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Introducción
La domesticación de las plantas es el resultado de la selección humana, cambios en el ambiente y prácticas de manejo que impulsaron cambios fenotípicos, principalmente en las características seleccionadas y reproductivas, pero también fisiológicos y anatómicos resultados de ser cultivadas (Roucou et al., 2018). Las características seleccionadas están enfocadas a cubrir las necesidades humanas, pero también existe la adaptación de la planta al ambiente que le permiten sobrevivir bajo cultivo y que son similares entre especies cultivadas ‘síndrome de domesticación’ (Allaby, 2020).
La domesticación de Phaseolus vulgaris L. incluyó cambios en el tamaño de la semilla, y en la forma y metabolismo de la planta, entre otros (Smýkal et al., 2018). En México, el mejoramiento genético de P. vulgaris se ha centrado en el tamaño y contenido de proteínas y carbohidratos no estructurales de la semilla (Allende-Arrarás et al., 2006).
El peso de semilla de P. vulgaris silvestre varía de 0.04 a 0.14 g y el domesticado de 0.2 a 1 g (Lépiz-Ildefonso et al., 2010). Las semillas del frijol almacenan carbohidratos para usarse en la germinación y asegurar la sobrevivencia de la plántula, el almidón representa del 25 al 45% de la masa seca (Punia et al., 2020) y es la reserva principal de la semilla. La formación de una semilla y su transición a una plántula activa genes para la formación del embrión, la maduración de la semilla, y su tolerancia a la desecación; asimismo, involucra el uso de las reservas, pieza clave en el éxito evolutivo de las plantas (Carbonero et al., 2017).
Las plantas silvestres y domesticadas del frijol tienen patrones diferentes de crecimiento inicial como consecuencia indirecta de la selección de semillas más grandes durante la domesticación; sin embargo, poco se ha estudiado la concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en materiales domesticados y silvestres. La movilización de las reservas de la semilla interviene en el éxito de la vegetación natural y en la agricultura, involucra el catabolismo de las reservas de la semilla, su transporte al embrión y la síntesis de nuevos materiales (Pandey et al., 2010).
La distribución de masa seca y glúcidos en la germinación y establecimiento de la plántula está regida por mecanismos genéticos, bioquímicos y fisiológicos (Di Vittori et al., 2019). Actualmente se conoce que las plantas utilizan sus azúcares mediante varias rutas metabólicas del carbono para optimizar su uso en el desarrollo. Algunos azúcares regulan la síntesis de proteínas para el crecimiento vegetal al ser fuente de energía para los procesos metabólicos en respuesta a estreses y al conectarse con otras redes de señalización para controlar la proliferación y expansión celular (Lastdrager et al., 2014).
En el mejoramiento genético de las plantas es necesario conocer los procesos genéticos, bioquímicos y fisiológicos que propicien una tasa más alta de asignación de los principales compuestos de reserva en las semillas (Coelho y Benedito, 2008). La comparación de las formas domesticadas y silvestres ha permitido identificar probables cambios ocurridos durante el proceso de domesticación (Shi y Lai, 2015). El objetivo del estudio fue determinar el efecto de la domesticación en la composición y estructura de cotiledones, eje embrional y plántulas desarrolladas en oscuridad. Si existen diferencias entre frijoles domesticados y silvestres, en la asignación de biomasa y carbohidratos de los cotiledones hacia la plántula, éstas se deberán a cambios ocurridos en el proceso de su domesticación.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se emplearon tres variedades mejoradas de Phaseolus vulgaris L.: OTI, Cacahuate-72 y Canario-G15, donadas por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y tres formas silvestres recolectadas en Tepoztlán, Morelos, Cholula, Puebla y Arcelia, Guerrero, México.
Preparación de muestras
Ocho semillas de cada cultivar y recolecta se escarificaron (se realizó una muesca con un cortaúñas en la parte opuesta al hilio) y se colocaron sobre papel filtro Ahlstrom No. 541 en cajas Petri de 9 cm de diámetro, se les aplicaron 10 ml de agua destilada y se mantuvieron en una incubadora (Esco Isotherm) a 25 °C hasta que germinaron. Asimismo, ocho semillas con radícula expuesta (1-2 mm de longitud), se sembraron en bolsas de cultivo de 15 x 25 cm con fuelle color negro calibre 500 de 1 kg de capacidad que contenían sustrato de vermiculita y se colocaron para la emergencia y desarrollo de las plántulas en un cuarto oscuro por 14 días (d).
