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Introducción
La familia Orchidaceae es una de las más importantes de México superada sólo por la familia Asteraceae y Fabaceae (Villaseñor, 2016). México ocupa el décimo primer lugar a nivel mundial en riqueza de orquídeas silvestres (Hágsater et al., 2005), con alrededor de 1 315 especies (Soto et al., 2007; Solano et al., 2019).
A nivel de entidades federativas, Oaxaca y Chiapas ocupan los primeros lugares en diversidad de orquídeas, ambos con más de 700 especies (Solano et al., 2019), Veracruz está en tercer lugar con 432 taxa (421 especies, 4 variedades, 2 híbridos y 5 subespecies) que representan el 32% de las orquídeas del país.
Laelia es un género de orquídeas en su mayoría epífitas, por lo que se encuentran viviendo sobre los árboles, en México se han clasificado 12 especies y 2 subespecies; una de ellas es Laelia autumnalis, nativa de México, cuyas poblaciones silvestres han estado sujetas al cambio en el uso del suelo y extracción masiva e ilegal de plantas en etapa reproductiva, para satisfacer la demanda de los mercados.
De seguir con esta actividad, pronto formará parte de la lista de especies amenazadas (Hernández et al., 2013). Debido a la magnitud de la extracción de las plantas de esta especie que, en la actualización de la NOM-059-SEMARNAT-2010, aparece en la categoría de protección especial (Pr) (DOF, 2019).
Las orquídeas son especies de difícil reproducción natural porque sus semillas diminutas tienen escasa o nula reserva de nutrientes y requieren de la simbiosis con hongos micorrizogénos para su germinación, los cuales no siempre están presentes debido a la perturbación de su hábitat. Además, no todas las semillas de una cápsula se forman por completo o son fértiles (Verma et al., 2014).
Estas plantas destacan por su belleza y formas atractivas; sin embargo, es una de las familias más afectadas por las actividades antropocéntricas, saqueo y comercio ilegal (Castillo-Pérez et al., 2018). Las técnicas de cultivo in vitro han contribuido a mejorar la propagación de orquídeas a partir de semillas, tanto en especies nativas como en híbridos.
En el género Laelia se ha logrado la germinación in vitro en L. speciosa usando el medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) al 50 y 100% de sus componentes (Murashige y Skoog, 1962) y el medio Knudson C (KC) al 50 y 100% de sus componentes (Knudson, 1946) (Aguilar y López Escamilla, 2013), L. anceps ssp. Dawsonii, en la cual se logró la formación de embriones somáticos utilizando medios de cultivo Knudson C (1946) (KC) y Vacin y Went (1949) (VW); Murashige y Skoog (1962) (MS); (Lee et al., 2010) y en L. eyermaniana, donde se observó el desarrollo morfológico desde la germinación hasta la aclimatación ex vitro en medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) al 50% (Francisco et al., 2011).
Para la germinación de semillas de orquídeas se reportan algunos medios de uso generalizado como Knudson C (1946); Vacin y Went (1949); Murashige y Skoog (1962); Dalla Rosa y Laneri, (1977); (Dutra et al., 2009; De Menezes et al., 2016). La principal diferencia en estos es la composición de minerales, el más simple es Knudson C y el más rico en nutrientes es el Murashige y Skoog que incluye macro y microelementos; este último es el más utilizado para el cultivo de orquídeas, Lallana et al. (2020), señalan que el MS al 50% ha dado buen resultado para los géneros más comunes.
La composición del medio de cultivo es uno de los factores que determinan el éxito para generar y propagar plántulas, todo medio está compuesto básicamente de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, aminoácidos y una fuente de carbono (De Menezes et al., 2016). Por lo tanto, la composición de los medios de cultivo puede variar en contenido de sales (macro y microelementos), azúcares, compuestos orgánicos y gelificantes. Los requerimientos para orquídeas pueden ser diversos, incluso en especies del mismo género (Mayo et al., 2010).
Con base en la importancia de esta especie de orquídea y la situación que tiene en su hábitat, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la germinación in vitro de semillas de Laelia autumnalis en ocho medios de cultivo, así como el crecimiento inicial de las plántulas, para determinar el más adecuado para esta especie.
Materiales y métodos
Esta investigación se realizó en el laboratorio de Propagación Vegetal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Cuernavaca, Morelos México, durante los meses de septiembre de 2023 a enero de 2024.
