Definición y análisis del panel de polimorfismos de nucleótido simple a utilizar en pruebas de paternidad para tres razas de bovinos

Domínguez-Viveros, Joel; Medellín-Cazares, Adán; Aguilar-Palma, Nelson; Jahuey-Martínez, Francisco Joel; Rodríguez-Almeida, Felipe Alonso; Domínguez-Viveros, Joel; Medellín-Cazares, Adán; Aguilar-Palma, Nelson; Jahuey-Martínez, Francisco Joel; Rodríguez-Almeida, Felipe Alonso

doi:10.22319/rmcp.v12i3.5771

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Revista mexicana de ciencias pecuarias

versión On-line ISSN 2448-6698versión impresa ISSN 2007-1124

Rev. mex. de cienc. pecuarias vol.12 no.3 Mérida jul./sep. 2021 Epub 14-Mar-2022

https://doi.org/10.22319/rmcp.v12i3.5771

Notas de investigación

Definición y análisis del panel de polimorfismos de nucleótido simple a utilizar en pruebas de paternidad para tres razas de bovinos

Joel Domínguez-Viveros^a^*

Adán Medellín-Cazares^a

Nelson Aguilar-Palma^a

Francisco Joel Jahuey-Martínez^a

Felipe Alonso Rodríguez-Almeida^a

^{^a} Universidad Autónoma de Chihuahua. Facultad de Zootecnia y Ecología. Periférico Francisco R. Almada km 1. 31453, Chihuahua, Chih. México.

Resumen

Con el objetivo de definir el panel de polimorfismos de nucleótido simple (SNP) para pruebas de paternidad en bovinos, se analizaron los genotipos en tres razas (número de SNP evaluados e individuos muestreados): Hereford (HER; 202; 1317), Brangus (BRA; 217; 3431) y Limousin (LIM; 151; 8205). Dentro de raza, se descartó los SNP con porcentaje de individuos genotipados (PIG) menor a 90 %, con desequilibrio Hardy Weinberg (HW; P<0.05), con frecuencia de alelo menor de 0.10 o menos y con desequilibrio de ligamiento, donde la correlación entre frecuencias genotípicas fue superior a 0.25. Se estimó los niveles de heterocigosis esperada (He) y observada (Ho), contenido de información polimórfica (CIP); así como, el índice de Shannon, el índice de fijación y tamaño efectivo de población (Ne). Se calculó la probabilidad de exclusión (PEC) y de identidad combinada (PIC). El panel final fue de 121, 188 y 113 SNP en HER, BRA y LIM, respectivamente; la principal fuente de descarte fue HW seguido de PIG. Los niveles de Ho y He fueron superior a 0.40; el PIC fue mayor a 0.32 y Ne presentó estimaciones por arriba de 181.3. Los resultados para la PEC fueron superiores a 0.999999; para la PIC, estuvieron por debajo de 1 x 10^-20.

Palabras clave Heterocigosis; Probabilidad de exclusión; Probabilidad de identidad; Polimorfismo; Índice Shannon

Abstract

In order to define the SNP panel for paternity tests in cattle, genotypes were analyzed in three breeds (number of SNPs evaluated and individuals sampled): Hereford (HER; 202; 1317), Brangus (BRA; 217; 3431) and Limousin (LIM; 151; 8205). Within breed, SNPs with a percentage of genotyped individuals (PGI) less than 90 %, with Hardy-Weinberg disequilibrium (HW; P<0.05), with allele frequency less than 0.10 or less and with linkage disequilibrium, where the correlation between genotypic frequencies was greater than 0.25, were discarded. The levels of expected (He) and observed (Ho) heterozygosity, polymorphic information content (PIC) were estimated; as well as the Shannon index, the fixation index and effective population size (Ne). The combined exclusion probability (CEP) and identity probability (CIP) were calculated. The final panel was 121, 188 and 113 SNPs in HER, BRA and LIM, respectively; the main source of discard was HW followed by PGI. Levels of Ho and He were above 0.40; CIP was greater than 0.32 and Ne presented estimates above 181.3. The results for CEP were higher than 0.999999; for CIP, they were below 1 x 10^-20.

