Material vegetal

Las plantas objeto de estudio fueron elegidas sobre la base de una meticulosa búsqueda bibliográfica que mostró que estas especies de plantas están muy poco estudiadas. Las hojas de Cupressus sempervirens L. y Cupressus arizonica utilizadas en este estudio fueron recolectadas durante el mes de abril de 2021, a nivel del Departamento de Biotecnologías y Agroecología de la Universidad de Blida 1 (Blida-Argelia). La identificación de las dos especies se realiza con la flora de ^{Quezel y Santa (1963}). Para no dañar el árbol, hemos elegido hojas muy verdes que aparecen en los extremos de las ramas.

Cepa bacteriana

La cepa bacteriana utilizada en este estudio es Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, bacteria patógena, categoría Gram-negativa, clínicamente aislada, su recolección y aislamiento se realizó de acuerdo con estándares de higiene. La cepa se almacena y cultiva en medio Mueller-Hinton. Forma parte de la colección del laboratorio de investigación en Biotecnología de Producción Vegetal de la Universidad de Blida 1 y fue puesto a nuestra disposición por el director Pr. Sid Ahmed SNOUSSI.

Secado

Después de la cosecha, las muestras fueron limpiadas (se limpiaron de escombros) y esparcido en papel. Las partes aéreas de la planta se secaron en la oscuridad a temperatura ambiente. Ventilamos las muestras cada tres días para evitar el crecimiento de moho. El secado duró 30 días en promedio (^{Debib et al., 2014}).

Molienda

Las hojas secas se trituraron, tamizaron y almacenaron en frascos herméticos (temperatura ambiente) protegidos de la humedad y la luz, hasta su uso.

Preparación de extractos crudos

Para la extracción de polifenoles optamos por el uso de tres disolventes: éter de petróleo, cloroformo y metanol-acuoso.

Extracto hidroalcohólico

Se pusieron en contacto 10 g de cada material vegetal con 100 ml de una mezcla de metanol-agua (70/30) (v/v). Después de 24 h de agitación mecánica a temperatura ambiente y protegida de la luz, la mezcla se filtra al vacío con una membrana Millipore de 0.4 μm y se evapora a sequedad a presión reducida mediante un rotavapor (BUCHI R-215) a 45 °C para obtener el extracto hidroalcohólico. Los residuos obtenidos se almacenan a 4 °C hasta su uso (^{Romani et al, 2006}).

Extracto etérico

Primero se maceran 10 g de cada material vegetal en 100 ml de éter de petróleo. Después de 10 min de agitación mecánica a temperatura ambiente y protegido de la luz. La mezcla se filtra al vacío con una membrana Millipore de 0.4 µm y se concentra en un rotavapor a una temperatura de 30 °C para obtener el extracto de éter dietileno. Los residuos obtenidos se almacenan a 4 °C hasta su uso (Drissa et al., 2004).

Extracto cloroformico

Primero se maceran 10 g de cada material vegetal en 100 ml de cloroformo. Después de 10 min de agitación mecánica a temperatura ambiente y protegida de la luz, la mezcla se filtra al vacío con una membrana Millipore de 0.4 μm y se concentra en un rotavapor a 40 °C para obtener un extracto clorofórmico. Los residuos resultantes se almacenan a 4 °C hasta su uso (Drissa et al., 2004). Los residuos secos pesados son captados por los disolventes para el estudio fitoquímico y por Dimetilsulfóxido (DMSO) para la actividad antibacteriana (^{Debib et al., 2014}).

Rendimiento de extracción

El rendimiento de extracción se calcula por la fórmula propuesta por ^{Falleh et al. (2008}):

Donde: R= porcentaje de rendimiento %; Mext= masa del extracto después de la evaporación del solvente en g; M_seca= masa seca de la muestra de planta en g.

Cribado fitoquímico

El cribado fitoquímico es una prueba cualitativa que permite resaltar los diferentes grupos químicos contenidos en un órgano vegetal, los resultados se clasifican en reacción muy positiva= +++; reacción positiva= ++; reacción débil= +; reacción negativa= -; se realizaron pruebas fitoquímicas sobre extractos preparados a partir de hojas de Cupressus. La detección de algunos compuestos se logra utilizando los métodos descritos por Harbone, (1973); ^{Trease y Evans (1989}); ^{Evans (1996)} con algunas modificaciones.