Material biológico
Las cápsulas de L. autumnalis, fueron colectadas de plantas en cultivo de un productor particular de Tepoztlán, Morelos, México. Las semillas se secaron a temperatura Ambiente (29 °C) y se almacenaron en tubos de plástico herméticos y se mantuvieron en refrigerador a 5 °C, durante 20 días.
Medios de cultivo
Se usaron las sales minerales de ocho medios de cultivo de uso común para la germinación de semillas de orquídeas, Murashige y Skoog (1962), en cuatro concentraciones, 25 (MS25), 50 (MS50), 75 (MS75) y 100% (MS100) de concentración de macro y micronutrientes, Knudson C (1946) (KC); (DRL); Vacin y Went (1949) (VW); Lindemann (1970) (L); Dalla Rosa y Laneri (1977) (Cuadro 1).
Cuadro 1 Formulación de los medios de cultivo, empleados en el cultivo in vitro de orquídeas, de acuerdo con Mayo et al. (2007).
| Compuesto (mg L-1) | Murashige y Skoog (1962) | Knudson C (1946) | Vacint y Went (1949) | Lindemann (1970) | Dalla Rosa y Laneri (1977) |
|---|---|---|---|---|---|
| NH4NO3 | 1 650 | ||||
| KNO3 | 1 900 | 525 | |||
| CaCl2 2H2O | 332.2 | 1000 | |||
| MgSO4 | 370 | 250 | 122.1 | 58.62 | 250 |
| KH2PO4 | 170 | 250 | 250 | 135 | 250 |
| (NH4)2 SO4 | 500 | 500 | 1 000 | 500 | |
| Ca(NO3)2 4H2O | 1 000 | 347.2 | |||
| H3BO3 | 6.2 | 1.014 | |||
| MnSO4 4H2O | 22.3 | 5.682 | 5.68 | 0.05 | 7.5 |
| ZnSO4 7H2O | 8.6 | 0.565 | |||
| Na2 MoO4 | 0.25 | ||||
| CuSO4 5H2O | 0.025 | 0.019 | |||
| CoCl2 6H2O | 0.025 | ||||
| Kl | 0.83 | 0.099 | |||
| FeSO4 7H2O | 27.85 | 25 | 27.85 | ||
| Na2EDTA 2H2O | 37.27 | 1 050 | 37.25 | ||
| Tartrato férrico | 28 | ||||
| Fosfato de calcio tribásico | 200 | ||||
| Cloruro de níquel | 0.03 | ||||
| Citrato férrico | 4.4 |
Todos los medios se suplementaron con 0.5 mg L-1 de tiamina HCl, 100 mg L-1 de mioinositol y 3% de sacarosa, el pH de los medios se ajustó a 5.7. Se agregó 0.7% de agar. El medio se dosificó en frascos de 150 ml, colocando 15 ml de medio de cultivo y se esterilizó durante 18 min a 121 °C y 15 lb de presión.
Desinfección de semillas
Antes de la siembra, las semillas de L. autumnalis se desinfectaron en la campana de flujo laminar, se usó el método de la jeringuilla, esto consistió en colocar un pedazo de algodón en la boquilla de una jeringa de 20 ml, las semillas se pusieron dentro de la jeringa y se agregó la solución desinfectante con hipoclorito de sodio (NaClO) al 0.3% y agua destilada esterilizada, posteriormente se colocó el embolo y se agitó de arriba hacia abajo durante 5 min, se realizaron tres enjuagues con agua destilada esterilizada, finalmente, se añadieron 20 ml de agua destilada estéril en la jeringa, para mantener las semillas suspendidas.
Siembra
En cada uno de los frascos con medio de cultivo se dispensaron 250 µl de agua con aproximadamente 250 semillas suspendidas, mismas que fueron contadas con un hemocitómetro. Los frascos se taparon y se sellaron con plástico adherente, por último, se colocaron en el área de incubación en condiciones controladas con fotoperiodo de 16 h luz y 8 de obscuridad a 24 ±1 °C e intensidad luminosa de 32 μE m-2 s-1.
Diseño experimental
Se uso un diseño completamente al azar con 10 repeticiones por tratamiento, para evaluar la germinación de semillas y crecimiento de plántulas (10 plántulas por repetición). Cada repetición fue un frasco de cultivo.
Variables evaluadas y análisis estadístico
Germinación de semillas
Se evaluaron dos variables de germinación, el inicio de germinación se consideró una vez que la semilla presentó rompimiento de la testa, también se determinó el porcentaje de germinación, se realizó conteo de las semillas germinadas un mes después de la siembra, en cuatro campos por repetición, para ello se utilizó un microscopio estereoscópico.
