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Introducción
En la actualidad, las células madre son un tema de mucho interés para el campo de investigación y para la medicina regenerativa gracias al desarrollo de nuevas técnicas para regenerar tejidos dañados por lesiones o enfermedades.1 La pulpa dental humana es una de las alternativas como fuente de obtención de una gran variedad de células. Este tejido incluye células madre que poseen un potencial alto de proliferación y una capacidad de diferenciación multilinaje. El acceso al tejido pulpar y la obtención del mismo se realiza con procedimientos sencillos y poco invasivos. Esto es una ventaja en la medicina y en la odontología regenerativa en contraste con los procedimientos para obtener células madre de otras fuentes, por ejemplo, células madre de la médula ósea.2
El éxito del aislamiento de células de la pulpa dental como células madre o fibroblastos, exige seguir protocolos estrictos para su obtención, teniendo en cuenta las técnicas y cuidados necesarios durante todo el procedimiento, el cual comienza desde la extracción del diente. Debido a la presencia de alrededor 600 especies microbianas en boca, es importante realizar la desinfección del diente extraído y transportarlo en un medio lo más aséptico posible. Para evitar la contaminación del cultivo, se añaden fármacos como antibióticos y antifúngicos en el medio de transporte, y medios de cultivo.3-6 Estudios previos usaron sólo antibióticos como penicilina, estreptomicina, gentamicina; otros también agregaron antifúngicos como anfotericina B. 3-6 Yildirim y colaboradores usaron un medio de transporte salino tamponado con fosfato de Dulbecco (DPBS) con 1% de antibióticos penicilina-estreptomicina (PE-ST).5 Martin-Piedra y su equipo utilizaron en el medio de transporte los antibióticos con anfotericina B y lograron obtener la cantidad de células madre de la pulpa dental viables, necesarias para lograr un cultivo celular exitoso.6 No ha sido posible comparar el número promedio de células obtenidas en este estudio con investigaciones previas porque no mencionan el número total de células después del transporte con medio. El objetivo de este estudio fue evaluar la viabilidad celular comparando dos medios de transporte para piezas dentales, adicionando PE-ST en un grupo, y los mismos antibióticos más anfotericina B en el otro grupo. En conse cuencia, esta investigación nos permite elegir el medio de transporte más adecuado para analizar la viabilidad celular, lo cual ayudará en la obtención de exitosos cultivos de células de la pulpa dental. En este estudio utilizamos antibióticos con anfotericina B en el medio de transporte y obtuvimos mayor cantidad de células viables que cuando se utilizaron sólo los antibióticos. Además, los estudios sobre las células pulpares dentales pueden aplicarse en la medicina regenerativa para tratar diferentes enfermedades como la regeneración ósea, los problemas congénitos, los tumores y los traumatismos del macizo craneofacial.
Material y métodos
Este estudio tuvo un diseño metodológico de tipo: analítico, experimental, prospectivo y transversal. Se compararon los siguientes grupos de medio de transporte de las piezas dentales: Grupo 1: penicilina + es treptomicina (16 dientes). Grupo 2: penicilina + estreptomicina + anfotericina B (17 dientes).
Obtención de las células de la pulpa dental
Las células de la pulpa dental se obtuvieron de premolares y terceras molares, de pacientes adultos jóvenes entre 18 y 29 años de edad, extraídas quirúrgicamente por indicación profesional, en el Centro Quirúrgico del Centro Odontológico de la Universidad de San Martín de Porres, previo consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética de Investigación de la Facultad de Odontología de la Universidad de San Martín de Porres. Se obtuvo el tamaño de muestra con base en el estudio previo de viabilidad celular del autor Martín-Piedra.6 En esta investigación se utilizaron pulpas dentales de 33 dientes en total, divididos en dos grupos.
