Introducción

En la práctica odontológica, uno de los retos que se presentan es la reposición de tejidos duros que se han perdido por lesiones, patologías o procedimientos quirúrgicos. Es por esto que la utilización de diferentes métodos regenerativos en defectos óseos ha sido un tema ampliamente estudiado en los últimos años, centrándose en la creación de nuevo hueso en las diferentes zonas que sean necesarias.¹,²

La regeneración ósea guiada (ROG) es un procedimiento terapéutico que consiste en inducir la regeneración de defectos óseos, más no la cicatrización.³ Se fundamenta en la utilización de sistemas de barreras mediante membranas que aíslan un determinado defecto óseo, se excluyen células provenientes del epitelio gingival y tejido conectivo que puedan interferir con el potencial osteogénico del tejido óseo correspondiente a la zona del defecto.¹ Es una técnica predecible y efectiva cuando se realiza previo análisis del caso.⁴ Para la aplicación de esta técnica son necesarios materiales que cumplan ciertos requisitos, tales como biocompatibilidad, oclusividad celular, generación de espacio, integración a los tejidos, fácil manipulación y que permanezcan el tiempo suficiente para permitir la proliferación celular.⁵

La hidroxiapatita (HA) es un biocristal formado por átomos de calcio, fósforo e hidrógeno, que funciona como material osteoconductor, y tiene alta biocompatibilidad y bioafinidad con los tejidos vivos. Hoy en día se considera el biomaterial más utilizado en ROG, debido a que representa junto con el colágeno tipo I, uno de los principales componentes del hueso. La HA no posee propiedades osteogénicas, ya que no estimula la formación de nuevo hueso; sin embargo, tiene propiedades osteoconductivas, ya que provee una matriz favorable para el depósito constante de nuevo hueso, debido a la capacidad de establecer intercambios químicos y de formar enlaces con el tejido vivo.⁶-¹⁰ Este material puede obtenerse por diversos métodos, entre los cuales se encuentra la precipitación química, que consiste principalmente en añadir una solución fosfatada a otra con iones de Ca++ en condiciones controladas. Las de origen cerámico están constituidas por partículas esféricas de alta densidad y gran pureza, se obtienen por calentamiento de los fosfatos cálcicos amorfos. El medio utilizado y las temperaturas a las que se elabora este tipo de hidroxiapatita son los factores determinantes de la estructura cristalina del material, así como la porosidad y la solubilidad; mientras que de manera natural, la HA se puede obtener de tres seres vivos: bovinos, corales y algas.⁶

La HA FOULA fue probada con anterioridad de manera in vitro, cumpliendo con la fase I y II durante un ensayo biológico in vitro. Sin embargo, hasta la fecha no se han realizado estudios in vivo mediante ensayos preclínicos en animales de experimentación con la finalidad de constatar su efectividad, prevenir y controlar posibles efectos tóxicos, además de evaluar la relación riesgo-beneficio de la misma; razón por la cual el objetivo de esta investigación fue determinar los parámetros histopatológicos en el proceso de re generación ósea guiada en defectos óseos creados en tibias de ratas BIOU: Wistar.

Metodología

Cumpliendo con los lineamientos del Código de Bioética y Bioseguridad, y contando con la aprobación del presente estudio en animales de experimentación por parte de la Comisión de Bioética del Bioterio de la Universidad de Los Andes (BIOULA) se seleccionaron 33 ratas macho adultas, de la cepa BIOU: Wistar, con un peso promedio entre 300-450 g. Se formaron dos grupos experimentales (15 animales en cada uno) para cada tipo de HA (FOULA y CORALINA); a su vez estos grupos se dividieron en subgrupos (cinco animales en cada uno), dependiendo del tiempo de sacrificio (tres, seis y nueve semanas); tres animales representaron el grupo control-control, con la finalidad de evaluar que los parámetros ambientales no influyeran con el desarrollo y resultado del estudio.

Procedimiento quirúrgico

Al inicio los animales fueron sedados con una inyección de 0.7 cm³ aproximadamente de una solución de ketamina (100 mg/kg), en asociación con xilacina (5 mg/kg) vía intraperitoneal, se probó el estado de sedación mediante punción en cola y patas para proceder a realizar rasurado y asepsia del área quirúrgica con solución yodada; posteriormente se llevó a cabo el marcaje de cada grupo y subgrupo mediante aros de colores en la cola. El color rojo representó la HA FOULA, mientras que los aros de color negro representaron la HA Coralina. El número de aros representó el tiempo en el cual el animal fue sacrificado, un aro a las tres semanas, dos aros a las seis semanas y tres aros a las nueve semanas.

