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Introducción
En México existe una superficie establecida de guayaba de 20 044 ha, con una producción de 406 000 t año-1 que generan una derrama económica de USD $144.41 mdd (Ramos-Sandoval et al., 2017). Aguascalientes se ubica en el segundo lugar de la producción en México, con una superficie establecida de 5 950 ha y una producción anual de 126 392 t con un valor comercial de USD $ 39.31 mdd (SIAP, 2025). El tipo de suelo en Calvillo, Aguascalientes, contribuye en la producción de guayabas dulces, esta ventaja, hace que preferentemente los consumidores demanden el fruto en todo el país (Ramirez et al., 2022).
En otro sentido, el establecimiento in vitro de los cultivos usando semillas ofrece ventajas como proporcionar plántulas que sirvan como fuente de explantes para llevar a cabo la micropropagación y la conservación de la variabilidad genética nativa, entre otras. En el establecimiento, las semillas ocupan de métodos físicos o químicos de escarificación.
Los métodos físicos se recomiendan para evitar usar sustancias tóxicas que contaminan el ambiente. La propagación in vitro es reportada como exitosa en árboles de importancia forestal, aumenta la tasa de germinación y reduce el tiempo en que ésta ocurre (Zurita-Valencia et al., 2014) y se realiza a partir de seleccionar un explante (meristemo apical) que se siembra en un medio de cultivo nutritivo para lograr una respuesta morfogénica y formar una planta completa a partir de un tejido u órgano (totipotencia celular).
La capacidad de las células vegetales para la regeneración de plantas se usa también para la conservación de germoplasma. Asimismo, la morfogénesis in vitro se divide en embriogénesis y organogénesis (Torres et al., 2023). Los sistemas de cultivo de tejidos in vitro son muy importantes en biotecnología vegetal. En el establecimiento in vitro se utilizan semillas para facilitar la etapa de asepsia y establecer los tejidos libres de hongos, virus y bacterias. También, la intensidad lumínica es vital para el desarrollo de los tejidos (Ruíz-Rivas et al., 2022).
La guayaba se ha propagado in vitro mediante organogénesis y embriogénesis somática, siendo el principal problema la oxidación fenólica en el establecimiento y la contaminación en la etapa de multiplicación; superando estas barreras los tejidos se pueden establecer para su propagación masiva (Domínguez-Perales et al., 2016). Mientras que, los bancos de germoplasma in vitro son útiles porque se usan para la conservación de los recursos fitogenéticos de interés, mediante la propagación de tejidos y semillas de las especies vegetales.
El propósito es tener y conservar la mayor diversidad genética y con el tiempo regenerar los genotipos deseados. La unidad de colección se mantiene en condiciones controladas, en espacios reducidos libres de contaminación por microorganismos patógenos (Sánchez-Chiang y Jiménez, 2010).
Aunado a lo anterior, el cultivo de crecimiento lento es de bajo costo y permite la preservación de brotes in vitro, debido a que disminuye su metabolismo y se reducen las tasas de crecimiento de los cultivos vegetales, los bancos de germoplasma in vitro sirven también para recuperar plantas amenazadas o en peligro de extinción, no todas las especies se pueden conservar por semilla, por lo que el cultivo de tejidos vegetales, es una opción muy importante para mantener este acervo genético durante largos periodos de tiempo para su conservación (Martínez, 2021).
La micropropagación se utiliza también para hacer estudios fisiológicos de rejuvenecimiento y envejecimiento para obtener plantas productivas o para la conservación (Pérez et al., 2002). La biotecnología vegetal mediante el cultivo de tejidos vegetales y los bancos de germoplasma in vitro contribuyen a la conservación de especies vegetales de gran importancia como la guayaba (Valdés-Infante et al., 2012). Por lo antes expuesto, se planteó como objetivo estandarizar una metodología para el establecimiento in vitro a partir de semillas de guayaba.
Materiales y métodos
Localización del experimento
El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Aplicada del Instituto Tecnológico El Llano Aguascalientes (ITEL) en El Llano, Aguascalientes, México, ubicado en el km 18 carretera Aguascalientes-San Luís Potosí, a los 21° 49’ 8.21” latitud norte, 102° 10’ 02.96” longitud oeste a 2 008 msnm (Google Earth, 2024).