Para la obtención de las células de la pulpa dental, primero se realizaron las exodoncias e inmediatamente se almacenaron las piezas dentales en los frascos con medio de cultivo. Los frascos fueron transportados hacia el laboratorio en un cooler con geles de hielo, a una temperatura de 4-8 oC. El grupo 1 estuvo conformado por piezas dentales que se transportaron en frascos estériles individualmente con el medio de transporte al cual se le agregó penicilina y estreptomicina. El grupo 2 consistió en piezas dentales transportadas en el medio de transporte al cual se le adicionó penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Luego, dentro de la cabina de flujo laminar, se desinfectó la pieza dental con una gasa embebida en alcohol al 70% y se colocó en un tubo con el medio minimum essential medium (MEM) más PE-ST al 0.5% durante 20 minutos. Posteriormente se realizó la extracción del tejido pulpar con el método de fractura mecánica. En seguida, se colocó la pieza fracturada en una placa Petri con MEM más PE-ST y se extrajo la pulpa cameral. En seguida, se trituró la pulpa con el fin de obtener una suspensión celular. A continuación se centrifugó a 1,100 rpm por 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular o pellet con MEM. Luego se tomó un volumen de 10 μL de la suspensión y se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de exclusión con el colorante de azul de tripán. Se realizó el conteo celular con el hemocitómetro y el microscopio óptico compuesto. Las células vivas se observaron transparentes y las células muertas estaban teñidas de azul. Por último, se obtuvo el valor de porcentaje de viabilidad mediante la siguiente fórmula:
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó el programa IBM SPSS en su versión 21. Se tomó un intervalo de confianza al 95% (p = 0.05) para aceptar que existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de los grupos. Se usó la prueba t de Student para comparar dos medias de datos paramétricos. Para los datos que no cumplían con la condición mencionada, se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann Whitney. Además se emplearon la prueba estadística de χ2 y las de correlación de Pearson y la de Spearman.
Resultados
Las características de edad, sexo, tipo de pieza y tiempo (horas) transcurrido para el procesamiento de las muestras de ambos grupos son similares, no existen diferencias significativas entre ellas (p > 0.05) (Tabla 1).
Tabla 1: Descripción de la muestra.
| Característica | Grupo con medio de transporte |
p | |
|---|---|---|---|
| Sin anfotericina B |
Con anfotericina B |
||
| Edad | 21.56 ± 3.09 | 23.12 ± 3.99 | 0.223* |
| Sexo, n (%) | |||
| Masculino | 7 (43.8) | 4 (23.5) | 0.218‡ |
| Femenino | 9 (56.3) | 13 (76.5) | |
| Tipo de pieza, n (%) | |||
| Tercera molar | 16 (100.0) | 15 (88.24) | ----- |
| Premolar | 2 (11.76) | ||
| Tiempo transcurrido para procesamiento (horas) | 12.06 ± 9.55 | 12.08 ± 9.06 | 0.929§ |
* t de Student; ‡ prueba de χ2; § prueba U de Mann-Whitney.
Se compararon dos medios de transporte con la finalidad de determinar el medio más eficiente para obtener células viables de la pulpa dental. Para el conteo celular se utilizó el microscopio óptico compuesto. Las células fueron teñidas con el colorante azul de tripán. Se diferenciaron las células vivas por tener forma redonda con un halo definido, mientras que las muertas estaban totalmente teñidas de azul. Los resultados de viabilidad celular se hallaron con la ayuda de las fórmulas descritas con anterioridad.
Al comparar ambos grupos con la prueba no paramétrica U de Mann Whitney se pudo observar que tanto el número de células como el porcentaje de viabilidad celular es mayor en el grupo 2. Dicho resultado fue estadísticamente significativo, los resultados fueron en el número total de células p = 0.026 y en el porcentaje de viabilidad celular p = 0.0001 (Figuras 1y2).
En el género femenino del grupo 1 se observó un número un poco mayor de células y mejor porcentaje de viabilidad celular comparado con el género masculino (p = 0.711 y 0.266 respectivamente); sin embargo, dicha diferencia no fue estadísticamente significativa (Tabla 2).
