Material vegetal

Los frutos maduros de Hylocereus undatus, se obtuvieron del rancho “Las Pitahayas” ubicado en el municipio de Suchiapa, Chiapas (16° 45’ 39.23” latitud N y 93° 07’ 38.23” longitud O), los cuales se cosecharon entre los 35 y 45 días después de la fructificación. Posteriormente, la investigación se realizó en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales del Tecnológico Nacional de México, campus Tuxtla Gutiérrez, Chiapas.

Desinfección de semillas

Las semillas se extrajeron de frutos maduros, utilizando pinzas de disección, obteniendo un total de 720 semillas, estas fueron colocadas en un frasco de vidrio y almacenadas de acuerdo con ^{Mc Caughey-Espinoza et al. (2018)}. Posteriormente, las semillas fueron separadas de forma aleatoria en cuatro grupos de 180 semillas, las cuales se dividieron según el protocolo de desinfección a evaluar. Para la desinfección de las semillas de Hylocereus undatus se evaluaron cuatro protocolos en una campana de flujo laminar:

Protocolo 1: Las semillas fueron sumergidas, bajo agitación constante, en una solución de etanol al 70 % (v/v) durante 10 min. Posteriormente, se realizaron tres lavados con agua destilada estéril durante tres minutos cada uno.

Protocolo 2: Las semillas se sumergieron, bajo agitación constante, en una solución de NaClO al 50 % (v/v) durante 10 minutos. Posteriormente, se realizaron tres lavados con agua destilada estéril durante tres min cada uno.

Protocolo 3: Las semillas fueron sumergidas, bajo agitación constante, en una solución de etanol al 70 % (v/v) durante 5 min. Posteriormente, se realizaron tres lavados con agua destilada estéril durante tres min cada uno. Finalmente, las semillas fueron sumergidas en una solución de NaClO al 50 % (v/v) durante 10 min y después de este tiempo se realizaron tres lavados con agua destilada estéril durante tres min cada uno.

Protocolo 4: Las semillas fueron sumergidas, bajo agitación constante, en una solución NaClO al 50 % (v/v) durante 15 min. Posteriormente, se realizaron tres lavados con agua destilada estéril durante tres min cada uno.

Una vez realizados los protocolos de desinfección, se colocaron 5 semillas en frascos de cultivo con medio MS (^{Murashige y Skoog, 1962}) al 50 % de sales, suplementado con 30 g/L de sacarosa y 2.5 g/L de fitagel, el pH se ajustó a 5.7 y se incubaron en una cámara bioclimática a una temperatura de 23±2 °C, con un fotoperiodo de 16 h a una intensidad lumínica de 35 µmol m²s^-1. Después de 30 d, las variables de respuesta evaluadas fueron el porcentaje de desinfección y el porcentaje de germinación obtenidos con la ecuación 1 y 2, respectivamente.

Donde:

N= número total de semillas empleadas.

n= número de semillas contaminadas.

Donde:

A= número total de semillas empleadas.

B= número de semillas germinadas.

Inducción de brotes

Después de 90 días de crecimiento, las vitro plántulas obtenidas se emplearon como material vegetal para la inducción de brotes. Para ello, se evaluaron explantes de cotiledón, hipocótilo y tallo, los cuales se establecieron en medio MS al 100 % de sales, suplementado con 30 g/L de sacarosa, 2.5 g/L de fitagel, con los reguladores de crecimiento ácido naftalenacético (ANA), bencilaminopurina (BAP) y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a concentraciones de 0 y 2 mg/L (Tabla 1), el pH se ajustó a 5.7 y finalmente se incubaron en cámara bioclimática a una temperatura de 23±2 °C, con un fotoperiodo de 16 h a una intensidad lumínica de 35 µmol m²s^-1. Cada unidad experimental contenía 4 explantes y cada tratamiento se realizó por triplicado. En el tratamiento control, los explantes se cultivaron en medio MS sin reguladores de crecimiento vegetal. Después de 60 días de incubación, la variable de respuesta evaluada fue el número de brotes por explante.

Aclimatación de plántulas

Después de 60 días, los brotes obtenidos fueron subcultivados en frascos de cultivo con medio MS al 50% de sales, suplementado con 30 g/L de sacarosa y 2.5 g/L de fitagel. Se incubaron en una cámara bioclimática a una temperatura de 23±2 °C, con un fotoperiodo de 16 h a una intensidad lumínica de 35 µmol m²s^-1. Después de 30 días de incubación, las plántulas completamente enraizadas fueron retiradas de los frascos y se lavaron con agua corriente del grifo, eliminando el medio de cultivo adherido a las raíces. Posteriormente, las plántulas fueron sumergidas en una solución de Captan y Agrimycin® al 2 % (p/v), durante 10 min con agitación constante como método preventivo contra microorganismos (^{Santiz et al., 2012}; ^{Valencia-Botín et al., 2013}). Posteriormente, las plántulas fueron sembradas en recipientes de polietileno de 500 mL que contenían Perlita y Peat moss®, en una relación de 2:1 respectivamente, como sustrato. A los recipientes se les colocó una cubierta de polietileno de 1000 mL, para evitar la pérdida de humedad por evaporación. Las plántulas se mantuvieron en invernadero al 50 % de iluminación con malla sombra, se mantuvo una humedad relativa mayor al 75 % y una temperatura de 26.5 ±3 °C. Las cubiertas de polietileno fueron retiradas después de 15 días. Se aplicaron 50 mL de agua destilada por planta cada semana. Después de 30 días de crecimiento se evaluó el porcentaje de supervivencia.