Material vegetal
Se obtuvieron semillas de guayaba del tipo ‘Media China’ de 20 frutos maduros cosechados en un huerto comercial ubicado en San Tadeo, Calvillo, Aguascalientes a los 21° 55’ 13” latitud norte, 102° 42’ 09” longitud oeste a 1 699 msnm (Google Earth, 2024). La manipulación del material vegetal se realizó con pinzas y bisturís desinfectados previamente mediante inmersión en etanol al 100% y flameo con mechero.
Caracterización del trabajo de investigación
La estructura metodológica se dividió en dos experimentos con tres etapas.
Asepsia y control de la contaminación
Se utilizó un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos y 10 repeticiones, la unidad experimental fue un frasco de 250 ml con 10 semillas con medio MS (Murashige y Skoog, 1962). Los tratamientos fueron: T1) tween( (polisorbato) 20 al 0.1% + cloro al 5% + etanol al 50%; T2) mycrodyn( (plata ionizada) + cloro al 5% + etanol al 70%; T3) tween( 20 al 0.1% + fractal( (extracto de semillas de cítricos) 6 ml L-1 + cloro al 5% y etanol al 70% y T4) testigo sin aplicación.
El registro de datos se realizó a los 30 días después de establecer el experimento. La variable de estudio fue: el porcentaje de asepsia (%), para lo cual se tomaron en cuenta el número de frascos no contaminados. Los frascos que presentaron hongos como Aspergillus sp. y Alternaria sp. y bacterias como Pseudomonas sp., se asignaron como contaminados. Para los análisis de datos se usó el paquete estadístico Statistica Version 13.3 (TIBCO Inc, 2017), para el análisis de varianza (Anova) y la prueba de Tukey al 5% para la comparación de medias.
Escarificación física de las semillas
La escarificación es un proceso físico o químico que rompa, raye, altere mecánicamente o ablande las cubiertas de las semillas, para hacerlas permeables y facilitar su germinación. Esta parte se realizó con un procedimiento físico inmediatamente después de la etapa de asepsia. Se utilizó un cortador de uñas estéril para eliminar la testa de cada semilla en una campana de flujo laminar para evitar su contaminación. Se utilizó agua destilada estéril para realizar enjuagues y sanitas de papel estériles para secar las semillas.
Segundo experimento
Establecimiento in vitro
Se empleó un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos y 10 repeticiones, la unidad experimental fue un frasco con seis semillas de guayaba con medio MS. Los tratamientos fueron: T1) testigo-semillas sin escarificar; T2) semilla escarificada; T3) semilla sin escarificar con carbón activado 2 g L-1 y T4) semilla escarificada con carbón activado 2 g L-1. El medio de cultivo MS fue suplementado con 0.5 mg L-1 Bencilaminopurina (BAP), 30 g L-1 de sacarosa y 7.5 g L-1 de agar-agar. Las condiciones del cuarto de incubación fueron: temperatura 25 (2 °C, con fotoperiodo de 16 h luz y 8 horas oscuridad y una intensidad lumínica de 2 000 lux.
Las variables evaluadas fueron: 1) porcentaje de germinación (%) y 2) longitud de brotes (cm), la medición se realizó los 45 días posteriores a la siembra, se tomó como semilla germinada la emergencia a una longitud de 2 mm de la radícula. Para el análisis de los datos de este experimento se realizó la prueba de Anova y la de comparación de medias Tukey (p≤ 0.05) con apoyo del paquete estadístico Statistica Version 13.3 (TIBCO Inc, 2017).
Resultados y discusión
Primer experimento
Asepsia y control de la contaminación
En esta variable se observaron diferencias estadísticamente significativas Andeva (p≤ 0.05) en los tratamientos evaluados para la desinfección de las semillas de guayaba. Los mejores resultados (Tukey p≤ 0.05) se presentaron en el tratamiento T3 (sin contaminación por patógenos), mientras que en el T4 todos los frascos resultaron contaminados (Figura 1), lo que corrobora que la parte de asepsia es fundamental para establecer los cultivos in vitro para su regeneración masiva en condiciones controladas, como fotoperiodo y temperatura.
