Trabajo de campo

La colecta de ejemplares de Pinus se realizó en diversas localidades del estado de Hidalgo (Cuadro 1).

Cortes foliares y tinción

Las acículas se fijaron en FAA (Formaldehido: Ácido acético glacial: Alcohol etílico al 50 %, en proporción 5: 5: 90) por tiempo indefinido. Se obtuvieron cortes transversales de forma manual, con una navaja de un solo filo; de ellos se seleccionaron los mejores para la tinción histológica, mediante el procedimiento utilizado por ^{Hernández-León(2011)}: Citrisolv 2 (15 min); EtOH 100 % (5 min); EtOH 96 % (5 min); EtOH 70 % (5 min), EtOH 50 % (5 min); ddH₂O (5 min); Alcian blue (30 min); ddH₂O (5 min); EtOH 50 % (3 min); Safranina (2 hr); 50 % EtOH (3 min); 70 % EtOH (3 min); 96 % EtOH (3 min); 100 % EtOH (3 min); Citrisolv (15 min). Una vez teñidos los cortes, se montaron en preparaciones permanentes con la resina sintética Entellan (Merk Co., Alemania) para ser observados a diferentes aumentos en un microscopio óptico.

Codificación de caracteres

Mediante una revisión de la literatura y la observación de las preparaciones permanentes se establecieron nueve caracteres foliares y sus correspondientes estados de carácter, como se muestra en el Cuadro 2 (^{Coulter y Rose, 1886}; ^{Shaw, 1914}; ^{Martínez, 1945}; ^{Lanyon, 1966}; ^{Mirov, 1967}; ^{Farjon y Styles, 1997}; ^{Ortiz, 1999}). Los caracteres y estados de carácter fueron descritos con observación de las preparaciones permanentes a diferentes aumentos, en un microscopio óptico Axioscope 40 (Carl Zeiss). Los cortes foliares se fotografiaron con un sistema de cámara digital acoplado al microscopio, y las imágenes se editaron en Adobe ^® Photoshop ^® CS6 Extended, versión 13.0.1 x32 (2017), para destacar los rasgos anatómicos foliares relevantes. Se construyó una matriz de datos morfoanatómicos a partir de las observaciones.

Análisis de datos

Los datos anatómicos foliares de las 12 especies fueron analizados con el método de Agrupamiento por Pares no Ponderados con Media Aritmética (UPGMA) (^{Sokal y Michener, 1958}); con una matriz de presencia/ausencia (Cuadro 3). El análisis empleó el coeficiente de similitud de Jaccard utilizando la herramienta en línea DendroUPGMA (^{Garcia-Vallvé et al., 1999}).

Trabajo de campo

En total se colectaron 30 ejemplares, los que fueron procesados y depositados en la colección del Herbario del Área Académica de Ciencias Agrícolas y Forestales del Instituto de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo campus Tulancingo y en el Herbario Nacional de México (MEXU). Los ejemplares corresponden de 1 - 3 individuos de las 12 especies de pinos de Hidalgo (Cuadro 1).

Cortes foliares y tinción

Las treinta preparaciones permanentes (30) de cortes transversales de acículas se incorporaron a la colección del Herbario del Área Académica de Ciencias Agrícolas y Forestales del Instituto de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo y están disponibles para consultas posteriores.

Codificación de caracteres

La matriz de datos de los caracteres y estados de carácter se presentan en el Cuadro 3. La forma de las células de la epidermis presentó variación intraespecífica e interespecífica, lo cual es consistente con registros previos (^{Farjon et al., 1997}).

De las especies estudiadas, ocho presentaron la vaina basal del fascículo permanente. Los taxa con la vaina basal de fascículo decidua fueron Pinus ayacahuite, P. cembroides, P. leiophylla y P. pinceana, con la excepción de P. leiophylla, estos taxones pertenecen a los pinos blandos o subgénero Strobus. Pinus leiophylla es una de las pocas especies de pinos duros o subgénero Pinus con la vaina basal de los fascículos decidua (^{Gernandtet al., 2005}). El estado de carácter de la vaina basal del fascículo es de utilidad para la asignación de ejemplares a grupos, pero en combinación con otras características puede ser efectiva para la identificación de algunos taxa (^{Farjon et al., 1997}).

