Material biológico

Frutos de maracuyá en su punto óptimo de madurez de consumo, fueron obtenidos del poblado El Venado, perteneciente al municipio de Ruiz en el estado de Nayarit, México (22° 10’ y 21° 52’). Se emplearon 15 kg del fruto para el estudio seleccionados con similar coloración y tamaño.

Reactivos químicos

Hipoclorito de sodio (NaClO), agar soya tripticasa, rifampicina, estándares de referencia; de linalool, 1-octanol, 1-hexanol, α-terpineol fueron adquiridos de Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Hexanoato de etilo, butanoato de hexilo y hexanoato de hexilo fueron adquiridos de Bedoukian Research, Inc. (Danbury, CT).

Obtención de jugo de maracuyá

Los frutos fueron lavados y desinfectados por inmersión durante 2 min en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 0.02%. La pulpa fue separada de las semillas utilizando un tamiz flexible, posteriormente se centrifugó a 3380 g durante 5 min (Centrifuga HermLe, Z326K, Wehingen, Alemania), el sobrenadante fue recuperado y almacenado en recipientes estériles.

Inoculación del jugo

Las muestras fueron inoculadas con E. coli O157:H7 código ATCC 25922, previamente desarrollada en agar de soya tripticasa adicionado con rifampicina (0.05 µg/mL) antibiótico al que resistente esta bacteria y así inhibir el crecimiento de otras bacterias. Posteriormente, fue suspendida en solución salina isotónica de acuerdo a ^{Castro-Rosas et al. (2012)} con algunas modificaciones. Antes de la inoculación se realizaron diluciones con agua destilada y conteos en cámara de Neubauer hasta ajustar la concentración a 1x10⁶ UFC/mL. Las muestras de 30 mL inoculadas con E. coli O157:H7 a 1x10⁶ UFC/mL se sometieron al tratamiento de altas presiones, por triplicado, empleando la prensa isostática fría modelo CIP 42260 (Avure Autoclave Systems, Columbus, OH, USA) equipada con una cámara de presurización de 101.6 mm de diámetro interno y 584.2 mm de profundidad. Se utilizó una mezcla de 5:1 agua:lubricante antiabrasivo (Hydrolubric 120-B, Houghton International Inc., Valley Forge, PA, USA) como fluido presurizante.

Caracterización fisicoquímica

Medición de pH

El pH se determinó a 25 °C empleando un potenciómetro multiparamétrico (Hanna, HI 2550, RI, USA). El equipo se calibró previamente a su uso. Se introdujo el electrodo en el jugo y se registró el pH al obtener una lectura estable.

Análisis de compuestos volátiles por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)

El estudio del perfil volátil se llevó a cabo empleando la técnica de microextracción en fase sólida de espacio de cabeza (HS-SPME) y cromatografía de gases (GC 7890A, Agilent Technologies; Palo Alto, CA, USA) acoplada a espectrometría de masas (MS 240 Ion Trap, Agilent Technologies; Palo Alto, CA, USA). En un vial de 20 mL se colocaron 10 mL de jugo, 30 μL de 2-nonanol (0.03288 mg/mL en etanol) como estándar interno y se adicionó 1 g de NaCl como promotor de la volatilidad. El vial se selló herméticamente con una septa de silicón-PTFE (politetrafluoroetileno) y se incubó (40 °C, 30 min, 700 rpm) para la pre-extracción y concentración de los compuestos volátiles (CV) en el espacio de cabeza del vial. Posteriormente se introdujo una fibra recubierta con Divinilbenceno/Carboxeno/Polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS, 50/30 µm, Supelco, Bellefonte, PA, USA) y se expuso en el espacio de cabeza del vial a 1 cm por encima de la superficie del jugo para la extracción de los CV (40 °C, 20 min, 700 rpm). Finalmente se retrajo la fibra y retiró del vial. La desorción térmica de los volátiles de la fibra se realizó exponiéndola durante 4 min en el puerto de inyección del cromatógrafo de gases. La separación de los compuestos se realizó con una columna capilar Agilent J&W VF-5ms (30 m, 0.25 mm d.i., 0.25 µm) y helio como gas acarreador (1 mL/min). La temperatura del inyector fue de 230 °C en modo splitless. El horno se programó inicialmente a 40 °C (3 min) hasta 240 °C a 5 °C/min. Los parámetros del MS fueron: energía de ionización (70 eV), temperatura de trampa (150 °C), acarreador (80 °C) y línea de transferencia (130 °C). El rango de adquisición de masas fue de 35 a 350 m/z. La identificación y cuantificación de los compuestos volátiles se realizó comparando los índices de retención lineal calculados con una mezcla de n-alcanos (C₇-C₃₀) de los estándares de referencia de los compuestos y el espectro de masas en bases de datos NIST.

Análisis de E. coli O157:H7 en jugo de maracuyá

Se realizó el recuento de microorganismos de todas las muestras antes y después del tratamiento con altas presiones, así como durante 72 h de almacenamiento; mediante la técnica de vertido en placa empleando agar soya tripticasa adicionado con rifampicina en una concentración de 0.05 µg/mL, incubado por 48 h a 38 °C.