Figura 1 Resultados de la comparación de medias Tukey (p≤ 0.05) del primer experimento (asepsia). Medias con la misma letra son estadísticamente iguales, n= 10 (Tukey, p( 0.05); DHS= 0.024; T1 tween 20 (0.1%) + cloro 5% + etanol 50%; T2 microdyn + cloro 5% + etanol 70%; T3 tween 20 (0.1%) + fractal® 6 mL L-1 + cloro 5% + etanol 70%; T4 testigo sin aplicación.
Al respecto, varios trabajos previos de investigación de propagación in vitro de guayaba concluyen que la etapa crítica a superar es obtener material aséptico para su establecimiento en el laboratorio (Ocampo y Núñez, 2007). Continuando con el T3, el fractal( (extracto de cítricos, líquido soluble en agua) actúo como bactericida y fungicida, funcionó como un desinfectante orgánico de amplio espectro de acción germicida en el experimento. Se caracteriza por ser biodegradable, con registro de desarrollo a resistencia, está recomendado en la prevención y tratamiento de enfermedades foliares en diversas plantas cultivadas (Berni Labs, 2025).
La concentración de cloro (hipoclorito de sodio al 5%) durante 15 min para el control de la contaminación de los explantes, es también muy efectivo, como reportan los resultados de esta investigación y coinciden con lo reportado por diversos autores (Ramírez y Salazar, 1997; Casanova et al., 2019). Otros autores utilizan sustancias más agresivas para el proceso de desinfección, como el bicloruro de mercurio que es tóxico para el humano y para el ambiente (Concepción et al., 2004).
Escarificación física de las semillas
Los resultados del proceso de escarificación física se observan en la Figura 2a para las semillas de guayaba escarificada (sin testa) y en la Figura 2b se muestra semillas sin ningún tipo de escarificación (con testa).
Otras investigaciones como la de Zurita-Valencia et al. (2014), localizaron durante el proceso de escarificación de semillas de Tilia mexicana Schlecht. (cirimo) emplearon métodos físicos como tratamientos con temperatura y métodos químicos como el uso de ácido clorhídrico (HCI) al 10%, utilizando el etanol al 70%, agua oxigenada al 3% y cloro 2.4% para su desinfección. Asimismo, Sánchez-Soto et al. (2017) aseguran que la escarificación es una técnica empleada en agricultura para tener un alto porcentaje de germinación en menor tiempo.
Mientras que para Martin (2017), el uso de técnicas para regenerar plantas mediante la clonación del material vegetal para crioconservación y conservación, entre otros, es fundamental en biotecnología para disponer de las plantas para investigación y su reproducción masiva. De lo anterior, se deduce que el cultivo de tejidos in vitro es una herramienta que aumenta el porcentaje de germinación mediante el uso de semillas, con técnicas como la escarificación para la propagación masiva de especies de interés y se emplea para incrementar la germinación y evitar la escarificación química donde se utilizan sustancias tóxicas como ácido sulfúrico.
Segundo experimento
Establecimiento in vitro
En los resultados del Andeva (p≤ 0.05) se detectaron diferencias significativas en todos los tratamientos en las dos variables registradas.
En la prueba de medias Tukey (p≤ 0.05) los resultados de la respuesta de las semillas al cultivo in vitro en mostraron para el tratamiento T1 un menor porcentaje de germinación y de longitud de brotes (Figura 3 y 4).
Figura 3 Respuesta de las semillas de guayaba (Tukey, p≤ 0.05) en la etapa de establecimiento in vitro a germinación (%). Medias con la misma literal son estadística mente iguales, n= 10 (Tukey, p( 0.05); DHS= 3.721; T1) semilla sin escarificar; T2) semilla escarificada; T3) semilla sin escarificar + carbón activado 2 g L-1; T4) semilla escarificada + carbón activado 2 g L-1.