Las especies tuvieron dos, tres y hasta cinco acículas por fascículo. El número de acículas por fascículo ha sido muy utilizado para la identificación de las especies de pinos, generalmente, en combinación con otros rasgos (^{Farjon y Styles, 1997}; ^{Farjon et al., 1997}; ^{Eckenwalder, 2009}). Las acículas de un fascículo forman un cilindro, el número de acículas por fascículo determina su forma transversal, que corresponde a una sección del cilindro; por ejemplo, en fascículos con una acícula la forma transversal será circular; en fascículos con dos acículas es semicircular (Figura 1B); en fascículos de tres será transversalmente triangular (Figura 1 D, G, I, J, L); y en fascículos con cuatro o más presentará un forma ampliamente triangular (Figura 1A, C, E, F, H, K) (^{Martínez, 1953}; ^{Farjon y Styles, 1997}).

A = Pinus ayacahuite; B = P. cembroides; C = P. devoniana; D = P. greggii; E = P. hartwegii; F = P. leiophylla; G = P. montezumae; H = P. oocarpa; I = P. patula; J = P. pinceana; K = P. pseudostrobus; L = P. teocote; * = Indica la posición de los estomas; Cr = Canal resinífero; End = Endodermis; Epi = pidermis; Escl = Esclerénquima; Flo = Floema; Hip = Hipodermis; Mes = Mesófilo; Tt = Tejido de transfusión; Xil = Xilema.

Figura 1 Secciones transversales de acículas de especies de Pinus del estado de Hidalgo. 

Pinus cembroides fue la única especie con dos formas de la hoja en corte transversal. Por su forma semicircular puede diferenciarse del resto de las especies (Figura 1B); sin embargo, cuando presenta forma transversalmente triangular resulta imposible su separación de P. pinceana (Figura 1J). Pinus ayacahuite fue la única especie en presentar la disposición de las estomas epistomática (Figura 1A), mientras que en el resto de los taxa la disposición fue anfistomática.

Para el carácter espesor de las paredes de las células de la hipodermis, se registró con mayor frecuencia el estado de carácter "espesor uniformemente delgado de las paredes de las células de la hipodermis" (P. ayacahuite, P. greggii y P. leiophylla; Figura 2C), mientras que el "grosor de las paredes de las células de la hipodermis aumentando gradualmente hacia el interior" fue observado con menor frecuencia (P. devoniana y P. pseudostrobus; Figura 2A). Pinus patula y P. pinceana exhibieron variación intraespecífica para este carácter (Cuadro 3). ^{Farjon y Styles (1997)} proponen que las hojas largas, con estratos de células de paredes delgadas en la hipodermis están restringidas principalmente a climas templados o subtropicales mésicos (P. ayacahuite, P. greggii, P. patula).

A = Pinus devoniana; B, E, I = P. teocote; C-D = P. greggii; F, H = P. cembroides; G = P. oocarpa; Cre = Canal resinífero externo; Cri = Canal resinífero interno; Crm = Canal resinífero medio; Crs = Canal resinífero septal; End = Endodermis; Epi = Epidermis; Flo = Floema; Hip = Hipodermis; Hv = Haz vascular; Mes = Mesófilo; Tt = Tejido de transfusión; Xil = Xilema.

Figura 2 Secciones transversales de acículas de especies de Pinus del estado de Hidalgo. 

Se ha observado la existencia de diferentes grados de intrusiones hipodermales en el mesófilo (^{Martínez, 1945}). De las especies incluidas en esta investigación, Pinus devoniana y P. pseudostrobus presentaron intrusiones hipodermales (Cuadro 3, figuras 1C, K y 2A); el resto de los taxa carecen de intrusiones (P. greggii; Figura 2C). Hay concentraciones de tejido hipodermal en áreas marginales; mientras que, en el resto de la hoja, la hipodermis persiste en dos estratos celulares (^{Farjon y Styles, 1997}).

En algunas especies, como Pinus oocarpa, el número de canales resiníferos fue altamente variable, de 1-6; mientras que en P. pinceana, por ejemplo, se observaron dos canales resiníferos de manera constante (Figura 1J). En este último caso, el carácter puede ser de utilidad para la identificación de la especie a nivel de estado (Cuadro 3) (^{Perry, 1991}; ^{Farjon y Styles 1997}; ^{Cole et al., 2008}). Estudios previos indican un intervalo de 1-12 canales resiníferos en las hojas de especies de pinos en América Latina, y para el caso de Hidalgo, se registraron de 1-6 canales resiníferos por acícula (^{Farjon y Styles, 1997}).

