Materiales y métodos

Colecta del material vegetal. La parte aérea de S. purpurea (hojas, tallos y flores) fue recolectada en el municipio de Santiago Huauclilla, Oaxaca, en el mes de octubre de 2017. Un ejemplar de la especie se depositó en el Herbario Medicinal del IMSS con el número de registro 16361. La identificación taxonómica fue realizada por la Dra. Martha Juana Martínez Gordillo.

Preparación de los extractos. Los extractos orgánicos de S. purpurea se obtuvieron por maceración a temperatura ambiente. El material vegetal (1,840 g) se secó, se trituró y se sometió a tres extracciones sucesivas de 24 horas con cada uno de los disolventes utilizados (acetona y metanol), los cuales fueron comprados en Tecsiquim, S.A. de C.V. (Ciudad de México, México). El exceso de disolvente se eliminó a presión reducida, en un rotaevaporador (Büchi bath B-490). Una vez secos, los extractos se pesaron y se obtuvieron los siguientes rendimientos: acetona (80 g, 3.7 %) y metanol (83 g, 3.8 %).

Para la obtención del extracto acuoso, 90 g de la parte aérea de la planta seca y molida se adicionaron a 200 mL de agua destilada para preparar una decocción, la cual ebulló durante 5 minutos. Después, el líquido fue filtrado y congelado con nitrógeno líquido para su posterior liofilizado (HETO FD3, Heto-Holten A/S, Denmark). Se obtuvo un rendimiento total de 3.5 g (3.8 %).

Reactivos y fármacos. Los fármacos de referencia ketorolaco (Supradol-Liomont) y diclofenaco (Merck) fueron adquiridos en la Ciudad de México. El ácido acético y la formalina fueron comprados de J.T. Baker y Sigma, respectivamente. Tween 80, reveladores y estándares de terpenoides y flavonoides fueron comprados en Sigma (St. Louis, MO). Acetona y metanol fueron adquiridos en Tecsiquim, S.A. de C.V. (Ciudad de México, México). Todos los fármacos y los extractos de metanol y acuoso fueron disueltos en solución salina (0.9 % NaCl, Sigma, St. Louis, MO). El extracto de acetona se resuspendió con Tween 80 al 0.5 % en solución salina. Los fármacos y extractos fueron administrados vía oral (p.o.) en un volumen de 10 mL/kg. Los agentes nociceptivos fueron el ácido acético y la formalina, los cuales fueron preparados al 1% diluidos con solución salina y administrados por vía intraperitoneal (i.p., 0.1 mL/10 g de peso corporal) o intraplantar (20 μL/pata), respectivamente. Todos los tratamientos se prepararon una hora antes de iniciar los experimentos y evaluados en las pruebas farmacológicas 30 minutos después de su administración.

Animales. Ratones macho de la cepa CD1 (25- 30 g) fueron obtenidos del Bioterio de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Autónoma de México. Los animales fueron manipulados previamente para su adaptación a las condiciones de experimentación y mantenidos sin restricción de alimento y agua a una temperatura de 22 ( 1 ºC y humedad estándar (50 ( 5 %) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. El día del experimento, los sujetos experimentales fueron separados en grupos de seis ratones. El protocolo fue aceptado el 21 de agosto de 2019 por la Comisión de Ética y Responsabilidad Científica de la Facultad de Ciencias, UNAM (CEARC-PI-2019-08-001). El manejo de los animales se realizó bajo los lineamientos éticos establecidos en la Norma Oficial Mexicana (NOM-062- ZOO-1999).

Toxicidad aguda (Dosis-letal media, DL ₅₀ ). Los ratones fueron administrados con una dosis máxima de 2,000 mg/kg, p.o. con los extractos de acetona, metanol y acuoso siguiendo el protocolo de la ^{OCDE (2001)} (documento de orientación sobre pruebas de toxicidad oral aguda). Los animales fueron observados durante 14 días para registrar manifestaciones de toxicidad como pérdida de peso, pérdida de locomoción, ataxia, paro respiratorio o muerte. Al finalizar los 14 días de observación, los ratones fueron sometidos a eutanasia y los órganos se analizaron macroscópicamente para visualizar posibles alteraciones en los tejidos.