Figura 4 Respuesta de las semillas de guayaba (Tukey, p≤ 0.05) en la etapa de establecimiento in vitro a longitud de brotes hipócotilo (cm). Medias con la misma literal son estadística mente iguales, n= 10 (Tukey, p( 0.05); DHS= 3.721; T1) semilla sin escarificar; T2) semilla escarificada; T3) semilla sin escarificar + carbón activado 2 g L-1; T4) Semilla escarificada + carbón activado 2 g L-1.
En contraste con el T1, el T4 presentó la mejor germinación y la mayor longitud de brotes. En la etapa de establecimiento in vitro se obtuvo 90% de germinación con una longitud del tallo de 4.05 cm en un medio de cultivo MS suplementado con 2 g L-1 de carbón activado. Asimismo, Flores et al. (2017) reportaron es su estudio de germinación in vitro de semillas, después de los 60 días 90% de germinación en medio MS, sin carbón activado y en total oscuridad. Otro aspecto muy importante son las adiciones de hormonas, Cabral-Miramontes et al. (2022) afirman que los reguladores de crecimiento y la elección del medio de cultivo para cada especie, sirven para estandarizar la metodología de propagación in vitro y juegan un papel muy importante en el proceso, mientras que Pérez et al. (2002) señalan que el regulador apropiado para la multiplicación in vitro de brotes de guayaba provenientes de semillas, es el regulador BAP a concentraciones que van de 0.5 a 1 mg L-1. En esta investigación se utilizó la concentración de 0.5 mg L-1 de BAP.
Se presenta finalmente un protocolo estandarizado, paso por paso, para el establecimiento aséptico y la propagación in vitro, para la conservación de plantas de guayaba a partir de semillas escarificadas (Cuadro 1).
Cuadro 1 Protocolo estandarizado para el establecimiento in vitro de semillas de guayaba para su propagación.
| Metodología para el establecimiento in vitro de semillas de guayaba | |
|---|---|
| 1 | Colecta de los frutos para la obtención de semillas |
| 2 | Partir el fruto de guayaba para extraer las semillas, realizar enjuagues con agua de la llave y colocar de una por una en un papel absorbente y dejar secar por dos días |
| 3 | Se cepillan una a una las semillas y se realizan enjuagues con agua estéril y se dejan secar en un papel por 1 día |
| 4 | Las semillas se lavan con tween 20( al 0.1 % y se dejan en agitación por 10 min. Se realizan tres enjuagues con agua estéril |
| 5 | Las semillas se dejan en agitación con fractal( 6 ml L-1 por 1 h. Se realizan tres enjuagues con agua estéril |
| 6 | Las semillas se colocan en cloro al 5% en agitación por 15 min. Se realizan tres enjuagues con agua estéril |
| 7 | Las semillas se colocan en etanol al 70% en agitación por 5 min. Se realizan tres enjuagues con agua estéril |
| 8 | Las semillas se dejan secando en una servilleta estéril en la campana de flujo laminar por 5 min |
| 9 | Se realiza la escarificación de cada semilla con el uso de una pinza y un corta uñas, ambos estériles, en la campana de flujo laminar |
| 10 | Se establecen in vitro las semillas de guayaba para su germinación en medio de cultivo MS suplementado con 2 g L-1 de carbón activado, 0.5 mg L-1 de BAP y 7.5 g L-1 de agar-agar |
Los bancos de germoplasma in vitro tienen como objetivo la conservación por tiempo indefinido de tejidos vegetales vivos que se mantienen en condiciones controladas (luz y temperatura). Se han desarrollado sistemas de crecimiento retardado para prolongar los periodos de subcultivos. Esta técnica de conservación in vitro es eficiente para varias especies, incluida la guayaba. Los tejidos almacenados en condiciones de crecimiento retardado se pueden transferir a medios de regeneración y así obtener la cantidad de plantas requeridas para contar con una fuente de material vegetal, sin necesidad de recurrir a recolectar ejemplares silvestres, y así se ayuda a la conservación de las especies y el germoplasma nativo (Pérez et al., 2012).