Key words Heterozygosity; Exclusion probability; Identity probability; Polymorphism; Shannon Index

En México, las evaluaciones genéticas (EVGE) en bovinos para carne se realizan a partir de 2001; en torno a 25 razas, dispuestas en asociaciones nacionales de criadores de ganado registro, las EVGE conjugan la información genealógica y productiva contenida en los libros de registro¹. La información genealógica, que conforma el registro genealógico de pureza de raza o grados de pureza, define las relaciones de parentesco de toda la población a través del pedigrí de cada individuo. Errores en la veracidad e integridad del pedigrí tiene efectos en la certeza de la pureza racial; en la definición de ancestros fundadores y asignación de individuos a generaciones, así como en los cálculos de los niveles de consanguinidad y parentesco²^,³^,⁴. En las EVGE, errores en la información genealógica tiene consecuencias en la estimación de componentes de varianza y parámetros genéticos, así como en la predicción de valores genéticos y jerarquización de sementales; por consecuencia, también afecta la respuesta a la selección y progreso genético⁵^,⁶^,⁷^,⁸.

Los marcadores genéticos (MAGE) expresan el polimorfismo del ADN, su evolución y uso han fortalecido los programas de mejoramiento genético animal⁹^,¹⁰^,¹¹. En bovinos, las pruebas de paternidad han evolucionado con el desarrollo de los MAGE¹²; la Sociedad Internacional de Genética Animal (SIGA) inicialmente propuso un panel de 121 SNP (Polimorfismo de Nucleótido Simple) desarrollado en razas Bos taurus, posteriormente se agregaron 100 SNP derivados de razas Bos indicus¹³^,¹⁴. En México, las pruebas de paternidad se han implementado en las razas Brangus, Limousin y Hereford con base en el panel de SNP propuesto por la SIGA; no obstante, se requiere validar el panel de SNP a través de poblaciones, dado que la funcionalidad y veracidad de un MAGE en pruebas genéticas depende del equilibrio Hardy-Weinberg, el posible desequilibrio de ligamiento, el contenido de información polimórfica, entre otros componentes; además, en un conjunto de MAGE el poder de prueba es validado por la probabilidad de exclusión¹⁴^,¹⁵.

Al respecto, se han realizado estudios validando el panel de SNP desarrollado por la SIGA a utilizar en pruebas de paternidad de bovinos en Brasil¹⁶, Argentina¹⁷, China¹⁸^,¹⁹, Estados Unidos²⁰^,²¹, Japón²²^,²³ y Europa²⁴^,²⁵^,²⁶. Con base en lo anterior, los objetivos del presente estudio fueron validar el panel de SNP definido por la Sociedad Internacional de Genética Animal para pruebas genéticas en poblaciones de bovinos mexicanas.

Se analizaron los genotipos de SNP para bovinos: Brangus (BRA), Hereford (HER) y Limousin (LIM); en el Cuadro 1 se describe la base de datos analizada. En una primera edición se realizó un control de calidad de la base de datos; se verificó la información del individuo y de la muestra, así como conflicto mendeliano, genotipos duplicados e idénticos por estado. El panel evaluado en cada raza es un subconjunto del panel general propuesto por la SIGA; para LIM, el procesamiento de las muestras lo realizó el laboratorio Labogena con base en los SNP utilizados en Francia; para las otras razas, el proceso lo realizó el laboratorio Neogen GeneSeek con el conjunto de SNP utilizados en EU. Los análisis se desarrollaron dentro de raza en cuatro etapas.

Cuadro 1 Definición del panel de SNP por raza con base en los criterios de descarte

Raza	N	SNPn	PIG	HW	FAM	DL	SNPf
Herford	1,317	202	41	30	8	2	121
Brangus	3,431	217	2	19	2	6	188
Limousin	8,205	151	9	28	1	0	113

N= número de individuos muestreados. SNPn= número de SNP evaluados. PIG= número de SNP retirados por porcentaje de individuos con genotipos identificados menor a 90%. HW= número de SNP descartados por presentar desequilibrio Hardy Weinberg (P<0.05). FAM= número de SNP separados por frecuencia de alelo menor, menor a 0.10. DL= número de SNP descartados por desequilibrio de ligamiento, dado que la correlación entre frecuencias fue superior a 0.25. SNPf= total de SNP que conforman el panel por raza.