Pinus oocarpa y P. ayacahuite mostraron el mayor número de canales resiníferos (6), mientras que en cortes de acículas de P. oocarpa se observó el menor número de canales resiníferos (1). De acuerdo con ^{Helmers (1943)}, el número de canales resiníferos tiene una estrecha relación con el medio ambiente. Eventualmente, algunas acículas pueden no tener canales resiníferos, pero dicha condición no está asociada con ninguna especie en particular. P. donnell-smithii, puede ser la excepción de ser reconocido a nivel específico, ya que muchas acículas carecen de canales de resina; ^{Perry, (1991)}. Algunos autores consideran que el número de canales resiníferos, por ser altamente variable, no puede tomarse como elemento sistemático (^{Martínez, 1945}).

La posición de los canales resiníferos constituye un carácter comúnmente utilizado para la clasificación e identificación de especies, desde ^{Engelmann (1880)} y ^{Coulter y Rose (1886)}, debido a que la mayoría de las especies se caracterizan por presentar una sola posición, aunque existen combinaciones como las citadas en este estudio para Pinus devoniana y P. montezumae (Figura 1C, G). Pero nunca se han consignado combinaciones de más de dos posiciones (^{Farjon y Styles, 1997}). La posición y el número de los canales resiníferos usados en combinación son muy útiles para la identificación de muchos taxa (^{Perry, 1991}). En especies con número variable de canales resiníferos se consideran primarios los de mayor tamaño y posición fija, y subsidiarios a los de menor tamaño (^{Farjon y Styles, 1997}). Su posición al ser menos variable que su número resulta de mayor utilidad para fines de identificación (^{Martínez, 1945}). La posición media de los canales resiníferos fue predominante para las especies de pinos del estado de Hidalgo (Pinus leiophylla, P. montezumae, P. pseudostrobus) (^{Martínez, 1945}; ^{Farjon y Styles, 1997}) (Figura 1F, G, K), mientras que la posición septal solo se observó en P. oocarpa, por lo que este estado de caracteres es diagnóstico para esa especie, al menos dentro del estado de Hidalgo (figuras 1H, 2G).

El engrosamiento externo de la pared de las células de la endodermis (Figura 2I) ha sido utilizado como carácter diagnóstico (^{Farjon y Styles, 1997}). Sin embargo, en las especies con múltiples individuos, como las incluidas en el presente estudio, existe polimorfismo intraespecífico e interespecífico, por lo que no es adecuado para la identificación taxonómica.

La presencia de uno (Figura 2H) o dos (Figura 2I) haces vasculares sustenta la propuesta de ^{Koehne (1893)} de dividir en dos secciones al género Pinus, sección Haploxilon y Diploxilon, que corresponden con los subgéneros Strobus y Pinus (^{Gernandt et al., 2005}), lo cual fue consistente con los resultados de esta investigación.

El esclerénquima que en la región vascular rodea y en algunas ocasiones divide los haces vasculares (^{Farjon y Styles, 1997}), se observa en algunos taxones: Pinus oocarpa y P. teocote (Figura 1L). Sin embargo, no es un carácter diagnóstico, debido a su variación.

Análisis de agrupamiento

El análisis de similitud de los caracteres morfoanatómicos de las acículas resultó en dos grupos principales (Figura 3). En el grupo uno se asocian Pinus ayacahuite, P. cembroides y P. pinceana del subgénero Strobus más relacionados que con otras especies; y por otro lado P. greggii, P. patula y P. teocote del subgénero Pinus. El segundo grupo principal está formado por taxa del subgénero Pinus: P. devoniana, P. hartwegii, P. leiophylla, P. montezumae, P. oocarpa y P. pseudostrobus; P. oocarpa se separó del resto de las especies al interior del grupo. En las terminales se forman grupos por taxón excepto para una muestra de Pinus cembroides que se agrupa con P. pinceana. De acuerdo con ^{Eckenwalder (2009)}, la convergencia en las características de las hojas entre especies no relacionadas está provocada por la fuerte asociación entre los rasgos foliares con las condiciones ambientales, de tal manera que los rasgos de la hojas pueden reflejar los mecanismos de adaptación de las plantas a su ambiente (^{Tian et al., 2015}).

Coeficiente de correlación cofenético = 0.847018494508054. El número en cada terminal indica el número de ejemplares por especie.

Figura 3 Dendrograma obtenido por análisis de agrupamiento UPGMA, con el uso del coeficiente de similitud de Jaccard en 12 especies de Pinus distribuidas en el estado de Hidalgo.  

Clave de identificación

A partir de la clave dicotómica producto de la investigación que se documenta es posible diferenciar 10 de las 12 especies de pinos del estado de Hidalgo. P. cembroides y P. pinceana, únicamente, se separan cuando la forma del corte transversal es semicircular en la primera especie.