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Introducción
Los mulares son el producto de la hibridación entre caballares y asnales, caracterizados por la rusticidad y desempeño en las labores agropecuarias (arrastre, tracción y carga) en varios continentes. También son utilizados para silla, vaquería, exposición, transporte, turismo, equinoterapia y recientemente en patrullaje policial en Colombia1,2. A pesar de que los mulares son multifacéticos, se desconocen muchos aspectos sobre la epidemiología de enfermedades y de salud en general en comparación con otras especies de équidos2,3.
El cortisol es una hormona secretada por la corteza de las glándulas adrenales, siendo un glucocorticoide con funciones relevantes en la homeostasis orgánica como: gluconeogénesis, proteólisis, lipólisis, hiperglicemia, modulación de la inmunidad e inflamación, entre otras4,5. Adicionalmente, participa en procesos patológicos y es considerado de valor pronóstico para diferentes alteraciones gastrointestinales, respiratorias y en casos de sepsis en equinos6-9. Igualmente, se considera la hormona de la adaptación a diferentes actividades generadoras de estrés10-13, e indicador de acondicionamiento físico y desempeño atlético en caballos de deporte14.
La secreción de cortisol ocurre en respuesta a la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), al ser activado el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal (EHPA) por una variedad de factores fisiológicos (glucemia, presión sanguínea), patológicos, estrés, medio ambientales, climatológicos y estacionales15,16. La ACTH se libera en respuesta a la hormona liberadora de corticotropina (HPC) del hipotálamo que actúa sobre receptores tipo 1 localizados en los corticotropos de la pituitaria anterior, que a su vez se activa a través del EHPA y, al mismo tiempo se controla por una retroalimentación negativa15.
La alta variabilidad en concentraciones de cortisol en los caballos y asnos ha conllevado a determinar valores de referencias según estado fisiológico, grupo etario, tipo de actividad, manejo y condiciones medioambientales en diferentes razas; variabilidad que se ha considerado de tipo multifactorial17-21. A pesar de los extensos estudios en equinos y en menor proporción en los asnales sobre el cortisol, hay escasa información en mulares. Por tanto, este estudio tuvo como objetivo, relacionar la concentración del cortisol sérico de una población de mulares con el tipo de actividad agropecuaria que realizaban, grupo de edad y sexo, ubicados en el trópico.
Material y métodos
El estudio obtuvo aprobación del Comité de Ética para la Experimentación Animal de la Universidad de Antioquia (Protocolo N.º 1222019). Se realizó con mulares de los municipios aledaños al área metropolitana de la ciudad de Medellín, departamento de Antioquia, Colombia. El departamento tiene una altitud promedio de 2,055 msnm, con rangos promedio anuales de lluvia de 1,500 a 5,000 mm, y dos temporadas secas y dos lluviosas. La humedad relativa del aire oscila entre 63 a 73 % durante el año, con temperatura entre 18 y 28° C, zona intertropical con climas tropicales A (clima ecuatorial, monzónico y sabana), según el sistema Köppen-Geiger (IDEAM Cartografía Básica IGAC, 2018).
Animales
Se seleccionaron 97 mulares clínicamente sanos (65 machos y 32 hembras), de 8.7 ± 4.4 años, 290.5 ± 37.6 kg de peso, y condición corporal de 5 ± 0.822. Los animales eran manejados con pastoreo, suplementados con subproductos de la caña de azúcar y destinados a labores agropecuarias de carga, vaquería o silla. Los mulares se dividieron en tres grupos etarios: jóvenes (<5 años), adultos (6-14 años) y geriátrico (>15 años); sin categorizar la carga de trabajo. Se les realizó un examen físico, incluyendo frecuencia cardiaca (FC), frecuencia respiratoria (FR), temperatura (°C), y se colectó sangre para medir concentraciones séricas de cortisol.
Toma de muestras
Las tomas de las muestras se hicieron con mínima manipulación de los mulares, antes de las actividades de rutina (carga, vaquería y silla), previa limpieza y preparación antiséptica del lugar. Se realizó en las mañanas (0700-1100 h) mediante punción de la vena yugular en tubo de vacío sin anticoagulante. Las muestras se centrifugaron a 201 xg durante 10 min para obtener la fracción sérica y posteriormente alícuotas se pusieron en tubos Eppendorf y congeladas a -20° C hasta su análisis.