Crecimiento de plántulas
Se tomaron 10 plántulas por repetición para evaluar el crecimiento, se midió la altura (mm), desde la base hasta la parte donde se abren las hojas; longitud de hoja (mm), se midió desde la base hasta la punta de la hoja; longitud de raíces (mm), se midió desde la base hasta la punta de la raíz, estas tres variables se midieron con hoja milimétrica; número de hojas y número de raíces, mediante conteo; también se midió diámetro de protocormo (mm). Los datos obtenidos se estudiaron mediante análisis de varianza (Anova), en las variables donde hubo efecto de los tratamientos, se efectuó la prueba de comparación de medias Tukey (p≤ 0.05), con el paquete estadístico SAS v. 9.2 (SAS, 2023).
Resultados y discusión
Germinación de semillas
El análisis de varianza para inicio de germinación y germinación total indicó que hubo efecto altamente significativo de los medios de cultivo (p≤ 0.01). Los valores de R² fueron de 0.96 y 0.88, indicando que el modelo estadístico usado para el análisis de varianza fue adecuado (Cuadro 2).
Cuadro 2 Cuadrados medios del análisis de varianza para inicio de germinación y germinación total en ocho medios de cultivo in vitro de L. autumnalis.
| Fuente de variación | GL | Inicio de germinación (días) | Germinación total (%) |
|---|---|---|---|
| Medios de cultivo | 7 | 365.53** | 3 328.79** |
| Error | 72 | 1.44 | 93.61 |
| R² | 0.96 | 0.88 | |
| CV (%) | 3.49 | 24 | |
| Promedio | 34.37 | 40.31 |
GL= grados de libertad; CV= coeficiente de variación; R²= coeficiente de determinación, **= efecto altamente significativo (p≤ 0.01).
La germinación de las semillas se observó a simple vista cuando cambio de color crema a estructuras de color verde y el tamaño del embrión aumento, posteriormente el embrión rompió la testa, esto se pudo observar mediante un microscopio. Este proceso varió en función de los medios de cultivo; las semillas iniciaron la germinación en menor tiempo en los medios MS al 25, 50, 75% y KC (a los 29 días), mientras que en los medios MS al 100%, DRL, VW y L, ocurrió después de los 35 días, en el DRL tardó 14 días más (Figura 1).
Figura 1 Inicio de germinación de semillas de L. autumnalis por efecto de ocho medios de cultivo. DMSH= 1.67.
En esta especie la germinación de las semillas fue un poco más lenta en comparación con lo reportado por Aguilar y López Escamilla (2013) para Laelia especiosa, las que germinaron en 10 y 16 días en los medios MS al 50 y 100%; sin embargo, indican que en los medios KC al 50 y 100% la germinación se presentó a los 114 y 178 días respectivamente. Lo anterior indica que la germinación de semillas de orquídea varía en función del medio de cultivo y especie.
El porcentaje de semillas germinadas de L. autumnalis fue mayor cuando se usaron los macro y micronutrientes del medio MS al 25 y 50% de concentración, sin diferencias estadísticas entre ambos medios de cultivo (84.57 y 78.63%, respectivamente), la tendencia fue a disminuir la germinación conforme aumentó la concentración de sales del medio MS, esto debido a que hubo mayor disponibilidad de agua para que ocurriera el proceso, pues como señalan Martínez-Villegas et al. (2015), al aumentar las sales, el potencial osmótico se hace más negativo.
En los medios VW, KC, y MS al 75% la germinación varió de 28.41 a 47.71%. Los medios donde hubo menor germinación fueron MS al 100%, DRL y L, que presentaron 59.59, 64.59 y MS 71.33% menor germinación que la obtenida con el medio MS al 25% de concentración (Figura 2).
Figura 2 Efecto de los medios de cultivo en la germinación total de semillas de L. autumnalis. DMSH= 19.82.
Posterior al cambio en el color verde, en las semillas se formaron los pequeños protocormos, a partir de los cuales se observó la primera hoja pequeña. También el crecimiento se manifestó con la emisión de nuevas hojas, el incremento en altura y grosor de tallos, y el crecimiento del rizoide, formando de esta manera una plántula. Las semillas que germinaron en el medio MS al 25% generaron plántulas de color verde amarillento indicando deficiencia de nutrientes debido a la baja concentración de macro y micronutrientes.