Evaluación de la actividad antinociceptiva . Los ratones se dividieron en grupos de seis animales, los cuales recibieron como tratamiento: el vehículo, los fármacos de referencia diclofenaco o ketorolaco (10 mg/kg, p.o.), o una de las dosis de los diferentes extractos (3, 30 y 300 mg/kg, p.o.). Treinta minutos después de los tratamientos, los animales se sometieron de manera independiente a los modelos de dolor abdominal y nociceptivo-inflamatorio en las pruebas de estiramiento abdominal o formalina, respectivamente.

Prueba de estiramiento abdominal (“writhing”). Esta prueba consistió en la administración vía intraperitoneal (i.p.) de ácido acético al 1 % para inducir irritación en la cavidad peritoneal, la cual a su vez ocasiona una conducta estereotipada de estiramientos de los miembros posteriores y contracciones abdominales (^{Collier et al. 1968}). Todos los tratamientos fueron administrados vía p.o. 30 minutos antes de la inyección del ácido acético al 1 %. Un observador registró el número de estiramientos abdominales cada 5 minutos durante 30 minutos. La disminución significativa de los estiramientos abdominales comparados con el grupo testigo se interpretó como efecto antinociceptivo (^{Viana et al. 2003}).

Prueba de formalina. La nocicepción fue inducida con la inyección intraplantar de 20 μL de formalina al 1 % en la extremidad posterior derecha de cada ratón. Inmediatamente después la conducta nociceptiva se evaluó expresada como tiempo de lamida de la extremidad inyectada en intervalos de 1 minuto cada 5 minutos, por un periodo de 30 minutos. En esta prueba se registraron dos fases: la fase temprana o neurogénica (0 a 10 minutos) y la fase tardía o inflamatoria (10 a 30 minutos). La disminución significativa en cualquiera de las dos fases se interpretó como efecto antinociceptivo (^{Tjølsen et al. 1992}).

Análisis estadístico. El análisis se realizó utilizando análisis de varianza (ANADEVA) de una vía seguida de la prueba post-hoc de Dunnett para comparar los tratamientos contra el grupo control usando el programa Graphpad Prism v.7.0. Una significancia de P < 0.05 fue considerada estadísticamente significativa.

Análisis fitoquímico. Análisis por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (CLAR).- El análisis de terpenoides y compuestos fenólicos de Salvia purpurea se realizó en un cromatógrafo marca Agilent serie 1100 equipado con un detector de arreglo de diodos. Una muestra de cada extracto se preparó a una concentración de 50 mg/mL, los cuales se disolvieron por separado en acetona, metanol y agua grado CLAR de acuerdo con su polaridad. Los estándares se prepararon a una concentración de 3 mg/mL. Las muestras se filtraron para eliminar impurezas mediante acrodiscos con membrana de nylon con una apertura de poro de 0.4 µm. Se inyectaron 5 o 10 μL de los extractos y 20 μL de los estándares.

La identificación de terpenoides y compuestos fenólicos se realizó comparando el tiempo de retención con el de los estándares adquiridos en Sigma-Aldrich (St. Louis Mo. USA). La cuantificación se basó en las curvas de calibración del compuesto de referencia, obtenidos bajo las mismas condiciones cromatográficas. Las curvas se construyeron con el modelo de regresión lineal Y = mx + b por medio del software ChemStation de Agilent Co.

Para la identificación y cuantificación de terpenoides se utilizó una columna Zorbax Eclipse XDB-C8 (125 × 4.0 mm). La fase móvil fue acetonitrilo (ACN)/agua (80:20) con un flujo de 1 mL/min a una temperatura de 40 ºC. El equipo se calibró a longitudes de onda de 215 y 220 nm con un tiempo de análisis de 25 minutos. Los estándares utilizados fueron: estigmasterol, ácido ursólico, ácido oleanólico, α-β-amirina y β-sitosterol.