Prueba de Bate-Smith (prueba de flavan-3.4-dioles)

En un tubo ponemos 1 ml del extracto al que añadimos 250 µl de HCl concentrado. El tubo y se llevó a un baño maria durante 30 min. La aparición de un color rojo indica la presencia de leucoantocianinas que son derivados de flavan-3.4-dioles (Karumi, 2004).

Prueba de Wilstater (pruebas para flavonoles y flavononas)

En tubos separados, se pone 1 ml de cada extracto y se le añade 0.1 g de magnesio (Mg). Se añade una gota de HCl y se deja actuar bajo la campana. La aparición de un color que se torna rojo violáceo (flavonoles) o rojo violáceo (flavononas) confirma la existencia de flavonoides (Karumi, 2004).

Taninos

Se añaden 100 µl de una solución de FeCl3 al 1% a un tubo que contiene 1 ml del extracto. En presencia de taninos, se desarrolla un color verdoso o azul-negro. El color se torna marrón negruzco en presencia de taninos gálicos (taninos hidrolizables) y azul verdoso en presencia de taninos catequéticos (taninos condensados) (^{Harborne, 1998}).

Saponósidos

Ponga 0.5 g de hojas trituradas en 80 ml de agua destilada y revuelva durante unos minutos. La aparición de una espuma en el medio prueba la presencia de saponósidos (^{Trease y Evans, 2002}).

Antraquinonas

En un tubo ponemos 1 ml del extracto al que añadimos 500 µl de KOH. Después de agitar, la presencia de las antraquinonas se confirma volviendo la fase acuosa en rojo (^{Ribérreau, 1968}).

Saponinas

Reacción de Libermann-Burchard: a 5 ml de extractos, agregamos 5 ml de anhídrido acético (C₄H₆O₃) y unas gotas de H₂SO₄ concentrado. Los esteroides dan un color rojo con esta reacción, mientras que los triterpenos dan un color verde (^{Bruneton, 1993}).

Quinonas libres

La identificación de quinonas libres en nuestros extractos se realiza añadiendo unas gotas de NaOH (1%) a 1 ml del extracto. Su presencia está indicada por la apariencia de color púrpura; amarillo o rojo (^{Ribérreau, 1968}).

Terpenoides

Se mezclaron 5 ml de extracto con 2 ml de cloroformo en un tubo de ensayo. Se añadieron cuidadosamente 3 ml de ácido sulfúrico concentrado a lo largo de la pared del tubo de ensayo para formar una capa. Una interfaz con una coloración marrón rojiza indica la presencia de terpenoides (^{Bruneton, 1993}).

Glucósidos cardíacos

Se vertió 1 ml de ácido sulfúrico concentrado en un tubo de ensayo. Se mezclaron 5 ml de extracto con 2 ml de ácido acético glacial que contenía una gota de cloruro férrico. Esta mezcla se añadió cuidadosamente a 1 ml de ácido sulfúrico concentrado. La presencia de glucósidos cardíacos se detectó mediante la formación de un anillo marrón (^{Trease y Evans, 2002}).

Evaluación de la actividad antibacteriana

La prueba de sensibilidad a las bacterias se realiza mediante el método de difusión en medio de agar, también llamado método de disco (^{Celiktas et al., 2007}; ^{Bssaibis et al., 2009}).

Siembra

En placas de Petri estériles (Ø: 90 mm), se vierten 20 ml de agar Mueller-Hinton y se dejan solidificar durante 20 min. En este medio de cultivo se inoculó 1 ml de suspensión bacteriana de 10⁸ UFC ml^-1 en toda la superficie utilizando un hisopo, el hisopo se debe pasar por toda la superficie para obtener una inoculación homogénea (^{Shunying et al., 2005}). Se impregnan discos estériles (Liofilchem^®) en blanco de 6 mm de diámetro con un volumen de 10 μl de extracto y se colocan sobre la superficie del medio solidificado (^{Ngameni et al., 2009}). Las placas de Petri se incubaron durante 18-24 h, a 37 °C. Para el control positivo se utilizaron los discos antibióticos (Penicilina y Vancomicina (Liofilchem^®)), mientras que para el control negativo se empapó el disco blanco estéril con Dimetilsulfóxido (DMSO).