Crecimiento de plántulas
Las semillas germinadas en los medios Vacin y Went (1949) y Lindemann (1970) no generaron plántulas, por lo cual fueron excluidos en los resultados de crecimiento. El análisis de varianza para las variables de crecimiento altura de plántula, longitud de hoja, número de hojas, número de raíces, longitud de raíces y diámetro de pseudobulbos mostró que la composición de los medios de cultivo tuvo efecto altamente significativo (p≤ 0.01).
Los coeficientes de variación fueron de 18.13 a 22.42, los valores de R² fueron de 0.88 a 0.94 (Cuadro 3), indicando que el modelo estadístico usado para el análisis de varianza fue el adecuado. La altura de las plántulas fue mayor en los medios MS en concentraciones de 25 a 75%, en contraste, la altura fue menor cuando se usó cualquiera de los otros medios. La longitud de hojas fue mayor en los medios MS al 50 y 75%, los medios de cultivo que propiciaron menor crecimiento fueron MS al 100% y KC.
Cuadro 3 Cuadrados medios del análisis de varianza para las variables de crecimiento in vitro de plántulas de L. autumnalis, a los tres meses después de la siembra.
| FV | GL | AP | LH | NH | NR | LR | DP |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Medios de cultivo 5 | 51.46** | 33.25** | 16.53** | 2.53** | 51.14** | 3.64** | |
| Error | 54 | 0.64 | 0.27 | 0.13 | 0.02 | 0.26 | 0.04 |
| R² | 0.88 | 0.92 | 0.92 | 0.89 | 0.94 | 0.89 | |
| CV (%) | 22.42 | 18.31 | 18.13 | 22.22 | 18.51 | 21.41 | |
| Promedio | 3.57 | 2.86 | 2.05 | 0.76 | 2.79 | 0.96 |
GL= grados de libertad; CV= coeficiente de variación; R²= coeficiente de determinación; **= efecto altamente significativo (p≤ 0.01). AP= altura de plántula; LH= longitud de hoja, NH: Número de hojas; NR= número de raíces; LR= longitud de raíces; DP= diámetro de pseudobulbos. N= 100 plántulas por tratamiento.
El número de hojas por plántula también se vio afectado por el medio de cultivo, las plántulas que crecieron en el medio DRL tuvieron mayor número de hojas (3.03 mm por plántula), estadísticamente diferentes solo con las plántulas que crecieron en el medio MS al 25%, que tuvo el menor número.
El diámetro de pseudobulbos, fue estadísticamente igual con la mayoría de los medios, con excepción de las plántulas que crecieron en el medio MS al 25%, donde se presentaron los valores más bajos (Cuadro 4). La cantidad promedio de raíces por plántula varió de 0.75 a 1.24. Los medios KC, MS75 y MS50% fueron estadísticamente iguales, con mayor promedio de raíces (Figura 3). El menor número de estos órganos se presentó en el medio MS100%. La longitud de raíces fue mayor en el medio MS al 50%, sin diferencia estadística con los medios KC y MS al 25%, el medio MS al 100% presentó los valores más bajos (Table 4).
Cuadro 4 Efecto de los medios de cultivo sobre variables de crecimiento de plántulas de L. autumnalis, a los tres meses después de la siembra.
| Medio de cultivo (%) | Altura de plántula (mm) | Longitud de hojas (mm) | Hojas (núm.) | Diámetro de protocormo (mm) | Longitud de raíz (mm) |
|---|---|---|---|---|---|
| MS25 | 4.79 a | 3.77 bc | 2.31 b | 1.09 b | 4.64 a |
| MS50 | 5.6 a | 4.54 a | 2.87 a | 1.3 ab | 5.2 a |
| MS75 | 5.32 a | 4.33 ab | 2.92 a | 1.3 ab | 3.89 b |
| MS100 | 4.04 b | 3.14 c | 2.75 ab | 1.49 a | 0.66 d |
| KC | 4.13 b | 3.4 c | 2.52 ab | 1.21 ab | 5.08 a |
| DRL | 4.71 ab | 3.7 bc | 3.03 a | 1.29 ab | 2.89 c |
| DMSH (p≤ 0.05) 1.12 | 0.73 | 0.52 | 0.29 | 0.72 | |
DMSH= medias con la misma letra en cada columna son iguales estadísticamente, de acuerdo con la prueba de Tukey (p≤ 0.05). N= 100 plántulas por tratamiento.
Figura 3 Efecto de los medios de cultivo en el número de raíces de L. autumnalis , a los tres meses después de la siembra. DMSH= 0.23.