Diseño experimental y análisis estadístico

Los experimentos se llevaron a cabo bajo un diseño experimental multifactorial con tres repeticiones por cada unidad experimental. En donde, los factores evaluados fueron los reguladores de crecimiento, ácido naftalenacético (ANA), bencilaminopurina (BAP) y ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y los niveles empleados fueron las concentraciones de 0 y 2 mg/L. Se realizó un ANOVA simple para determinar los efectos de las interacciones entre los niveles de los factores y un ANOVA multifactorial para establecer el efecto de cada factor y cada nivel. Las medias se compararon mediante la prueba Tukey (p≤0.05) con la ayuda del software estadístico Statgraphics Centurion versión XVII.

Desinfección de semillas

Con respecto a la desinfección de semillas, los protocolos 2, 3 y 4 lograron mantener el 100 % de asepsia en el medio de cultivo, en contraste con el protocolo 1, donde se alcanzó 81.48 % de desinfección (Tabla 2). Sin embargo, este porcentaje de desinfección sigue siendo efectivo, lo cual podría deberse a la facilidad con que las soluciones desinfectantes pueden alcanzar toda la superficie de la semilla, dado su superficie lisa y sin poros. Estos resultados concuerdan con los reportados por ^{Kasim et al. (2016)}, quienes evaluaron el efecto del potencial del medio MS y la concentración de la solución desinfectante de NaClO sobre el porcentaje de desinfección y germinación, en donde obtuvieron el 99 % de germinación con una solución al 5.25 % de NaClO. Se ha reportado que el uso de lejía doméstica o cloro comercial local que contenga un 3.5 % (p/v) de hipoclorito de sodio sobre la desinfección de explantes, es uno de los métodos más simples, eficaces y económicos. De acuerdo con ^{Oyebanji et al. (2009)}, una solución de NaClO al 3.5 % (p/v) es eficaz como esterilizante sobre la superficie de semillas de Oryza sativa y Sorghum bicolor, produciendo el mayor porcentaje de desinfección bacteriana y fúngica del 100 % durante una exposición de 20 a 45 min.

Germinación de semillas

Después de 14 días de la desinfección de las semillas y el establecimiento en el medio de cultivo, el mayor porcentaje de germinación fue de 85.0 % (p≤0.05) cuando las semillas se trataron con NaClO durante 10 min (protocolo 2), el cual tuvo diferencia estadísticamente significativa con respecto a los demás tratamientos, mientras que las semillas tratadas con etanol al 70 % durante 10 min (protocolo 1) presentaron un 29.6 % de germinación (Tabla 2). Estos resultados son similares a los obtenidos por ^{Kasim et al. (2016)}, quienes obtuvieron un 99 % de germinación en semillas de Hylocereus polyrhizus después de dos semanas posteriores a la desinfección utilizando una solución al 0.788 % de NaClO durante 15 min. Por otra parte, se observó que los protocolos en donde se empleó exclusivamente NaClO al 50 % (v/v), disminuyó el porcentaje de germinación del 85.2 % (protocolo 2) hasta el 66.7 % (protocolo 4) a medida que aumentaba el tiempo de inmersión de las semillas, durante 10 y 15 minutos de inmersión, respectivamente. Este efecto negativo en la germinación por el incremento del tiempo de exposición, de acuerdo con ^{Oyebanji et al. (2009)} puede ser ocasionado por el NaClO que es un agente oxidante fuerte y su acción puede resultar tóxica para las semillas si se les expone por un período prolongado. A medida que aumenta el tiempo de inmersión en NaClO, la concentración de cloro activo en contacto con la semilla aumenta, lo que puede dañar las membranas celulares, el tejido interno de la semilla o las estructuras germinativas como el embrión, reduciendo su viabilidad y capacidad de germinar. En cuanto al protocolo 3, en el cual empleó etanol al 70 % (v/v) así como NaClO al 50 % (v/v), se obtuvo un porcentaje de germinación del 37 %. Estos resultados son correspondientes a los obtenidos por ^{Sheng et al. (2016)}, quienes evaluaron un protocolo de desinfección que consistía en el empleo de dos soluciones desinfectantes (etanol al 70 %, Clorox® al 1 % y Tween 20) en semillas de Hylocereus costaricensis.