Valoración del porcentaje de individuos (call rate) con genotipo identificado (PIG); estimación de las frecuencias alélicas y genotípicas, así como el análisis de equilibrio Hardy Weinberg (HW).
Descartando los SNP con desequilibrio HW (P< 0.05) y PIG menor a 90 %, se analizó el posible desequilibrio de ligamiento (DL) con base en la correlación (r²) entre frecuencias genotípicas a través de SNP, se estimó la heterocigosis esperada (He) y observada (Ho), el contenido de información polimórfica (CIP), el índice de Shannon (IS) y el índice de fijación (FIS). Con la r² promedio y ajustada por el tamaño de muestra se estimó el tamaño efectivo de la población (Ne), con base en el planteamiento de Waples²⁷.
Se integró un panel de SNP por raza descartando los SNP con desequilibrio HW (p < 0.05), con frecuencia de alelo menor (FAM) igual o menor a 0.10, con DL²⁶ donde la r² fue superior a 0.25 y PIG menor a 0.90 %.
Con el subconjunto de SNP para cada raza, se ordenaron de forma descendente por CIP y se calculó la probabilidad de exclusión (PE) en tres modalidades²⁸^,²⁹^,³⁰: a) con un progenitor candidato y otro conocido, para excluir al progenitor candidato [PE1 = 1 - 2* $∑i=1npi2$ + $∑i=1npi3$ +2* $∑i=1npi4$ -3* $∑i=1npi5$ -2*( $∑i=1npi2$ )²+3* $∑i=1npi2$ * $∑i=1npi3$ ]; b) dado un progenitor candidato y la progenie, poder excluir la relación entre ellos [PE2 = 1 - 4* $∑i=1npi2$ +2*( $∑i=1npi2$ )²+4* $∑i=1npi3$ -3* $∑i=1npi4$ ]; y, c) con dos progenitores candidatos, exclusión de uno o ambos [PE3 =1+4* $∑i=1npi4$ -4 $∑i=1npi5$ -3* $∑i=1npi6$ - 8*( $∑i=1npi2$ )²+8*( $∑i=1npi2$ )*( $∑i=1npi3$ )+2*( $∑i=1npi3$ )². La probabilidad de exclusión combinada para cada situación fue (PEC = 1 - ((1 - PE_i). Además, se estimaron dos probabilidades de identidad (PI)³¹: la probabilidad de identidad de dos individuos tomados al azar, presenten genotipos idénticos [PI1 = $∑i=1npi4$ + $∑i=1n∑i=1n(2pipj)2$ ]; y, la probabilidad de identidad para dos hermanos completos, tomados al azar, presenten genotipos idénticos [PI2 = 0.25 + (0.5* $∑i=1npi2$ )+(0.5*( $∑i=1npi2$ )²)-(0.25* $∑i=1npi4$ )]. La probabilidad de identidad combinada (PIC) para cada situación, se calculó con el producto de las probabilidades de identidad de cada marcador. Los análisis se realizaron con los programas FSTAT³², LDNE³³ y GenAlex³⁴.

En el Cuadro 1 se resume el proceso de selección y descarte de SNP a través de raza, así como la estructura del panel final. El total de SNP retirados por raza, como porcentaje del total evaluados, fluctuó de 13.4 % (BRA) a 40.0 % (HER), donde la principal causa de descarte fue el desequilibrio HW (P<0.05). En el proceso de descarte de SNP no se observó una tendencia o asociación entre marcadores, el conjunto de SNP separado a través de razas fue diferente. El número final de SNP por raza fluctuó de 113 (LIM) a 188 (BRA), los cuales están dentro de los lineamientos de la SIGA¹³, la cual estipula que el panel por raza debe estar conformado por al menos 100 SNP.

En el Cuadro 2, se presentan los resultados para Ho, He, CIP, FIS y Ne. No se observan diferencias entre Ho y He, lo cual refleja que el conjunto de SNP seleccionado está en equilibrio HW. Para el IS, los resultados en las tres poblaciones fueron por debajo de la unidad, lo cual se puede asociar con homogeneidad en las poblaciones y se reduce la incertidumbre para predecir la probabilidad de asignación de un individuo a la población que pertenecerá. Para el FIS, todos los resultados tienden a cero, señalando una estabilidad en la relación de homocigotos y heterocigotos. Con las estimaciones del Ne, en el marco del equilibrio HW los incrementos esperados de consanguinidad (ΔF = 1 / 2Ne) por generación van del 0.08 al 0.27 %. Los niveles de He, Ho y CIP determinan si un marcador genético es o no informativo y su potencial de uso en estudios de variabilidad genética; no obstante, la jerarquización u ordenamiento de los SNP por la capacidad de uso puede ser diferente a través de poblaciones.

