 8 h (Vf0-8), 8 h a 24 h (Vf8-24) y 24 h a 72 h (Vf24-72) de incubación, estos volúmenes fraccionales (mL g-1) fueron transformados a fracciones (g kg-1) de rápida (FR), media (FM) y lenta (FL) fermentación mediante las siguientes ecuaciones de regresión FR (g kg-1) = Vf0-8/0.4266 (R2 = 0.9441), FM (g kg-1) = Vf8-24/0.61 52 (R2 = 0.998), FL (g kg-1) = Vf24-72 /0.3453 (R2 = 0.9653).
Análisis estadístico
Se hizo un análisis de correlación y regresión para conocer las ecuaciones y los coeficientes de determinación (R2) entre CH4 por cromatografía de gases y estimación de CH4 a partir de la captura de CO2 por Hidróxido de Potasio (KOH) en la Técnica de Producción de gas in vitro. El modelo de regresión se consideró como la ecuación de ajuste. Para la composición química de los frutos se utilizó un análisis de varianza para un modelo lineal. El análisis se ejecutó utilizando Proc GLM del paquete Statistical Analysis System (SAS 2011).
Resultados y discusión
En la Tabla 1 se reportan valores de CH4, se observa que hubo interacción entre la Técnica de medición y el tipo de fruto (P < 0.004), y en general, el fruto de L. collinsii mostró valores más altos de CH4 que la G. ulmifolia (7.03 vs 2.12 mL g-1 MS; P < 0.0001) y la TPG mostró valores subestimados de CH4 con respecto a la de cromatografía (4.15 vs 4.99 mL g-1 MS, respectivamente) (P < 0.0001). De acuerdo a estos resultados, ambas técnicas de medición de CH4 entérico presentaron tendencias similares en la estimación de metano en los frutos arbóreos evaluados. Por otro lado, en la Tabla 2, se muestra el modelo de regresión simple entre las técnicas de cromatografía de gases y TPG in vitro. El modelo CH4 (Cro) = 1.25+0.9CH4 (TPG)+ Eij permite obtener las estimaciones de CH4 obtenidas por la técnica de cromatografía a través de la TPG (R2 = 0.99; P < 0.0001), lo que evidencia la factibilidad de usar la TPG in vitro para estimar metano entérico. En este sentido, se ha señalado que, por medio de esta técnica se puede determinar el efecto de las dietas sobre la emisión potencial de GEI (Miranda-Romero et al. 2018). Por otro lado, algunas investigaciones señalan que utilizando la TPG in vitro se puede obtener un indicador de calentamiento global a partir de la producción de CO2 y CH4, concluyendo que la técnica in vitro es útil para estimar el impacto ambiental por la fermentación de los alimentos para rumiantes (Jiménez-Santiago et al. 2019, Martínez-Hernández et al. 2019). Así también, esta técnica se ha empleado para estimar la emisión de metano en subproductos pecuarios como la cerdaza (Pérez et al. 2018) y recientemente para conocer la emisión de GEI de dos dietas para engorda de bovinos (Pereyra et al. 2022).
Tabla 1 Estimación de metano (mL-1 xg de sustrato) por cromatografía de gases y la técnica de producción de gas in vitro de frutos arbóreos del trópico seco.
| Metano | R2 | CV (%) | p de F | DSM 0.05 = | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TPG | Cro | Téc | TF | Téc*TF | ||||
| Lc | 6.73 | 7.32 | 0.9979 | 2.45 | <0.0001 | <0.0001 | 0.004 | 0.17 |
| Gu | 1.56 | 2.66 | ||||||
| DMS | 0,05 = 0.17 | 0.17 | ||||||
Lc: Leucaena collinsii; Gu: Guazuma ulmifolia; TPG: técnica de producción de gas in vitro; Cro: cromatógrafo de gases; CV: coeficiente de variación; Téc: técnica de medición; TF: tipo de fruto; DSM: diferencia mínima significativa; p de F: probabilidad de Fisher.