El análisis general de los resultados obtenidos para las diversas variables permite señalar que, para la germinación de in vitro de semillas de L. autumnalis los medios de cultivo MS 25, 50 y 75% y el medio KC fue donde la germinación inició en menor tiempo; aunque, el porcentaje total fue mayor en los medios MS al 25 y 50%. Con respecto al crecimiento de plántulas, la mayoría de las variables indican que fue mejor y similar en los medios MS al 25, 50 y 75%.
Sin embargo, las plántulas fueron de color verde en el medio MS al 50%, en contraste, las plántulas que crecieron en los medios MS al 25 y 75%, después de los 107 días comenzaron a mostrar color violeta o rojizo. Por lo tanto, se considera que el mejor medio de cultivo para germinación y crecimiento de plántulas de L. autumnalis fue MS al 50% de concentración de nutrientes. Dalzotto (2013) reportó que la altura de planta, número de raíces y materia seca de Oncidium biflolium fueron mayores en el medio MS 50%, lo que coincide con lo obtenido en la presente investigación.
El medio Murashige y Skoog (1962) se ha utilizado en la germinación de varias especies de orquídeas en diferentes proporciones y suplementados con reguladores de crecimiento y otras sustancias. Los resultados obtenidos en el inicio de germinación y germinación total de esta investigación pudieron deberse a que el medio Murashige y Skoog contiene los macronutrientes y micronutrientes necesarios, en comparación con los demás medios.
El estudio de Aguilar y López Escamilla (2013) usaron semillas de L. speciosa y reportaron que la germinación fue a los 10 días después de la siembra en medio MS al 50% y a los 16 días en medio MS al 100%, en ambos casos la germinación fue 100%, lo anterior coincide con los resultados obtenidos en este trabajo, ya que el medio MS al 50% fue el mejor para la germinación de semillas de L. autumnalis.
Datos de Hernández et al. (2017) utilizaron cápsulas de Laelia autumnalis las cuales fueron irradiadas con rayos gama y posteriormente fueron cultivadas en medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) y observaron que el proceso de imbibición se presentó entre los 5 y 40 días y la formación de protocormos fotosintéticos inicio a los 10 días y concluyó hasta los 60 días.
Hallazgos de Francisco et al. (2011) no reportaron los días a germinación de Laelia eyermaniana; sin embrago, el medio de cultivo que utilizaron para germinar las semillas fue el Murashige y Skoog al 50%. Jara et al. (2007) utilizaron los medios MS al 50 y 100%, KC y medio Morel, para la germinación de Chloraea virescens, Chloraea lamellata y Gavilea aeaucana y reportan que el medio MS 50% dio los mejores resultados.
La investigación de Ávila et al. (2009) germinaron semillas de Laelia speciosa usando los medios Murashige y Skoog (1962) al 100 y 50% y el medio Knudson C (KC) adicionados con sacarosa, reportan que los medios MS al 100 y 50% generaron la mejor respuesta en el establecimiento de semillas para esta especie, ya que las primeras etapas de desarrollo fueron mejores en el medio MS en comparación al medio KC.
En cuanto a altura de plántula, longitud de hoja, número de hojas, longitud de raíces, número de raíces, longitud de raíces y diámetro de pseudobulbos se observó que el medio MS al 25% no fue adecuado para el crecimiento de las plántulas. Es importante que los medios de cultivo tengan la cantidad de nutrientes adecuada, para que las plántulas no presenten deficiencia nutrimental y tengan mejor desarrollo, como ocurrió en el medio MS al 25% (Figura 4.)
Los medios Vacin y Went (1949); Lindemann (1970) fueron los menos adecuados para la germinación de L. autumnalis ya que tardaron más tiempo en germinar; así como, en el porcentaje de germinación donde presentaron los valores más bajos en comparación con los demás medios; por otra parte, las semillas se fueron muriendo conforme pasó el tiempo, por lo que no hubo crecimiento de plántulas.
Conclusiones
Con base en los resultados de este trabajo, la germinación in vitro de semillas de L. autumnalis fue mejor en los medios de cultivo MS 25 al 50% ya que el inicio de germinación fue en menor tiempo y en mayor porcentaje. El crecimiento de plántulas fue mejor en el medio MS al 50% en el cual las plántulas fueron de color verde. Por lo tanto, el mejor medio de cultivo para germinación y crecimiento de plántulas de L. autumnalis fue el MS al 50% de concentración de nutrientes.