Los animales se anestesiaron localmente en el área quirúrgica con 0.25 mL de roxicaína al 2% con epinefrina 1:80,000 unidades; con una hoja de bisturí No 15 estéril se realizó una incisión lineal en la cara interna del muslo y fueron separados los tejidos musculares con periostótomos (Legra P9) para descubrir la cara interna de la tibia de cada pata. A continuación, se empleó una fresa tallo largo troncocónica #702 a baja velocidad haciendo uso de un Mini Drill irrigación suficiente con solución fisiológica para la creación del defecto óseo con un área aproximada de 6.5 mm².

Los defectos óseos de las tibias derechas fueron rellenados con el tipo de hidroxiapatita correspondiente a cada grupo experimental «A» y «B», dejando el defecto óseo de la tibia izquierda libre de biomaterial para control fisiológico del proceso de regeneración ósea. Se limpiaron y suturaron las heridas musculares con sutura reabsorbible Vicryl® 4-0 y las heridas en piel con sutura no reabsorbible de Nylon 3-0 (Figura 1). Se administró medicación analgésica postoperatoria (meloxicam 1.0 mg/kg de peso, una vez al día por tres días, vía intramuscular) y antibiótica (lincomicina 0.015 mL aproximadamente, suministrada en dosis única, vía subcutánea) en dosis aproximada de 0.05 cm3 cada uno.

Fuente propia.

Figura 1: Procedimiento quirúrgico. A) Anestesia. B) Incisión. C) Creación del defecto óseo. D) Defecto creado. E) Implantación del biomaterial correspondiente dentro del mismo. F) Sutura en plano muscular y cutáneo. 

Se dio seguimiento clínico postquirúrgico a las tres, seis y nueve semanas, valorándose las condiciones del microambiente de las jaulas y parámetros clínicos de los animales, se procedió a la eutanasia de cinco animales de cada grupo en el orden temporal descrito con el fin de obtener las muestras necesarias que fueron inmersas en formol al 10% para su posterior estudio.

Procedimiento postquirúrgico

Para el estudio histopatológico de las muestras se consideraron 40 tibias, excluyéndose 15 muestras del control fisiológico debido a factores económicos, además existe conocimiento previo dentro de la línea de investigación de la fisiología normal del modelo animal seleccionado; de igual manera, fueron excluidas cinco muestras de tibias derechas por presencia de callo óseo.

Una vez obtenidas las muestras se procedió a realizar la inclusión en parafina y se efectuaron los cortes correspondientes. Los cortes fueron analizados con microscopia de luz de acuerdo con la escala modificada propuesta por Castillo,11 donde se toman en cuenta los indicadores: cuerpo extraño, tejido de granulación, osteoblastos, formación osteoide, osteocitos y hueso maduro, y fueron evaluados según la cantidad de células observadas por campo: ausente (0), escaso (< 5), moderado (5-10) y abundante (> 10). A continuación se estableció el nivel de regeneración ósea de acuerdo con los indicadores: nivel I (25%), nivel II (50%), nivel III (75%), nivel IV (100%) (Figura 2).

Fuente propia.

Figura 2: Cortes histológicos observados a 40x donde se evidencia: A) Muestra del Grupo B, tibia derecha, nivel I de regeneración ósea. B) Muestra del Grupo B, tibia derecha, nivel II de regeneración ósea. C) Muestra del Grupo A, tibia derecha, nivel III de regeneración ósea. D) Muestra del Grupo B, tibia izquierda, nivel IV de regeneración ósea. 

El análisis de los resultados se llevó a cabo desde un punto de vista comparativo tomando en cuenta los dos grupos experimentales (representados por cada tipo de HA) más el control fisiológico presente en cada uno. El procesamiento de los datos se reali zó con el programa estadístico SPSS para Windows, versión 2.0. Los datos fueron analizados mediante estadística descriptiva básica, utilizando distribución de frecuencias.