Concentración del cortisol
El proceso de determinación de cortisol sérico en los mulares fue reportado previamente23. En síntesis, se utilizó el kit comercial ELISA tipo sándwich (AccuBind®, Monobind Inc., USA), utilizando un lector convencional de longitud de onda de 450-630 nm (Stat Fax 303® Plus Microstrip Reader, Awareness Technology Inc., USA). La validación del kit se hizo utilizando seis calibradores y tres controles: Multiligan A: 07,7 ng/ml, Multiligan B: 97,4 ng/ml y Multiligan C: 193.2 ng/ml (QSure® Multi-Ligand Control Tri-Level, Monobind Inc., USA). Las concentraciones de cortisol sérico se expresaron en ng/ml. El kit, de acuerdo con el fabricante, tiene una sensibilidad de 3.77 ng/ml, y detecta concentraciones entre 4.0 a 950 ng/ml.
Análisis estadístico
El número de individuos a evaluar se determinó usando la fórmula convencional para hallar el tamaño muestral en una población infinita, obteniéndose una muestra de 97 mulares. Inicialmente se realizó un estudio descriptivo transversal, tomando una única muestra de los individuos. Los datos se registraron usando el programa Microsoft Excel® y por medio del test Kolmogorov-Smirnov usando el software estadístico SAS® v. 9.2 (USA) se determinó que no tenía una distribución normal. En el análisis de correlación entre grupos etarios y actividad, se implementó la prueba de Kruskal-Wallis y, para el sexo se usó el test de Mann-Whitney para identificar el nivel de significancia (P<0.05).
Resultados
La mediana de concentración de cortisol sérico fue de 96.3 ng/ml, con valores mínimos de 6.8, máximos de 248.2; y su respectiva distribución percentil al 25% (78.6 ng/ml), al 75 % de 134.4. La distribución según sexo, grupo etario y actividad se muestra en el Cuadro 1. En términos generales, la concentración de cortisol sérico fue de 96.3 ng/ml (varianza: 165.3 ng/ml) sin diferencias significativas entre sexo, grupo etario y actividad (P>0.05). Adicionalmente, el 75 % de la población tuvo un valor de cortisol menor o igual a 134.4 ng/ml, con un rango de distribución entre 6.8 y 248.2 ng/ml.
Cuadro 1 Concentración de cortisol sérico (mediana), según el género y grupo etario y constantes fisiológicas de la población de mulares analizada (97 individuos)
| N | Cortisol (ng/ml) | FC (lpm) | FR (rpm) | Temp (ºC) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Media | DE | Valor-P | |||||
| Grupo etario1 | |||||||
| Joven | 17 | 93.1 | 36.5 | 0.368 | 40.0 | 20.0 | 37.6 |
| Adulto | 67 | 80.0 | 41.7 | 38.0 | 24.0 | 37.6 | |
| Geriátrico | 13 | 98.3 | 40.5 | 36.0 | 20.0 | 37.8 | |
| Sexo2 | |||||||
| Hembras | 32 | 98.4 | 33.9 | 1.0 | 37.5 | 20.5 | 37.7 |
| Machos | 65 | 93.1 | 43.7 | 38.0 | 22.0 | 37.6 | |
| Actividad1 | |||||||
| Carga | 63 | 108.2 | 45.6 | 0.564 | 39.0 | 21.0 | 37.4 |
| Vaquería | 28 | 82.0 | 24.4 | 38.0 | 27.0 | 37.5 | |
| Silla | 6 | 105.9 | 29.2 | 41.0 | 22.0 | 37.7 | |
DE= desviación estándar; FC= frecuencia cardiaca; FR= frecuencia respiratoria.
1Test de Kruskal-Wallis, 2 Test de Mann-Whitney,
Discusión
Los mulares por sus características evolutivas, resistencia y eficiencia, son empleados en diferentes actividades, siendo en muchos casos, explotados de manera negativa1,2. Por otro lado, se dispone de escasos estudios sobre las enfermedades generadas por el abuso, negligencia y aspectos relacionados con el bienestar animal24. En el presente estudio, la población de estos ejemplares fue representativa de la región.