La identificación y cuantificación de ácidos fenólicos y flavonoides se llevó a cabo con una columna C18 Hypersil ODS (125 × 4.0 mm), con un gradiente de agua a pH 2.5 ajustado con ácido trifluroacético/ACN 0-10 min, 85 % de agua: 15 % de ACN; 20 min, 65 % de agua: 35 % de ACN; 25 min, 65 % agua: 35 % ACN. Se utilizaron los siguientes parámetros: flujo a 1 mL/min, temperatura de 30 ºC, longitudes de onda de detección de 254, 280, 316 y 365 nm y tiempo de análisis de 30 min. Los estándares de ácidos fenólicos utilizados fueron ácido clorogénico, cafeico, ferúlico, gálico, 3,5-dihidroxibenzoico, p-hidroxibenzoico, sinápico y siríngico. Los estándares de flavonoides usados fueron apigenina, canferol, catequina, floretina, florizina, naringenina, quercetina y rutina.

Resultados

Toxicidad aguda. Ninguno de los extractos produjo efectos de toxicidad aguda en las dosis probadas, ni a la máxima dosis explorada de acuerdo con la norma de la OECD, indicando un parámetro de DL₅₀ > 2,000 mg/kg, p.o. El grupo de ratones que recibió la administración del extracto metanólico presentó únicamente disminución en la actividad ambuladora sugiriendo un efecto ansiolítico ya reportado en otras especies (^{González-Trujano et al. 2016},^{Ortiz-Mendoza et al. 2020}). No hubo diferencia significativa en el peso de los ratones que recibieron los extractos en comparación con el vehículo durante la observación por 14 días. La necropsia de los animales permitió determinar que no hubo daño tisular, con excepción de los ratones administrados con el extracto metanólico, quienes presentaron pequeñas erosiones o úlceras como las provocadas por la presencia de fármacos analgésicos antiinflamatorios cuyo mecanismo de acción es la reducción de la protección de la mucosa gástrica por inhibición de las prostaglandinas (^{Vane & Botting 1998}).

Prueba de estiramiento abdominal “writhing”. Todos los extractos (3, 30 y 300 mg/kg, p.o.) y el fármaco de referencia (10 mg/kg, p.o) produjeron efecto antinociceptivo significativo no dependiente de la dosis en comparación con los ratones que recibieron el vehículo (Figura 1A, B, C).

Figura 1 Actividad antinociceptiva de los extractos de Salvia purpurea, el vehículo (VEH) y el ketorolaco 10 mg/kg, p.o. (fármaco de referencia, KET) expresada como estiramientos totales. Extracto de acetona (A), de metanol (B) y acuoso (C). Las barras representan la media ± el error estándar de seis animales. ANADEVA seguida de la prueba de Dunnett, *P < 0.05. 

Prueba de formalina. Los extractos orgánicos y acuoso redujeron significativamente la conducta nociceptiva en forma no dependiente de la dosis y similar al fármaco de referencia, tanto en la fase neurogénica (Figura 2 A, C, E) como en la fase inflamatoria (Figura 2 B, D, F) en comparación con el grupo que recibió el vehículo (Figura 2).

Figura 2 Actividad antinociceptiva de los extractos de Salvia purpurea, el vehículo (VEH) y el diclofenaco 10 mg/kg, p.o. (fármaco de referencia, DCF) evaluada en la prueba de formalina. Fase neurogénica del extracto de acetona, metanol y acuoso (A, C y E respectivamente). Fase inflamatoria (B, D y F). Las barras representan la media ± el error estándar de seis animales. ANADEVA seguida de la prueba de Dunnett, *P < 0.05. 

Análisis fitoquímico. El análisis cromatográfico de S. purpurea mostró que los extractos orgánicos (acetona y metanol) contienen el mayor número y abundancia de constituyentes de naturaleza terpénica (Figura 3, Tabla 1). El ácido ursólico y la α?amirina fueron los de mayor concentración, siendo esta última mayoritaria en el extracto de acetona (569.33 μg/mg) (Tabla 1). La mayoría de los compuestos fenólicos fueron identificados en los tres extractos (Figura 3, Tabla 1), sin embargo, los ácidos fenólicos estuvieron presentes en bajas concentraciones (0.005 a 0.166 μg/mg) (Tabla 1). Con respecto a los flavonoides, la florizina fue la molécula mayoritaria en los extractos acuoso y metanol con 2.36 y 1.61 μg/mg, respectivamente, seguido por la catequina con 0.560 μg/mg en el extracto de acetona y 0.438 μg/mg en el de metanol. La apigenina, el canferol, la naringenina, la quercetina y la rutina fueron determinados en los extractos en un rango de 0.090 a 0.389 μg/mg, a excepción de la rutina, flavonoide mayoritario en el extracto acuoso (0.548 μg/mg) (Tabla 1).