Lectura

La determinación de la actividad antibacteriana se estimó midiendo el diámetro (mm) de la zona de inhibición alrededor de los discos inducida por los extractos. El cálculo se realiza mediante el software de procesamiento y medición Digimizer™. Los resultados están simbolizados por signos que dependen de la sensibilidad de las cepas al extracto (^{Ponce et al., 2003}) (Cuadro 1).

Tratamiento estadístico de datos

El análisis estadístico de los resultados obtenidos se realizó mediante el software SPSS^© versión 20.0.0 para Windows™. Los experimentos se repitieron diez veces para verificar la normalidad de la distribución estadística. Los resultados muestran las mismas tendencias. Se realiza un análisis de varianza (Anova) seguido de una prueba de Tukey post-hoc al umbral de 5% y una prueba de Student para ver la existencia de diferencias significativas entre los métodos de extracción según la planta ensayada teniendo en cuenta recuentos el rendimiento de extractos e inhibición del desarrollo de P. aeruginosa ATCC 9027.

Rendimiento de extractos

Para las dos plantas Cupressus sempervirens y Cupressus arizonica, el mejor rendimiento de extracción de los tres solventes utilizados es el cloroformo con un rendimiento de extracción promedio de 61.23% y 52.27% respectivamente, seguido del solvente hidroalcohólico 33.55% y d etérico con 0.39% (Figura 1). Los rendimientos de extracción mostrados en la figura revelan una diferencia significativa (C. sempervirens F= 52.38; p= 0 en C. arizonica: F= 27.24; p= 0) en comparación con el solvente utilizado. La prueba Anova revela tres grupos homogéneos (Cuadro 2 y 3). Estadísticamente y según la prueba t de Student, los tres disolventes (cloroformo, hidroalcohólico, etéreo) difieren significativamente para las dos plantas (Cuadro 4).

Figura 1 Rendimiento de extracción de extractos fenólicos. 

Las similitudes son comunes en las hojas de los árboles cosechados en el mismo lugar. Las condiciones ambientales tienen una influencia importante en la producción de metabolitos, por lo que se puede esperar que los rendimientos de extracción de plantas que crecen en el mismo lugar sean muy similares (^{Graglia et al., 1996}). Nuestros resultados refutan esta hipótesis y muestran claramente que el rendimiento de las especies no está relacionado con las condiciones ambientales porque los dos árboles están ubicados en la misma área a una distancia de 2.45 m.

Estos resultados se correlacionan con los de ^{Farhat et al. (2009}) quienes explican que el rendimiento variable de los extractos se reduce a la solubilidad diferencial de los diversos compuestos fenólicos en los disolventes y que esta solubilidad es función de sus grados de polimerización. La interacción con los demás componentes y la naturaleza y características fisicoquímicas de los disolventes utilizados y en particular, su polaridad. De hecho, la solubilidad de las sustancias contenidas en el material vegetal en un disolvente determinado depende de estas propiedades. Como resultado, los rendimientos de extracción y la composición de los extractos varían de un solvente a otro y de una planta a otra (^{Falleh et al., 2008}).

Cribado fitoquímico

El cribado fitoquímico de C. arizonica y C. simpervirens indica que las dos especies presentan compuestos fenólicos cuya presencia difiere según el tipo de disolvente utilizado (extracto hidroalcohólico; etérico y clorofórmico) (Cuadro 5).

El cloroformo permite la extracción de taninos gálicos mientras que la extracción con alcohol permite la identificación de taninos catequéticos. Los saponósidos están fuertemente presentes en las hojas de C. arizonica y C. simpervirens. La extracción con éter de petróleo de las hojas de C. simpervirens muestra una reacción débil a las leucantocianinas y los esteroides. Por otro lado, el uso de este solvente para las hojas de C. arizonica resulta en una reacción negativa.

Los terpenoides se observan con fuerza cuando se usa el extracto de cloroformo para las hojas de C. simpervirens. Este no es el caso de las hojas de C. arizonica. De estos resultados se desprende que el uso de un solvente hidroalcohólico permite una mejor extracción de los compuestos fenólicos a excepción de los taninos gálicos, que, como se mencionó anteriormente, están disponibles mediante el uso de cloroformo en el proceso de extracción.