Las concentraciones de cortisol en equinos han sido ampliamente estudiadas en diferentes tipos de muestras (plasma, saliva, lágrimas, fecal y pelo) bajo un sinnúmero de técnicas de laboratorio, estado fisiológico, salud, edad, sexo, razas, estrategias de manejo, fin zootécnico, y en respuesta a estrés25-29, permitiendo realizar comparaciones y, determinar diferencias según las condiciones medioambientales y región geográfica18,19. En asnales, aunque ha sido estudiado en menor proporción, los valores de referencias indican similitud con la concentración basal de los equinos30,31,32; sin embargo, no se ha encontrado evidencia del efecto de las estaciones climáticas sobre los niveles de cortisol, como en el caso de los equinos33, aunque es probable que exista de acuerdo con la estacionalidad de la ACTH. No obstante, estos estudios son inexistentes en mulares, por tanto, se debe de comparar con estudios previos de las demás especies de équidos.
La concentración de 96.3 ng/ml cortisol sérico determinado en el presente estudio fue superior a la mayoría de los reportes en caballos y asnos que oscilan entre 29.0 y 66.0 ng/ml en países no tropicales30-33; pero fue menor al reportado, con el mismo kit comercial, en Caballos Criollos Colombianos (CCC) manejados en condiciones climatológicas y de relieve similares (133.0 ± 74.0 ng/ml), pero con manejo diferentes, pues los caballos permanecían en estabulación y con rutina de ejercicios establecida13. Lo anterior podría explicar diferencias evolutivas inter-especie, nivel de adaptación, rusticidad y grado de respuesta fisiológica a factores de estrés y adversidad.
El rango de concentraciones de cortisol sérico en los mulares mostró valores extremos (mínimo: 6.8 ng/ml y máximo: 248.2 ng/ml), siendo menores a los reportados en los CCC de 42.0 y 481.0 ng/ml respectivamente13. En ambos estudios, los animales se encontraban clínicamente normales (constantes fisiológicas dentro los parámetros para la especie), de allí que el elevado cortisol estaría más asociado a factores inherentes a cada individuo (temperamento) y a efecto del trópico26. Adicionalmente, es pertinente mencionar, que a pesar de que los mulares de este estudio, eran sometidos a largas y exigentes jornadas de trabajo, con ayunos prolongados, los valores del cortisol fueron menores; sin embargo, no se podría inferir la ausencia de estrés o nivel de adaptación con un solo valor de cortisol, sin un grupo control y sin caracterizar la carga de trabajo, requiriéndose la determinación del índice del cortisol17, con la medición del cortisol matinal y vespertino.
La no diferencia estadística en concentraciones séricas de cortisol entre machos y hembras, grupos etarios y tipo de actividad, fue igualmente similar a lo reportado en el CCC13. Sin embargo, la tendencia fue más homogénea en las variables de estos mulares que en los CCC. Esto podría indicar cierta estabilidad de la concentración de cortisol y podría ser considerada como valor de referencia para la especie, pero tomando en consideración respuestas individuales y a externos, reflejado en el rango del valor mínimo y máximo17,34. Sin embargo, para poder realizar una comparación del comportamiento de este analito entre ambas especies, se deben desarrollar estudios que involucren simultáneamente caballos y mulares de la misma región y en similares condiciones medioambientales.
Finalmente, se ha descrito diferencias en las técnicas para la determinación de la concentración del cortisol, especialmente entre la quimioluminiscencia y ELISA, reportando diferencias hasta de 15.7 ng/ml entre ambas, siendo más exacto la primera7. Sin embargo, los valores obtenidos a través del radioinmunoensayo han sido similares a los obtenidos por ELISA8. Además, el tipo de muestra puede influir, donde varios trabajos han utilizado diferentes substratos para su determinación, algunos sin diferencias significativas14. Por otro lado, el tipo de muestra puede afectar el resultado de su concentración. No obstante, en este estudio se decidió trabajar con suero, dada la ausencia de valores previos en este substrato. Asimismo, se tuvo en cuenta los cuidados suficientes (mínima manipulación) para no alterar los resultados y se utilizaron controles comerciales para la validación de la técnica.
Conclusiones e implicaciones
La concentración del cortisol sérico de mulares (96.3 ng/ml) usados en extensas actividades agropecuarias en condiciones del trópico fue menor a la reportada en equinos de la misma región geográfica y sometidos a condiciones menos estresantes. Por tanto, se debe de confirmar diferencias de adaptación y resistencia a factores de estrés entre estas especies.