Tabla 2 Modelo de regresión simple entre las técnicas de estimación de metano por cromatografía de gases y la técnica de producción de gas in vitro.
| Y | β0 | β1X1 | β2X2 | β3X3 | R2 | p de F |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CH4 | 1.25 | 0.9 TPG | 0.99 | <0.0001 |
Por otro lado, el error esperado con la TPG in vitro, con respecto a cromografía de gases es de 0.0433 mL de CH4. La dispersión de los datos demuestra que ambas técnicas tuvieron un alto nivel de concordancia. Por lo que, a partir de la técnica de gas in vitro se podría pronosticar la emisión de metano en los frutos arbóreos evaluados (Figura 1). Sin embargo, es necesario continuar trabajando en la normalización de la técnica alternativa, para mejorar la precisión en la estimación de metano por la TPG in vitro, para ello, es necesario aumentar el número de repeticiones, lo que permitirá conseguir un buen estimador de los coeficientes de regresión. Lo que concuerda con otra investigación (Ribessi et al. 2020), en la que correlacionaron la emisión de CH4 de una dieta con 14.2% de PC por cromatografía de gases y por espectroscopia de absorción infrarroja y encontraron un R2 = 0.99, y concluyen que el número de repeticiones es fundamental para mejorar los coeficientes de correlación y regresión entre ambas técnicas.
Figura 1 Correlación entre metano estimado por cromatografía de gases y la técnica de gas in vitro de frutos arbóreos del trópico seco.
Por otra parte, se conoce que el potencial para mitigar la emisión de metano entérico en frutos arbóreos depende de su composición química. En este sentido, el fruto de L. collinsii presentó mayor concentración de PC y menor en G. ulmifolia, con 19.14 y 8.35%, respectivamente (P < 0.0001; Tabla 3). El contenido de MS y FDN fueron similares entre los frutos evaluados (P > 0.15). Respecto al contenido de metabolitos secundarios, la concentración de FT y TC fue mayor para los frutos de L. collinsii (P < 0.007), pero tuvo menor cantidad de MO y FDA (P < 0.05). La concentración de TC reportada en la investigación, coincide con los rangos reportados en otras investigaciones, en las que se indica que el contenido de TC en frutos arbóreos puede variar de 0.21 a 3.63% (Pinto-Trinidad et al. 2019, Rojas-Hernández et al. 2015), dependiendo del tipo de especie, condiciones climáticas, sitio de muestreo y etapa vegetativa de las plantas (Augustine et al. 2018). En este sentido, se ha documentado que TC con la misma concentración, pero de diferentes plantas pueden mostrar variaciones en la producción de CH4 (Gemeda et al. 2015). Estas variaciones son atribuidas principalmente al peso molecular y composición química de los TC (Huyen et al. 2016). Al respecto, se ha reportado el efecto del peso molecular de los TC de cáscara de Garcinia mangostana L y L. leucocephala sobre la producción de CH4, mismas que contenían TC con un peso molecular de 0.154 y 0.310 Da, respectivamente, encontrando menor emisión de metano en L. leucocephala, concluyendo que a mayor peso molecular menor emisión del gas (Paengkoum et al. 2015). Así también, se ha señalado que el impacto de los TC sobre la emisión de CH4, dependerá de la estabilidad química y vida útil del TC a nivel ruminal (Naumann et al. 2018). Por lo que, es necesario comprender que la actividad biológica de los TC y, por lo tanto, su efecto en la mitigación de metano, dependerá principalmente de su composición química. Por su parte, Cardoso-Gutiérrez et al. (2021) mencionan que las plantas con TC reducen la emisión de metano entérico debido a que inhiben la actividad de enzimas microbianas, disminuyen las poblaciones de protozoos y bacterias celulolíticas y forman enlaces con proteínas del forraje, reduciendo la degradación de la proteína ruminal.