Figura 3 Estructuras de terpenoides y compuestos fenólicos identificados en extractos de Salvia purpurea. 

Discusión

Diferentes especies del género Salvia han sido utilizadas desde la antigüedad para el tratamiento de problemas digestivos, dolor e inflamación (^{Wu et al. 2012}, ^{Jenks & Kim 2013}, ^{Akaberi et al. 2016}). No obstante, los estudios farmacológicos que refuercen dichas propiedades antinociceptivas y antiinflamatorias, tanto de extractos crudos como de los metabolitos bioactivos aislados de salvias, son recientemente validados mediante el uso de diversos modelos de dolor agudo y crónico (^{Ghorbani & Esmaeilizadeh 2017}, ^{Santos et al. 2017}, ^{Moreno-Pérez et al. 2019}, ²⁰²¹, ^{Ortiz-Mendoza et al. 2020}, ^{Tlacomulco-Flores et al. 2020}).

S. purpurea se usa en la Medicina Tradicional Mexicana para el alivio del dolor abdominal, muscular nociceptivo o asociado con inflamación (^{Domínguez-Vázquez & Castro-Ramírez 2002}, ^{Guzmán-Gómez 2014}, ^{Nambo-Camacho 2015}). En forma similar, otras especies del género distribuidas en México, se utilizan en diversas comunidades para tratar afecciones gastrointestinales que incluyen dolor de estómago, diarrea, disentería, cólicos, indigestión, infección e inflamación estomacal, tales como: S. microphylla, S. coccinea, S. elegans y S. fulgens (^{Jenks & Kim 2013}); S. circinata y S. semiatrata (^{Nambo-Camacho 2015}).

La evaluación in vivo de la toxicidad aguda de los extractos de S. purpurea la colocan en un nivel de uso no tóxico (^{OCDE 2001}). No obstante, el efecto producido por el extracto de metanol como un daño gástrico leve sugiere la participación de un mecanismo de acción antiinflamatorio, posiblemente mediado por inhibición de la síntesis de prostaglandinas como se ha reportado para los fármacos analgésicos no esteroideos (^{Vane & Botting 1998}). La seguridad en el uso de Salvias es consistente con los resultados de toxicidad aguda de otras especies del género con una DL₅₀ > 2,000 mg/kg, p.o. calculada para extractos medianamente polares y polares de la parte aérea. Tal es el caso de extractos de S. aegyptiaca (^{Al-Yousuf et al. 2002}). Para el extracto hidroalcohólico de hojas de S. officinalis se reportó una DL₅₀ = 44.75 g/kg, p.o (^{Rodrigues et al. 2012}). En la infusión de S. circinata fue de DL₅₀ = 5 g/kg, p.o. (^{Flores-Bocanegra et al. 2017}) y DL₅₀ >2,000 mg/kg, i.p. (^{Moreno-Pérez et al. 2019}). Mientras que para S. hypoleuca la DL₅₀ = 1,800 mg/kg, i.p. (^{Karami et al. 2013}).