Estos resultados corroboran con ^{Azzaz et al. (2019}), donde informaron que la composición de los extractos de hojas de C. simpervirens varía según el solvente de extracción y el método utilizado. Además, no se han realizado estudios sobre extractos de C. arizonica; este se realizó por primera vez en C. arizonica con el fin de prospectar los diversos metabolitos secundarios existentes en esta planta. Se sabe que los compuestos como los flavonoides, terpenos, quinonas, taninos y saponinas en las plantas son responsables de la protección contra el estrés biótico y abiótico, la actividad antifúngica y numerosas actividades biológicas (^{Hiermann et al., 1998}; ^{Kanwal et al., 2010}).

Efecto de extractos fenólicos de C. sempervirens y C. arizonica en el desarrollo de P. aeruginosa

El cálculo del diámetro de inhibición de P. aeruginosa inducido por los diferentes extractos y por los antibióticos (Penicilina y Vancomicina) se muestra en la Figura 2. P. aeruginosa es extremadamente sensible al control positivo, vancomicina, donde se observa un diámetro de la zona de inhibición de 24.25 mm; lo mismo ocurre con el extracto hidroalcohólico de C. sempervirens donde el organismo de prueba se considera sensible. Con una zona de inhibición del orden de 19.95 mm. Los resultados indican que la extracción hidroalcohólica induce una sensibilidad muy pronunciada de P. aeruginosa con un diámetro de 16.2 mm para C. arizonica. Los extractos etéreos y clorofórmicos inducen una inhibición relativamente débil (Cuadro 6).

Figura 2 Variación del diámetro de la zona de inhibición (mm) en función de la planta y el disolvente. 

C. arizonica muestra números bajos de la zona de inhibición en comparación con C. sempervirens. La prueba de Student (prueba t) al nivel del 5% indica que esta diferencia no es estadísticamente significativa (p> 5%) (Cuadro 7).

Un análisis de varianza mediante Anova al nivel de 5% seguido de un post-hoc de Tukey permite dividir el diámetro de inhibición en grupos homogéneos (F= 24.09; p= 0). En C. arizonica, se observó la distribución de diámetros de inhibición en tres grupos homogéneos. El primero está representado por Penicilina, extracto de éter, DMSO y extracto de cloroformo. El segundo por cloroformo y extracto hidroalcohólico. La vancomicina se aísla en el grupo 03 (Cuadro 8).

La prueba de Tukey muestra 04 grupos homogéneos en C. sempervirens (F= 15,12; p= 0). El primero está representado por penicilina y DMSO. El segundo grupo está representado por DMSO, el extracto etérico. El tercer grupo está representado por extractos etéreos, clorofórmicos e hidroalcohólicos. El efecto del extracto hidroalcohólico es similar al efecto de la vancomicina aislada en el grupo 04 (Cuadro 9).

Se desprende de los resultados obtenidos que los diámetros de las zonas de inhibición varían en función del tipo de disolvente estudiado. La actividad antibacteriana de estos extractos se debe principalmente a su perfil químico. Cabe señalar, que la diferencia entre las actividades antimicrobianas de los extractos puede explicarse por la diferencia en los compuestos activos obtenidos. Por tanto, esta actividad está relacionada con la polaridad de las sustancias bioactivas extraídas y los disolventes de extracción (^{Machiex et al., 2005}).

Estos resultados son mejores que los obtenidos por ^{Hayouni et al. (2007}) con extractos de cloroformo de frutos de Juniperus phoenicea (Cupressaceae) contra P. aeruginosa ATCC 9027, donde encontraron halos de zonas de inhibición de 3.03 mm ±0.21. El rendimiento variable de los extractos se reduce a la solubilidad diferencial de los diferentes compuestos fenólicos en los disolventes y que esta solubilidad es función de su grado de polimerización, la interacción con los demás constituyentes y el tipo de disolvente utilizado (^{Falleh et al., 2008}; ^{Debib et al., 2014}).

Combinando los resultados del cribado fitoquímico pudimos demostrar que la actividad antibacteriana está ligada a la presencia de moléculas fenólicas en las hojas de ambas plantas. Estos metabolitos secundarios son responsables de diversas actividades biológicas. Por lo tanto, se ha prestado gran atención a los productos naturales derivados principalmente de plantas (^{Chaudhary et al., 2012}; ^{Chaitra et al., 2015}).