Cuadro 2 Indicadores de variabilidad genética (valores promedio) con base en el panel de SNP seleccionado para cada raza

Raza	Ho	He	CIP	IS	FIS	Ne
Herford	0.416	0.419	0.328	0.607	0.008	181.3
Brangus	0.433	0.434	0.337	0.623	0.002	246.9
Limousin	0.451	0.452	0.348	0.643	0.004	629.8

Heterocigosis observada (Ho) y esperada (He). CIP= contenido de información polimórfica. IS= Índice Shannon. FIS= índice de fijación. Ne= tamaño efectivo.

Con el total de SNP seleccionado en cada raza, los resultados para la PEC en las tres modalidades fueron superiores a 0.999999; para la PIC, estuvieron por debajo de 1 x 10^-39 y 1 x 10^-20 en PI1 y PI2, respectivamente. En el Cuadro 3 se describen los resultados para las formas alternas de PEC y PIC, parcialmente alcanzados con 50 SNP. Dado la estructura genética de las poblaciones y las fuerzas que inciden sobre la genética de poblaciones, la conformación y arreglo de un panel de SNP para verificar paternidad en bovinos puede tener diversas dimensiones y valores de probabilidad: Heaton et al²⁰ con un panel de 32 SNP a través de 17 razas, publicaron PEC superior a 0.994 y PIC de 1.9 x 10^-13; Van Eenennaam et al²¹ con 28 SNP, FAM superior a 0.40 en hatos comerciales, obtuvieron PEC de 0.956; Hara et al²⁹ con 29 SNP para una raza nativa de Japón reportaron PIC de 2.73 x 10^-12 y PEC de 0.96929 a 0.99693. En otros estudios afines, Werner et al²⁴ publicaron PEC superior a 0.9999 y PIC de 1 x 10^-13 con 37 SNP. Fernández et al¹⁷ en Angus con un arreglo de 116 SNP, reportaron probabilidades de no exclusión combinada (PNEC = 1 - PEC) en el intervalo de 2.1 x 10^-4 a 1.4 x 10^-9, así como PIC de 4.1 x 10^-15. Panetto et al¹⁶ para la raza Sindhi de Brasil, con 71 SNP donde la FAM fue superior a 0.35, publicaron PNEC de 1 x 10^-8. Zhang et al¹⁸ en ganado Simmental con 50 SNP y FAM superior a 0.40, reportaron PEC superior a 0.9989; Hu et al¹⁹ en bovinos cruzados de China, con 50 SNP donde el valor promedio de la FAM fue de 0.43, obtuvieron PEC de 0.99797 a 0.999999.

Cuadro 3 Valores de probabilidad de exclusión y de identidad, obtenidos con 50 SNP dentro del panel total seleccionado por raza

Raza	PEC1	PEC2	PEC3	SNPi	PIC1	PIC2
Hereford	0.99996	0.99831	0.99999	113	1.0E-21	8.2E-12
Brangus	0.99996	0.99861	0.99999	91	6.2E-22	5.7E-12
Limousin	0.99996	0.99849	0.99999	97	7.7E-22	6.6E-12

PEC1= probabilidad de exclusión combinada, con un progenitor candidato y otro conocido. PEC2= probabilidad de exclusión combinada, dado un progenitor candidato y la progenie. PEC3= probabilidad de exclusión combinada con dos progenitores candidatos. PIC1= probabilidad de identidad combinada para dos individuos tomados al azar. PIC2= probabilidad de identidad combinada, para dos hermanos completos tomados al azar. SNPi= número de SNP requeridos para obtener un valor superior a 0.999999 en las probabilidades de exclusión.

Para bovinos Brangus, Hereford y Limousin el número de SNP que conforma el panel para pruebas de paternidad fue superior a 100; seleccionados con base en los criterios asociados a variabilidad genética y estructura de la población, con valores de probabilidad de exclusión superior a 0.999999 y probabilidad de identidad por debajo a 6.6 x 10^-12.

Agradecimientos

Se agradece a la asociación Nacional de Criadores de Bovinos Brangus y Limousin; así como a la Hereford Mexicana, por proporcionar la base de datos del presente estudio. Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca para estudios de posgrado proporcionada.

Todos los autores declaran que no existe conflicto de interés alguno.

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Recibido: 17 de Agosto de 2020; Aprobado: 03 de Diciembre de 2020

^*Autor de correspondencia: joeldguezviveros@yahoo.com.mx; jodominguez@uach.mx

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