Las evaluaciones incluyeron: 1) medición la masa seca de cotiledones y eje embrional de semillas germinadas y de la raíz, el vástago y el remanente de los cotiledones de las plántulas en una balanza analítica Sciencetech modelo SA 120; 2) la concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en cotiledón y eje embrional de semillas germinadas y en la raíz y vástago de plántulas en cuatro repeticiones por material y 3) el número de células y el número y dimensiones de gránulos de almidón en el cotiledón en cuatro semillas germinadas de cada material.
Masa seca de cotiledones, eje embrional, raíz, vástago y remanente de los cotiledones
Los cotiledones y el eje embrional (meristemo apical caulinar, hipocótilo y meristemo radical subapical) de cada semilla germinada y la raíz, el vástago y el remanente de los cotiledones de las plantas mantenidas en oscuridad por 14 d, se separaron con un escalpelo, se introdujeron por separado en sobres de papel aluminio, se sumergieron en nitrógeno líquido, se liofilizaron por 72 h y se pesaron en una balanza analítica (Sciencetech modelo SA 120).
La eficiencia en asignación (EA) de biomasa de los cotiledones a la plántula fue calculada mediante la siguiente relación (Yamaguchi, 1978)
Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en cotiledones y eje embrional y órganos de la plántula
Cuatro semillas germinadas se disectaron en cotiledones y el eje embrional, también, cuatro plántulas se disectaron en raíz y vástago, posteriormente se liofilizaron y se determinó la concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa mediante la técnica propuesta por Viola y Davis (1992) y modificada por Vargas-Vázquez et al. (2020). La modificación consistió en determinar la concentración óptima de enzimas y tiempos de calentamiento en baño maría de las muestras.
Número de células, número y dimensiones de gránulos de almidón en el cotiledón.
En semillas germinadas, se tomó un segmento del centro del cotiledón, el cual se fijó en FAA, se deshidrató gradualmente en alcoholes, se incluyó en parafina en un cambiador automático de tejidos (Tissue-Tek II). Posteriormente se hicieron cortes histológicos de 10 micras de espesor con un micrótomo rotatorio (Erma Inc.). Posteriormente se pigmentaron con ácido peryódico y reactivo de Schiff (Johansen, 1940). El número de células y gránulos de almidón se cuantificó en campos de 40 x en un microscopio óptico (Zeiss, modelo Axioscope 2) y posteriormente se calculó el número por mm2. Se obtuvieron imágenes con una cámara digital (Amscope) y se estimó la longitud, diámetro y área de cada gránulo de almidón con el programa Image J.
Diseño experimental y análisis estadístico
Cada variedad y cada recolecta silvestre representó un tratamiento. Éstos se distribuyeron en un diseño completamente al azar. La unidad experimental fue una semilla o una plántula. Previo a los análisis se verificó la independencia, normalidad y homogeneidad de varianza de los datos. Cuando no se cumplieron estos supuestos, las variables fueron transformadas a logaritmo o raíz cuadrada. Posteriormente se sometieron a Andevas y pruebas de comparación de medias de Tukey (p≤ 0.05) con el paquete estadístico SAS (SAS, 2012). Los resultados se graficaron con el paquete SigmaPlot Versión 14 (2019).
Resultados
Masa seca de cotiledones, eje embrional, raíz y vástago
Las variedades mejoradas tuvieron 11 veces más masa seca en los cotiledones y tres veces más en el eje embrional que las silvestres. La relación entre la masa seca del eje embrional y la de los cotiledones en los mejorados fue de 0.02 y en los silvestres de 0.08. Entre las variedades mejoradas, así como entre las semillas silvestres no hubo diferencias en la masa seca del eje embrional (p> 0.05) (Figura 1 A y B).
Figura 1 Masa seca de cotiledones (A) y eje embrional (B) en semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) de variedades mejoradas y recolectas silvestres. Cada barra es el promedio de cuatro repeticiones ±ee. Letras diferentes arriba de las barras indican diferencia significativa entre materiales (Tukey ≤ 0.05).
La raíz y el vástago de las domesticadas pesaron en promedio siete y nueve veces más respectivamente, que los silvestres. El contenido de materia seca en promedio fue de 18% en la raíz, 82% en el vástago y no hubo diferencia entre los mejorados y los silvestres (Figura 2).