Tabla 3 Composición química de frutos arbóreos del trópico seco (%).
| L. collinsii | G. ulmifolia | CV (%) | P de F | |
|---|---|---|---|---|
| MS | 96.07 ± 0.3 | 94.8 ± 1.2 | 0.91 | 0.15 |
| PC | 19.14 ± 0.6 | 8.35 ± 0.3 | 3.47 | <0.0001 |
| MO | 93.25 ± 0.1 | 94.3 ± 0.6 | 0.49 | 0.05 |
| Ce | 6.74 ± 0.1 | 5.67 ± 0.6 | 7.38 | 0.05 |
| FDN | 52.32 ± 0.6 | 51.82 ± 3.4 | 0.01 | 0.82 |
| FDA | 37.64 ± 1.1 | 44.54 ± 1.2 | 2.9 | 0.002 |
| FT | 1.3 ± 0.2 | 0.73 ± 0.13 | 13.75 | 0.007 |
| TC | 36 ± 0.1 | 0.23 ± 0.04 | 4.8 | <0.0001 |
±; Desviación estándar. MS: Materia seca; PC: proteína cruda; MO: materia orgánica; Ce: cenizas; FDN: fibra detergente neutro; FDA: fibra detergente ácido; FT: fenoles totales; TC: taninos condensados.
Por otro lado, la composición química también influye sobre el aprovechamiento a nivel ruminal de los sustratos y, por lo tanto, sobre la emisión de GEI. En la Tabla 4, se presentan los parámetros de la cinética y fracciones de fermentación de los frutos arbóreos. Se observa que el fruto de L. collinsii tuvo mayor Vm (169.17 mL g-1), posiblemente por el mayor contenido de PC (Tabla 3) y por el gas producción por las fracciones de FM y FL (P < 0.0001), así mismo la producción de gas derivada de la FR tendió a ser mejor en L. collinsii que en G. ulmifolia (P < 0.07). No se observaron diferencias estadísticas para la S (P > 0.037), sin embargo, los frutos de G. ulmifolia se fermentaron más prontamente (L = 1.966 h), pero con bajo potencial de fermentación (Vm = 42.53 mL g-1). Esto pudo deberse las características químicas de los FT y TC, lo que redujo el Vm, pero permitió disminuir la emisión de metano (Tabla 1).
Tabla 4 Parámetros de la cinética y fracciones de fermentación in vitro de frutos arbóreos tropicales del trópico seco.
| L. collinsii | G. ulmifolia | CV (%) | P de F | |
|---|---|---|---|---|
| L (h) | 967 ± 1.6 | 1.966 ± 1.8 | 29.8 | 0.006 |
| S(h-1) | 0.0216 ± 0.001 | 0.0241 ± 0.0009 | 18.8 | 0.37 |
| Vm (mL g-1 de MS) | 169.17 ± 2.7 | 42.53 ± 5.1 | 3.85 | <0.0001 |
| FR (gkg-1) | 38.55 ± 8.4 | 22.04 ± 8.04 | 27.3 | 0.07 |
| FM (g kg-1) | 66.22 ± 3.5 | 20.66 ± 2.4 | 6.9 | <0.0001 |
| FL (g kg-1) | 303.29 ± 1.8 | 57.00 ± 14.1 | 5.6 | <0.0001 |
| FT (gkg-1) | 408.06 ± 11 | 99.70 ± 8.4 | 3.9 | <0.0001 |
±: Desviación estándar; L: fase Lag; S: tasa de producción de gas; Vm: volumen máximo de producción de gas; FR: fermentación rápida; FM: fermentación media; FL: fermentación lenta; FT: fermentación total.
Aunque la composición química y la fermentación in vitro de la Leucaena collinsii fueron mejores a los de la Guazuma ulmifolia, estos no necesariamente se relacionan con menores emisiones de metano. La TPG tiende a subestimar los valores de metano con respecto a la cromatografía, sus valores pueden ser ajustados a través de modelos de regresión lineal simple válidos e independientemente del tipo de técnica de estimación de gas metano.