Tabla 2: Número de células y viabilidad celular según sexo en los grupos de medio de transporte con y sin Anfotericina B.
| Masculino | Femenino | p | |
|---|---|---|---|
| Sin anfotericina B, n | 7 | 9 | |
| Número total de células* | 1,972,142.86 ± 460,415.18 | 2,248,611.11 ± 1,030,853.04 | 0.711 |
| Viabilidad celular %* | 56.32 ± 6.84 | 60.88 ± 4.65 | 0.266 |
| Con anfotericina B, n | 4 | 13 | |
| Número total de células* | 3,068,750 ± 553,509.64 | 2,627,269.23 ± 1,058,617.94 | 0.174 |
| Viabilidad celular %* | 68.59 ± 3.55 | 67.55 ± 4.26 | 0.651 |
Media ± deviación estándar.
No existe diferencia significativa, p > 0.05 (test U de Mann-Whitney).
En el grupo 2, el número de células promedio fue un poco superior en la pulpa de las personas del sexo masculino, mientras que la viabilidad celular fue muy similar entre varones y mujeres. No hubo diferencia estadísticamente significativa entre el número de células ni tampoco en la viabilidad celular (p = 0.174 y 0.651 respectivamente) entre el sexo masculino y femenino en el grupo con anfotericina B (Tabla 2).
Se observó correlación débil negativa entre la edad y número de células, no significativa estadísticamente en ambos grupos sin y con anfotericina B (p = 0.445 y p = 0.320 respectivamente). Por otro lado, se detectó corre lación moderada positiva entre edad y viabilidad celular; sin embargo, no hubo diferencia significativa en ambos grupos (p = 0.064 y p = 0.103 respectivamente) (Tabla 3).
Tabla 3: Correlación entre la edad y el tiempo (horas) transcurrido desde la exodoncia con el número de células y la viabilidad celular en los grupos de medio de transporte con y sin anfotericina B.
| Edad | ||||
|---|---|---|---|---|
| Medio de transporte | ||||
| Sin anfotericina B | Con anfotericina B | |||
| Correlación | p | Correlación | p | |
| Número total de células | -0.205* | 0.445 | -0.257* | 0.320 |
| Viabilidad celular % | 0.473* | 0.064 | 0.409* | 0.103 |
| Tiempo (horas) transcurrido desde la exodoncia | ||||
| Número total de células | -0.534‡ | 0.034§ | -0.735‡ | 0.001§ |
| Viabilidad celular % | -0.489‡ | 0.055 | -0.306‡ | 0.233 |
* Correlación de Pearson; ‡ correlación de Spearman; § existe diferencia estadísticamente significativa a p < 0.05.
Respecto a la correlación entre el tiempo transcu rrido desde la exodoncia y el número de células hubo correlación negativa fuerte estadísticamente signifi cativa en ambos grupos, sin y con anfotericina B (p= 0.001 y p = 0.034 respectivamente). La correlación entre el tiempo transcurrido y la viabilidad celular también fue negativa de magnitud casi moderada, pero no significativa estadísticamente en ambos grupos (p = 0.055 y p = 0.233) (Tabla 3).
Discusión
En los resultados obtuvimos mayor cantidad de células en el grupo al cual se le adicionó anfotericina B, en comparación con el grupo que tuvo sólo los antibióticos PE-ST. El número promedio de células del grupo 2 fue mayor (2.73 x 106) que el grupo 1 (2.13 x 106). Es probable que la anfotericina B haya contribuido a mantener un medio de transporte con menor contaminación para la muestra, pudiendo conservarla mejor hasta el momento de ser procesada en el laboratorio. En investigaciones anteriores se han utilizado diferentes medios de transporte y fármacos (antibióticos y antifúngicos) en distintas concentraciones con el fin de mantener el medio lo menos contaminado posible. Algunos emplean sólo antibióticos como penicilina, estreptomicina, gentamicina.3-6 Yildirim y colaboradores utilizaron un medio de transporte de DPBS con los antibióticos PE-ST al 1%.5 Otros investigadores agregan antifúngicos como la anfotericina B. 3-6 Sin embargo, ninguno ha comparado los medios de transporte añadiendo diferentes fármacos. Se aplicó la prueba no paramétrica de U de Mann Whitney, y se observó que existe una diferencia estadísticamente significativa. Con eso concluimos que al agregar la anfotericina B al medio de transporte, se obtendrá mayor cantidad de células de la pulpa dental. No se ha podido comparar el número promedio de células que se obtuvieron en este estudio con investigaciones anteriores, ya que no mencionan el dato. 3-6
Con respecto al porcentaje de viabilidad, los resultados en el grupo que se transportó en medio con PE-ST más anfotericina B fue de 67.79%, en contraste con el grupo transportado en medio con sólo PE-ST que fue de 58.88%. A la prueba de U de Mann Whitney se obtuvo una diferencia significativa, lo que indica que se obtiene un porcentaje de viabilidad mayor al agregar el antifúngico en el medio de transporte. Esto es debido a que, incluyendo ambos fármacos (PE-ST + anfotericina B) existe un mayor espectro de actividad antibacteriana. En el estudio de Martín-Piedra y colaboradores transportaron las piezas dentales en un medio conformado por DMEM con PE-ST y anfotericina B, llegando a obtener un porcentaje de viabilidad > 75%.6 El resultado fue mayor que el de este estudio, la razón podría ser porque utilizaron DMEM en su medio de transporte, mientras que en esta investigación se utilizó solución de cloruro de sodio al 0.9%.