Figura 2 Masa seca de raíz (A) y vástago (B) en plántulas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) de variedades domesticadas y recolectas silvestres. Cada barra es el promedio de cuatro repeticiones ±ee. Letras diferentes arriba de las barras indican diferencia significativa entre materiales (Tukey ≤ 0.05).
La eficiencia de asignación fue mayor en los silvestres que en los domesticados (67.4 vs 51.2%, p< 0.05). Entre los domesticados, cacahuate presentó mayor asignación de materia que OTI y Canario, mientras que, entre los silvestres, Arcelia y Tepoztlán tuvieron mayor asignación que Cholula.
Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en los cotiledones y el eje embrional
En los cotiledones de las variedades mejoradas, las concentraciones de almidón, glucosa y sacarosa fueron mayores (60, 27, 369%, respectivamente) que, en los silvestres, mientras que la de fructosa fue similar. Entre los materiales mejorados no hubo diferencia significativa en la concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa, y en los silvestres, tampoco, excepto Cholula, con menos glucosa que Arcelia y Tepoztlán (Cuadro 1).
Cuadro 1 Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en los cotiledones (C) y eje embrional (EE) de variedades mejoradas y recolectas silvestres de Phaseolus vulgaris L.
| Forma | Nombre | Almidón | Glucosa | Fructosa | Sacarosa | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (µmol g-1 peso seco) | ||||||||||
| C | EE | C | EE | C | EE | C | EE | |||
| Mejorada | OTI | 459a | 648d | 5.7a | 47bc | 5.6a | 34bc | 62a | 53a | |
| Cacahuate | 514a | 568d | 5.8a | 45c | 4.5ab | 37bc | 66a | 68a | ||
| Canario | 384ab | 751cd | 5.5a | 51abc | 4.2ab | 33c | 56a | 80a | ||
| Silvestre | Tepoztlán | 290b | 1017bc | 6.2a | 79ab | 5.7a | 70a | 15b | 57a | |
| Cholula | 275b | 1631b | 3.5b | 52abc | 3.8b | 62ab | 9b | 52a | ||
| Arcelia | 280b | 2518a | 4.1ab | 81a | 3.9b | 84a | 14b | 81a | ||
| Mejorada | Promedio | 452a | 656b | 5.7a | 47b | 4.8a | 36b | 61a | 67a | |
| Silvestre | 282b | 1722a | 4.5b | 71a | 4.2a | 72a | 13b | 63a | ||
Los valores son la media de cuatro repeticiones de cada material. Letras diferentes en las columnas indican diferencia significativa (Tukey ≤ 0.05).
En el eje embrional, la concentración de almidón, glucosa, y fructosa de los silvestres fueron estadísticamente mayores que en las variedades mejoradas; mientras que la concentración de sacarosa fue similar. Entre las tres variedades mejoradas no hubo diferencia en la concentración de glucosa, fructosa y sacarosa y entre los silvestres destacó Arcelia con mayores valores de concentración de almidón (Cuadro 1).
Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en raíz y vástago
En la raíz, las recolectas silvestres tuvieron más moléculas de almidón, fructosa y sacarosa por g de peso seco que los domesticados. En contraste, en el vástago, los domesticados tuvieron más moléculas de glucosa, fructosa y sacarosa, pero menos moléculas de almidón. Entre los mejorados, OTI y Canario tuvieron más almidón en la raíz que Cacahuate, en los demás glúcidos no se observó diferencia, con respecto al vástago no se observó diferencia en el contenido de los glúcidos. Entre los silvestres destaca Cholula por su alta concentración de fructosa en raíz y sacarosa en vástago (Cuadro 2).
Cuadro 2 Concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en la raíz y el vástago de plántulas de Phaseolus vulgaris L. de variedades mejoradas y recolectas silvestres desarrolladas en oscuridad.