De acuerdo con ^{Quiala et al. (2009)}, las semillas de Hylocereus undatus al ser de tamaño pequeño (≈ 2 mm y ≈0.003 g en masa fresca) con una textura dura y plana, limitan la superficie de adherencia de los microorganismos y por otra parte facilita el buen contacto en la testa y la desinfección. Durante la formación de las semillas, los embriones y los tejidos asociados tienden a excluir patógenos y materiales extraños que pueden estar en la planta madre a través de la migración pasiva. Por lo tanto, las semillas de frutos libres de insectos y enfermedades, permiten el fácil establecimiento de plantas asépticas, que pueden servir como material experimental (^{Mineo, 1990}). Por ello, es importante el empleo de semillas como material vegetal ya que al germinar bajo condiciones in vitro permiten la inducción de callos, la regeneración de múltiples brotes y otros procesos morfogénicos importantes en la producción de metabolitos (^{Kasim et al., 2019}; ^{Reyes-Martínez et al., 2019}). Por otro lado, el requerimiento de nutrientes no se considera esencial durante la germinación, por lo que la concentración de sales en el medio MS puede reducirse para incrementar la germinación de las semillas y evitar problemas de hiperhidricidad. Los resultados obtenidos en la germinación de las semillas Hylocereus undatus son correspondientes a lo reportado utilizando el medio MS al 50 % de sales en especies como Hylocereus polyrhizus (^{Kasim et al., 2016}) e Hylocereus costaricensis (^{Mahmod et al., 2021}).

Inducción de brotes en Hylocereus undatus

Después de 60 días, los explantes de tallos indujeron el mayor número brotes (15.11) cuando se empleó 2 mg/L de BAP mostrando diferencia estadística significativa (p≤0.05) comparado con los demás tratamientos (Figura 1C). De igual forma, los explantes de tallos presentaron la formación de brotes cuando se empleó la combinación de ANA y BAP a 2 mg/L (Figura 1D), pero el número de brotes se redujo cuando se empleó únicamente 2 mg/L de ANA (Figura 1B). Mientras que los explantes de cotiledón indujeron brotes únicamente cuando se empleó 2 mg/L de ANA (Figura 1A). Finalmente, los explantes de hipocótilos no indujeron brotes en ninguno de los tratamientos evaluados y el empleo de 2,4-D no mostró respuesta en la regeneración de brotes en ningún tipo de explante (Tabla 3). Estos resultados son correspondientes a lo reportado en especies de cactáceas como Opuntia ficus-indica donde el balance auxina-citoquinina juega un papel importante en la inducción de brotes mediante organogénesis directa (^{Bougdaoua y El Mtili, 2020}), así como el empleo de ANA y BAP para incrementar la inducción de brotes en cactáceas (^{Rodríguez y Ramírez-Pantoja, 2020}). Finalmente, también se ha reportado el incremento en la inducción de brotes en cactáceas cuando se emplea únicamente BAP a concentraciones elevadas (^{El Finti et al., 2010}), lo que corrobora los resultados obtenidos en Hylocereus undatus, donde la adición de BAP también mostró una eficacia significativamente mayor en la regeneración de brotes en explantes de tallo.

Figura 1 Efecto de los reguladores de crecimiento sobre la inducción de brotes en Hylocereus undatus. A) explante de cotiledón con 2 mg/L de ANA, B) explante de tallo con 2 mg/L de ANA, C) explante de tallo con 2 mg/L de BAP y D) explante de tallo con 2 mg/L de ANA y BAP. Barra de escala= 3 cm. 

Figure 1: Effect of growth regulators on shoot induction in Hylocereus undatus. A) cotyledon explant with 2 mg/L of ANA, B) stem explant with 2 mg/L of ANA, C) stem explant with 2 mg/L of BAP and D) stem explant with 2 mg/L of ANA and BAP. Scale bar= 3 cm.  

Aclimatación de plántulas

La aclimatación es una etapa crítica en la propagación, donde las plántulas deben adaptarse a condiciones ex vitro. En este estudio se obtuvo una tasa de supervivencia del 90 % después de 30 d iniciada la aclimatación (Figura 2). Estos resultados son correspondientes a lo reportado por ^{Viñas et al. (2012)} en Hylocereus costaricensis, donde las plántulas tratadas con un régimen de aclimatación similar mostraron una tasa de supervivencia del 96 %. Esto sugiere que los métodos de aclimatación empleados, incluyendo el uso de Perlita y Peat moss® como sustrato y el tratamiento con Captan y Agrimycin®, son efectivos para asegurar la supervivencia de las plántulas en condiciones ex vitro. Además, uno de los factores importantes durante la aclimatación de especies con metabolismo CAM es la presencia endógena de auxinas lo que promueve la inducción de raíces de forma espontánea sin la adición de reguladores de crecimiento e incrementa la asimilación de nutrientes durante la aclimatación a nivel invernadero (^{Santiz et al., 2012}).

Figura 2 Plántulas de Hylocereus undatus después de 30 días de aclimatación a nivel invernadero.  

Figure 2: Hylocereus undatus plants after 30 days of acclimatization in a greenhouse.