En este estudio se utilizó la pulpa dental de molares y premolares extraídas en pacientes entre 18 y 29 años. Para hallar la correlación entre el número total de células con respecto a la edad del donante se aplicó la prueba de correlación de Pearson. El resultado tuvo una tendencia de correlación negativa, es decir, que a mayor edad del donante, hay una ligera disminución del número de células de la pulpa dental. Sin embargo, el resultado fue estadísticamente no significativo. En el porcentaje de viabilidad celular con respecto a la edad la correlación fue positiva y el resultado fue estadísticamente no significativo. El resultado puede deberse a que se utilizó un rango de edad corto. Para poder corroborar los datos, el tamaño de la muestra debería ser mayor que el se obtuvo en este estudio y con un rango de edad más amplio. Según investigaciones anteriores que han considerado pacientes con diferentes rangos de edades, han obtenido buenos resultados de viabilidad celular. Por ejemplo, en el estudio que realizaron Horibe y su equipo utilizaron piezas dentales de pacientes de un grupo con un rango de edad de 19 a 30 años y otro grupo entre 40 y 70 años, observando que a mayor edad hay una ligera disminución en las características de viabilidad celular, aunque es muy similar a las características de viabilidad de los donantes jóvenes.7 Otros autores como Bressan que consideró donantes de 16 a 66 años y Kellner quien realizó un estudio con pacientes entre 12 y 30 años de edad, también llegaron a demostrar que existe una mínima alteración en las características de viabilidad de las células de la pulpa dental en relación con la edad del donante.8,9 Con los resultados de este estudio y las referencias, se concluye que es posible considerar los dientes de pacientes de diferentes edades de gran utilidad para las investigaciones de células de la pulpa dental.
El tiempo que transcurrió desde el momento de la exodoncia de la pieza dental hasta la obtención de la pulpa dental en el laboratorio fue en un intervalo de dos a 24 horas. Según los resultados, con respecto al tiempo transcurrido, se observó que hay una correlación negativa entre el tiempo y el número total de células, es decir, que mientras más tiempo pase, la cantidad de células irá disminuyendo. Con respecto al tiempo transcurrido y el porcentaje de viabilidad celular, también existe una correlación negativa, pero con un resultado estadísticamente no significativo. En forma similar, estos hallazgos fueron observados por Perry y colaboradores.10
Los resultados de la relación entre el número de células y la viabilidad celular, según el sexo del donante, fueron estadísticamente no significativos. No se encontraron estudios con el número total y viabilidad de células de la pulpa dental según la relación mencionada.
Éste es el primer estudio realizado para comparar la viabilidad celular y el número total de células de la pulpa dental en relación con el medio de transporte con y sin la adición del antifúngico anfotericina B. Los resultados de este estudio demostraron que al utilizar anfotericina B en el medio de transporte se consiguió mayor cantidad de células viables de la pulpa dental, las cuales se pueden emplear para realizar cultivos celulares y otros trabajos de ingeniería tisular. Este estudio contribuye a la optimización de protocolos en el transporte de piezas dentales para el posterior aislamiento de células de la pulpa dental. Por lo tanto, se sugiere emplear la anfotericina B en el medio de transporte.