| Forma | Nombre | Almidón | Glucosa | Fructosa | Sacarosa | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (µmol g-1 peso seco) | |||||||||
| Raíz | Vástago | Raíz | Vástago | Raíz | Vástago | Raíz | Vástago | ||
| Mejorada | OTI | 164b | 126a | 25b | 596a | 18c | 284a | 12c | 124ab |
| Cacahuate | 58c | 128a | 51ab | 335ab | 27bc | 167abc | 14c | 108ab | |
| Canario | 107bc | 147a | 65ab | 448ab | 39bc | 223ab | 21bc | 143a | |
| Silvestre | Tepoztlán | 714a | 162a | 65ab | 217b | 47b | 119bc | 46a | 79ab |
| Cholula | 679a | 188a | 68a | 324b | 91a | 173abc | 57a | 136a | |
| Arcelia | 541a | 152a | 57ab | 200b | 36bc | 94c | 39ab | 63b | |
| Mejorada | Promedio | 110b | 134b | 47a | 460a | 28b | 225a | 16b | 125a |
| Silvestre | 645a | 167a | 63a | 247b | 58a | 129b | 47a | 93b | |
Los valores son la media de cuatro repeticiones de cada material. Letras diferentes en las columnas indican diferencia significativa (Tukey ≤ 0.05).
Número de células, número y tamaño de gránulos de almidón en el cotiledón de semillas germinadas
Las silvestres tuvieron 1.7 veces más células y 1.4 veces más gránulos de almidón por unidad de superficie que las domesticadas (Cuadro 3 y Figura 3). Canario presentó mayor número de células y gránulos que OTI y Cacahuate y Cholula tuvo menos células y similar número de gránulos de almidón que las otras recolectas silvestres.
Cuadro 3 Número de células, número y dimensiones de gránulos de almidón en cotiledones de semillas germinadas de variedades mejoradas y recolectas silvestres de P. vulgaris L.
| Forma | Nombre | Núm. mm-2 | Dimensiones gránulos de almidón | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Células | Gránulos de almidón | Longitud (µ) | Diámetro (µ) | Área (µ2) | |||
| Mejorada | OTI | 1246c | 347 c | 9.4a | 7.8a | 50a | |
| Cacahuate | 1224c | 4090bc | 8.2b | 6.2bc | 32b | ||
| Canario | 1924b | 6231a | 7.6b | 6.2bc | 32b | ||
| Silvestre | Tepoztlán | 2536a | 6056ab | 7.4bc | 6bc | 30b | |
| Cholula | 2121ab | 6035ab | 6.3c | 5.2c | 22b | ||
| Arcelia | 2915ab | 7674a | 7.7b | 6.3b | 33b | ||
| Mejorada | 1465b | 4599b | 8.4a | 6.7a | 38a | ||
| Silvestre | 2524a | 6589a | 7.1b | 5.8b | 28b | ||
Los valores son la media de cuatro repeticiones de cada material. Letras diferentes en las columnas indican diferencia significativa (Tukey ≤ 0.05).
Discusión
La aportación pretende ampliar la concepción del síndrome de domesticación al diferenciar materiales mejorados y silvestres a nivel de semillas y plántulas. La domesticación ha cambiado tanto la masa seca de los cotiledones, como la del eje embrional, traduciéndose en un tamaño mayor de la semilla. La domesticación de las variedades OTI y Canario no ha diferenciado entre ellas la masa seca del eje embrional; mientras que en Cacahuate ha habido un ligero incremento, esta diferencia puede deberse a que provienen de diferentes razas (Singh et al., 1991; Estrada-Gómez et al., 2004).
En las recolectas silvestres se observó igual masa seca en cotiledones y eje embrional en Cholula y Arcelia. Valores similares a los encontrados en esta investigación fueron consignados en otras semillas silvestres y mejoradas de P. vulgaris (Morales-Santos et al., 2017), en trigo la evolución bajo la domesticación ha aumentado la masa seca del grano, pero no la del embrión (Golan et al., 2015), resultados contrastantes a los observados en la presente investigación y donde, la domesticación ha incrementado la masa seca de todas las estructuras de la semilla en frijol.
Así como la domesticación de P. vulgaris ha favorecido la masa seca de los cotiledones y eje embrional, también lo ha hecho con la masa seca de la raíz y del vástago de las plántulas; sin embargo, la distribución de la materia entre estos órganos se ha mantenido entre los domesticados y los silvestres. Milla y Matesanz (2017) mencionaron que semillas grandes, típicas de los cultivos, producen individuos con órganos grandes como lo podemos constatar en nuestros resultados.
El vigor de las plántulas está en función del tamaño de la semilla, de la fracción de las reservas translocadas y de la eficiencia de conversión de dichas reservas en los órganos de las plántulas (Mohammadi et al., 2011). Las accesiones silvestres mostraron mayor eficiencia en la asignación de materia que las domesticadas, este patrón ya ha sido observado también en otras accesiones silvestres y variedades mejoradas de frijol común (Celis-Velázquez et al., 2008).