En el presente estudio farmacológico y fitoquímico, los resultados muestran que los extractos medianamente polar (acetona) y polar (metanol y acuoso) de S. purpurea produjeron actividad de tipo analgésica significativa, tanto en un modelo de dolor abdominal como en la respuesta nociceptiva e inflamatoria. En el modelo nociceptivo se apreció la influencia a nivel central y periférico, asociado con la reducción de la conducta nociceptiva en las fases neurogénica e inflamatoria. Estos datos concuerdan con los efectos antinociceptivos observados en otras especies de Salvia; por ejemplo, con el extracto hidroalcohólico (10-100 mg/kg, p.o.), acuoso (10-1,000 mg/kg) y de butanol (10-316 mg/kg) de S. officinalis se obtuvo actividad antinociceptiva y antiinflamatoria en los modelos de estiramiento abdominal y formalina en ratones (^{Qnais et al. 2010}, ^{Rodrigues et al. 2012}). Los extractos de acetona y metanol de S. aegyptiaca requirieron mayor dosis (250-2,000 mg/kg, p.o.) en ratones para apreciar su efecto antinociceptivo y antiinflamatorio en las mismas pruebas y adicionalmente en la placa caliente (^{Al-Yousuf et al. 2002}). Extractos de hexano, acetato de etilo y metanol de S. divinorum (100-400 mg/kg, p.o.) o en el caso del extracto de mediana polaridad en dosis de 3 a 100 mg/kg, i.p. (^{Tlacomulco-Flores et al. 2020}), promovieron efecto significativo en la prueba de estiramiento y/o formalina en ratones. Similares efectos fueron observados con extractos de diferente polaridad de S. circinata (1-300 mg/kg, i.p.) en las pruebas de “writhing” y formalina (^{Moreno-Pérez et al. 2019}, ²⁰²¹) y S. semiatrata (300 mg/kg, p.o.) en ambos modelos (^{Ortiz-Mendoza et al. 2020}). A pesar de ser pocos los estudios experimentales de Salvias mexicanas para el alivio del dolor, éstos son consistentes en el potencial que representan como alternativa medicinal y fuente de metabolitos activos para esta afección que afecta la calidad de vida de muchos pacientes cuyas enfermedades cursan con dolor agudo o crónico.

El análisis cromatográfico de S. purpurea mostró la semejanza entre los extractos de acetona y metanol, identificándose en ambos, constituyentes de naturaleza terpénica, tales como: ácido ursólico, ácido oleanólico, estigmasterol, α-amirina y β-sitosterol, estos compuestos fueron los de mayor abundancia con respecto a los compuestos fenólicos. Los ácidos fenólicos identificados en los tres extractos fueron: ácido clorogénico, ácido ferúlico, ácido 3,5-dihidroxibenzoico y ácido sinápico, los cuales se detectaron en bajas concentraciones. Cabe mencionar que este es el primer informe de la presencia del ácido sinápico en especies de Salvia. Con respecto a los flavonoides, la florizina fue la molécula mayoritaria en los extractos polares (metanol y acuoso). Dicho metabolito, al igual que la floretina, solamente han sido identificadas en salvias mexicanas (^{Moreno-Pérez et al. 2019}). Otros flavonoides detectados fueron la apigenina, el canferol, la catequina, la naringenina, la quercetina y la rutina. Los terpenoides y la mayoría de los compuestos fenólicos cuantificados en S. purpurea, ya han sido reportados en otras especies del género (^{Wu et al. 2012}, ^{Wang et al. 2019}, ^{Mocan et al. 2020}). Asimismo, de éstos ya se tiene conocimiento de sus propiedades antinociceptivas y antiinflamatorias.

Estudios fitoquímicos de plantas del género Salvia informan la presencia de sesquiterpenoides, diterpenoides, sesterpenoides, triterpenoides, esteroides y polifenoles (^{Wu et al. 2012}, ^{Jenks & Kim 2013}, ^{Wang et al. 2019}). Dichos compuestos se han considerado responsables de las propiedades antinociceptivos y antiinflamatorios atribuidos a estas especies (^{Imanshahidi & Hosseinzadeh 2006}, ^{Maione et al. 2017}). Los terpenos carnosol, ácido oleanólico y ácido ursólico, así como el flavonoide salvigenina fueron asociados a estos efectos en S. officinalis (^{Forouzanfar & Hosseinzadeh 2018}). Los ácidos rosmarínico, caféico y derivados de luteolina fueron parcialmente responsables en los efectos de S. halophila y S. virgata (^{Akkol et al. 2008}). La Salvinorina A, aislada de S. divinorum y derivados de dicha molécula han generado efectos tipo analgésico en diversos modelos en ratones (^{John et al. 2006}, ^{McCurdy et al. 2006}, ^{Guida et al. 2012}, ^{Crowley et al. 2020}). Efectos similares se reportaron para la tilifodiólida obtenido de S. tiliifolia (^{González-Chávez et al. 2018}) y para el diterpeno neo-clerodano amarisolida A y el flavonoide pedalitina aislados de S. circinata (^{Moreno-Pérez et al. 2019}). Un estudio reciente reportó esta actividad para el diterpeno neoclerodano 7-ceto-neoclerodan-3,13-dien-18,19:15,16-diólido purificado de S. semiatrata (^{Ortiz-Mendoza et al. 2020}). En los últimos años, ha sido notable el interés en los compuestos de naturaleza terpénica con actividad tipo analgésica en el género Salvia, cuyas especies presentan abundancia en metabolitos del tipo abietano, labdano, clerodano, pimarano e icetexano (^{Wu et al. 2012}).