Resultados y discusión

Al analizar los cortes histológicos a la tercera semana, se observó que la mayoría de las muestras se ubicaron en el nivel II de regeneración ósea (Nivel II de RO) en ambos grupos, destacándose la presencia de tejido de granulación y ciertas zonas de mineralización osteoide. Sin embargo, la HA FOULA alcanzó el nivel III de RO en 60% de las muestras, con focos de mineralización osteoide en comparación con la HA Coralina cuyo porcentaje fue similar, pero ubicándose en el nivel II de RO (Figura 3).

Fuente propia.

Figura 3: Nivel de regeneración ósea a las tres semanas postquirúrgicas. 

La presencia de tejido de granulación coincide con lo expuesto por Harms,¹² el cual confirma que la presencia de vasos sanguíneos proporciona el suministro adecuado de sangre en el área afectada, paso previo a la actividad celular. Este hallazgo indica un equilibrio entre la resorción ósea y la formación de hueso durante el proceso de remodelación posterior a la implantación de los biomateriales, se observó formación de nueva matriz osteoide y neovascularización moderada alrededor de las partículas de hidroxiapatita dentro del defecto.

Asimismo, se pudo determinar que el uso de la HA FOULA influye de manera favorable en el proceso de RO, puesto a que a la tercera semana postimplantación las muestras evaluadas alcanzaron el nivel III de RO, mientras que las tibias que permanecieron libres de biomaterial se clasificaron en el nivel II de RO. En estas muestras se observó la presencia de tejido de granulación, con escasa formación de vasos sanguíneos, lo que coincide con Liao y colaboradores,¹³ que establecen que en el grupo de control el área del defecto permaneció notablemente llena de vasos sanguíneos e infiltrado inflamatorio, donde sólo se detectó una formación menor de hueso nuevo en el borde de los defectos.

A la sexta semana los cortes histológicos de las tibias derechas pertenecientes a ambos grupos experimentales mostraron predominio de células osteo-blásticas y centros de formación de osteoide (nivel III de RO).

Cabe destacar que las tibias derechas pertenecientes al grupo A fueron analizadas en su totalidad, ya que no se observó formación de callo óseo en las mismas, de tal manera que 100% (5/5) de las muestras alcanzó el nivel III de RO, mientras que en el grupo B se excluyó una tibia debido a la presencia de callo ubicándose 80% (4/5) de muestras en este nivel de RO. Se debe mencionar que el número de muestras de tibias izquierdas tomadas en cuenta para este subgrupo de estudio se redujo por las razones anteriormente señaladas, se excluyó un porcentaje considerable de las muestras: 40% (2/5) en el grupo A y 60% (3/5) en el grupo B (Figura 4).

Fuente propia.

Figura 4: Nivel de regeneración ósea a las seis semanas postquirúrgicas. 

En este periodo de evaluación se observó en ambos grupos experimentales (A y B) un incremento gradual en el porcentaje de regeneración, evidenciándose mayor cantidad de osteocitos en las muestras estudiadas, con disminución del número de osteoblastos por campo, lo cual indica maduración de la matriz osteoide previamente formada.

De igual forma, se evidenció en ambos grupos experimentales en las muestras correspondientes a las tibias derechas la presencia de escasas células osteo-clásticas, coincidiendo con lo expuesto por Harms¹² y Yépez y colaboradores,¹⁴ que establecieron que a las seis semanas comienza un proceso de reabsorción y aposición ósea alternado para la adaptación del hueso. De la misma manera, los resultados en este periodo de evaluación se asemejan a lo descrito por Martínez y su equipo,¹⁵ quienes hallaron a los 30 días postoperatorios en el grupo experimental un proceso de regeneración activo, que se caracterizó por la reabsorción de los bordes del defecto y la presencia de osteoblastos en el centro de la lesión.

Por otro lado, en algunas de las muestras pertenecientes a las tibias izquierdas se observó la formación de tejido conectivo fibroso, lo que coincidió de igual manera con lo expuesto por Harms.¹² Asimismo, Martínez y colaboradores¹⁵ obtuvieron resultados similares en las tibias del grupo control, detectaron reabsorción de los bordes del defecto y en su centro tejido condroide, colágeno y fibroblastos con formación de tejido osteoide, caracterizado por el mayor número de osteoblastos y menor cantidad de osteocitos.