La domesticación ha conducido a un mayor tamaño de semillas y por ende la cantidad de sus reservas; sin embargo, durante la germinación no todas las reservas son usadas aun cuando las plántulas se encuentren en condiciones de oscuridad o estrés (Ansari et al., 2012). Sin embargo, Hu et al. (2017) refiere que el tamaño de la semilla sólo le da ventaja competitiva a las plántulas cuando éstas se encuentran en estrés y que las provenientes de semillas pequeñas presentan tasas relativas de crecimiento mayores con respecto a las de las semillas grandes.
En este trabajo se observó que el almidón y la sacarosa son las mayores sustancias de reserva con respecto a la glucosa y fructosa en las variedades mejoradas; sin embargo, Vargas-Vázquez et al. (2020) consignaron que en Phaseolus coccineus, los materiales silvestres presentaron mayor concentración de glúcidos que los domesticados, mientras que Cilia et al. (2021) no encontraron diferencias en la concentración de glúcidos entre P. vulgaris y P. acutifolius, lo que indicaría que la domesticación aún entre especies del mismo género no ha determinado una tendencia en la concentración de glúcidos entre las especies, como lo ha hecho con el tamaño de la semilla. Estas diferencias podrían deberse a las condiciones abióticas, donde cada especie evolucionó y fue domesticada. La translocación de las sustancias de reserva de la semilla a la plántula es importante para el crecimiento de esta. Cuando la germinación inicia, el almidón es convertido a azúcares translocables que junto con los azúcares de reserva son translocados al eje embrional para que inicie el crecimiento y se transforme en una plántula. Por ejemplo, en Arabidopsis, el triglicerol es transformado a sacarosa (Pritchard et al., 2002).
En el caso del frijol, el almidón al ser la principal reserva en la semilla tiene que ser transformado a sacarosa, principal sustancia translocable, para ser transportado al eje embrional y ser usada en el crecimiento (Bewley y Black, 2013). El tamaño de los granos de almidón varió entre las variedades y las recolectas silvestres, siendo en éstas de menor tamaño, pero en mayor número, lo que indica que es un carácter que presenta variabilidad. Wani et al. (2010); Bajaj et al. (2018) reportaron mayor tamaño en variedades mejoradas de frijol de la India; sin embargo, Yoshida et al. (2003) mencionaron que las dimensiones de los gránulos varían desde uno hasta 38 µm, lo cual indica que es un carácter variable entre variedades y no muestra un patrón en el grado de domesticación.
La concentración de almidón, glucosa, fructosa y sacarosa en los cotiledones y el eje embrional también se ha modificado por la domesticación. Las funciones y vías metabólicas de dichas moléculas difieren, lo anterior se observa parcialmente en la concentración cuantificada en este estudio. En esta investigación se localizaron diferencias significativas en su contenido entre ambas estructuras y entre materiales domesticados y silvestres. En los silvestres, la mayor concentración de azúcares en el eje embrional indicó la alta demanda de carbono en respuesta a la actividad metabólica por el crecimiento de la radícula (Sánchez-Linares et al., 2012).
La mayor concentración de azúcares en la raíz de las plántulas silvestres indicó que quizá al sobrevivir en suelos agrestes requieren más energía para crecer. La alta concentración de almidón, glucosa y sacarosa en los cotiledones de variedades coincide con lo documentado por Ortega y Rodríguez (1979).
Conclusiones
La domesticación de Phaseolus vulgaris, ha incrementado el peso seco de todas las estructuras de la semilla y favorecido el mayor tamaño de la raíz y del vástago de las plántulas; sin embargo, la asignación de la biomasa entre estos órganos se ha mantenido entre los domesticados y los silvestres. Existe una mayor eficiencia en la asignación de materia de reserva energética en las formas silvestres que en las domesticadas. La domesticación favoreció la cantidad de reservas de la semilla; sin embargo, durante la germinación no todas las reservas son utilizadas aun cuando las plántulas se encuentren en condiciones de oscuridad. El almidón y la sacarosa son las reservas más abundantes con respecto a la glucosa y fructosa en las variedades mejoradas. Los granos de almidón en las colectas silvestres, excepto en una de ellas, fueron de menor tamaño, pero en mayor número.