Los compuestos de naturaleza terpénica identificados en los extractos de S. purpurea fueron el ácido ursólico, el ácido oleanólico, la α-amirina, el estigmasterol y el β-sitosterol, triterpenos reportados en otras especies de Salvia (^{Topçu 2006}, ^{Wu et al. 2012}, ^{Wang et al. 2019}). Los ácidos ursólicos y oleanólicos aislados de Salvia officinalis tuvieron efecto antinociceptivo en la prueba de formalina (^{Rodrigues et al. 2012}, ^{Forouzanfar & Hosseinzadeh 2018}). La α-amirina aislada de Protium heptaphylum (Aubl.) March. (Burseraceae) y el estigmasterol de Mondia whytei (Hook.f.) Skeels. (Apocynaceae) produjeron efectos antinociceptivos en las pruebas de estiramiento abdominal y de formalina (^{Oliveira et al. 2005}, ^{Holanda Pinto et al. 2008}, ^{Githinji et al. 2012}). Por otro lado, el β-sitosterol fue responsable de la actividad antinociceptiva reportada para Buddleja thyrsoides (^{Fialho et al. 2017}).

Los ácidos fenólicos identificados en los extractos de S. purpurea fueron ácido clorogénico, ácido ferúlico, ácido 3,5-dihidroxibenzoico, ácido p-hidroxibenzoico y ácido sinápico, de los cuales, el ácido clorogénico y el ferúlico son caracterizados como compuestos con propiedades analgésicas y antiinflamatorias (^{dos Santos et al. 2006}, ^{Xu et al. 2016}, ^{Javed et al. 2020}).

En todos los extractos de S. purpurea se identificaron los flavonoides apigenina, canferol, catequina, floretina, florizina, naringenina, quercetina y rutina. De dichos compuestos ya se han demostrado sus propiedades analgésicas reiterando con este estudio su participación como bioactivos. La apigenina, catequina y naringenina presentaron un potente efecto antinociceptivo y antiinflamatorio en las diversas pruebas donde fueron evaluadas (placa caliente, inmersión de la cola, “writhing”, formalina y carragenina) (^{Pinheiro et al. 2012}, ^{Islam et al. 2019}, ^{Xue et al. 2019}). La florizina y su aglicona floretina son reportadas principalmente por sus efectos antinflamatorios (^{Sekhon-Loodu et al. 2015}, ^{Kim et al. 2018}). Finalmente, el canferol, la quercetina y la rutina, especialmente activos en la fase inflamatoria (^{Selvaraj et al. 2014}, ^{Hirota et al. 2016}, ^{do Nascimento et al. 2018}), en parte mediada por la inhibición de la enzima COX-2 (^{Lesjak et al. 2018}), lo cual hace que el daño gástrico que pudiera visualizarse sea menor en comparación con los AINEs utilizados en la clínica como lo observado con el extracto metanólico de S. purpurea.

En conclusión, los datos de este estudio dan evidencia farmacológica y fitoquímica de los efectos antinociceptivos de extractos medianamente polares y polares de S. purpurea reforzando su uso en la Medicina Tradicional Mexicana para el tratamiento de afecciones que cursan con dolor abdominal, nociceptivo y asociado a inflamación. Donde la interacción de constituyentes de naturaleza terpénica y fenólica juegan un papel relevante para la eficacia y seguridad de su uso.