Es necesario destacar que el nivel III de regenera ción ósea con la HA Coralina fue alcanzado a las seis semanas, mientras que con la HA FOULA se alcanzó este nivel de regeneración a las tres semanas y se mantuvo hasta las seis semanas postquirúrgicas.

En el último periodo de evaluación a las nueve semanas postoperatorias se observó un predominio de focos de mineralización osteoide con predominio de células osteoblásticas, llenando la mayor parte del defecto, se clasificó como nivel III en ambos grupos experimentales grupo A (HA FOULA) y grupo B (HA Coralina).

Sin embargo, en 80% de los cortes histológicos correspondientes a las tibias derechas del grupo B se evidenció la formación de hueso maduro ubicándose en el nivel IV de regeneración ósea con mineralización de gran parte del defecto óseo, similar al hueso sano. Con respecto a las tibias izquierdas se redujo el número de muestras estudiadas, notándose la presencia de callo óseo en 40% de las tibias del grupo B (2/5); no obstante, en las muestras valoradas se apreciaron focos de mineralización osteoide, que se clasificaron como nivel III con respecto a la escala establecida (Figura 5). Nitin y su equipo¹⁸ obtienen resultados similares en el periodo de evaluación de la séptima y octava semanas postoperatorias, cuando observan en el grupo experimental que el tejido de granulación migra de la periferia a la región central del andamio; asimismo, detectaron que las estructuras óseas previamente formadas crecieron y comenzaron a conectarse, aumentando la cantidad de hueso recién formado.

Fuente propia.

Figura 5: Nivel de regeneración ósea a las nueve semanas postquirúrgicas. 

A la novena semana de estudio en las muestras pertenecientes al grupo experimental B se observó la presencia de canales de Havers ya formados. De acuerdo con esto, se establece concordancia con el estudio realizado por Xiong y colaboradores¹⁶ donde la cantidad de nuevo hueso y cristales de calcio incrementó a las cuatro y ocho semanas, produciéndose la maduración continua del nuevo hueso. De igual manera, los resultados de este estudio coinciden con la investigación de Domínguez y colegas,¹⁷ en la que a las ocho semanas postoperatorias en el grupo control se detectó matriz extracelular granular, sobre la cual se localiza un número reducido de osteocitos en comparación con el grupo al que le fue implantado el biomaterial, por otra parte en el grupo experimental se observó la presencia de matriz extracelular conformada por láminas de osteocitos maduros. La cavidad remanente que queda posterior a un tratamiento quirúrgico debe obturarse de preferencia con materiales de origen autólogo para que sean las células madre las que lleven a cabo los procesos de osteoinducción y osteconducción, garantizando la morfología y densidad ósea del área del defecto. Pero este tratamiento se ve limitado debido a la disponibilidad y la morbilidad del área donante, cantidades insuficientes de material y resorción incontrolada.²,¹⁸,¹⁹ En consecuencia, diversos biomateriales se presentan actualmente en el mercado para regeneración ósea guiada, destacando entre ellos la HA.

En este estudio se establece una relación de con cordancia en el porcentaje de RO haciendo uso de un biomaterial; y se demuestra que el biomaterial HA es un excelente osteoconductor, puesto que al ser implantado en defectos óseos de animales de experimentación actúa como relleno y andamio para acelerar la actividad celular en pro de la regeneración ósea, demostrando excelentes resultados en cuanto a la tolerancia, biocompatibilidad y osteoin tegración, pues actúa como barrera para evitar la invaginación de tejidos blandos.⁷,²⁰,²¹ Sin embargo, es necesario señalar que es recomendable la combi nación de HA con otros biomateriales para alcanzar mejores resultados.⁵,²²-²⁴

Conclusión

Se demostró que la HA FOULA resulta eficaz en el proceso de regeneración ósea en defectos creados en tibias de ratas BIOU: Wistar, ya que promueve la formación de nuevo hueso en menor tiempo, comparada con la regeneración fisiológica. De igual forma, se observó que la HA FOULA aceleró el proceso de RO de los defectos durante el primer periodo de evaluación (tres semanas postquirúrgicas), en comparación con el control fisiológico y control comercial.

Se recomienda delimitar el área del defecto óseo mediante el uso de tinta china para facilitar su ubicación durante la evaluación histopatológica.