Análisis estadístico

El estudio se llevó a cabo mediante un diseño factorial 3³ completamente aleatorizado evaluando temperatura (25, 35, 45 °C), presión (150, 200, 250 MPa) y tiempo (0, 10, 20 min) como factores. Los tratamientos y extracciones se realizaron por triplicado. Un ANOVA se empleó para analizar los datos y la comparación de medias mediante la técnica de diferencias mínimas significativas de Fisher, con el software SAS System 9.0. La optimización de las condiciones de operación se realizó empleando un modelo cuadrático con el software Statgraphics Centurión versión XV.

Cambios en propiedades fisicoquímicas después del tratamiento con APH

El pH y SST del jugo de maracuyá fresco y su comportamiento posterior al tratamiento de APH no presentaron diferencia significativa (p > 0.05) entre los tratamientos ni respecto al control (Figura 1). En ese sentido, los resultados concuerdan con lo reportado en jugo de zanahoria con naranja tratados con APH entre 200 y 400 MPa sin afectaciones de los valores de pH durante 1 a 5 min, los cuales fueron adecuados para garantizar la estabilidad del jugo sin afectar su composición fisicoquímica ni su calidad sensorial (^{Pokhrel et al., 2022}). Además, los valores obtenidos de STT (Figura 1) están de acuerdo a lo reportado por ^{Pokhrel et al. (2022)}, al no presentar variaciones significativas en esta variable (p > 0.05) durante la aplicación de la APH y el almacenamiento (> 28 días) de las muestras presurizadas. De forma similar, al aplicar 600 MPa durante 6 min, no se reportaron cambios en pH y SST en jugo de caña de azúcar (^{Mukhtar et al., 2022}). Este comportamiento pudiera atribuirse a que las APH no afectan los enlaces covalentes moleculares (^{Sangronis et al., 1997}) presentes en los carbohidratos simples y disacáridos, manteniendo sin cambios el contenido de sólidos solubles en el jugo.

Figura 1 Efecto de las APH ((150, ( 200 y (250 MPa) sobre SST y pH del jugo de maracuyá tratado.  

Figure 1 Effect of HHP ((150, ( 200 and (250 MPa) on TSS and pH of treated passion fruit juice. 

Efecto sobre la calidad aromática

El estudio del efecto de las APH sobre la calidad aromática se enfocó en 7 compuestos de aroma (CA) (Tabla 1), los cuales han sido reportados como los principales en maracuyá. ^{Jordan et al. (2000)} reportaron que los compuestos más abundantes en el fruto son algunos alcoholes alifáticos insaturados tales como linalool, caracterizado por contribuir a las notas floral, cítrica y de limón en el fruto; 1-octanol, aporta la nota cítrica y verde; 1-hexanol con nota herbácea y dulce y α-terpineol con nota floral. Recientemente se identificaron los compuestos mayoritarios en maracuyá como butenoato de metilo, butanoato de etilo, hexenoato de metilo y hexenoato de etilo (^{Mamede et al., 2017}).

El análisis de varianza para los principales compuestos aromáticos, muestra que no hubo efecto significativo de la presión ni del tiempo de tratamiento sobre la concentración de los compuestos aromáticos analizados (P > 0.05); sin embargo, la temperatura mostró un efecto estadísticamente significativo (P = 0.001) sobre la concentración de los principales CA presentes en el jugo de fruto de maracuyá sometido al tratamiento con APH. Este efecto sobre el jugo de maracuyá se manifiesta en la Figura 2, donde se observa la disminución de la concentración de la mayoría de los compuestos aromáticos conforme la temperatura aumenta. Es importante mencionar que a pesar de la disminución observada en la concentración a 25 y 35 °C, esta diferencia no fue estadísticamente significativa de acuerdo a la comparación de medias (LDS, resultados no mostrados). Estos resultados coinciden con lo reportado por ^{Calderón-Santoyo et al. (2019)} quienes estudiaron el efecto de las altas presiones sobre los componentes volátiles en néctar de mango, concluyendo una disminución de etanol y α-pineno a 250 MPa, 25 °C y 10 min, sin embargo, no se presentó un efecto significativamente negativo sobre el perfil aromático de la mayoría de los compuestos del néctar de mango.

Figura 2 Cromatograma de jugo de maracuyá sin tratar (() y tratado a 200 MPa, 10 min y diferentes temperaturas ((25, (35 y (45 °C).  

Figure 2 Chromatographs of passion fruit juice without treatment (() and treated at 200 MPa, 10 min and different temperatures ((25, (35 and (45 ºC). 

Es ampliamente conocido que la temperatura afecta la concentración de componentes volátiles en la calidad aromática de los jugos, debido, entre otros factores, a que el aumento de la temperatura disminuye la capacidad de retención de las sustancias volátiles en una matriz o sustrato, así mismo, puede promover interacciones con otros componentes, principalmente el oxígeno, provocando la formación de derivados de los CA originales. La no alteración del sabor del alimento puede explicarse considerando que las altas presiones no modifican los enlaces covalentes en los compuestos del sabor (^{Lomelí-Martín et al., 2021}).

Diversos estudios han realizado análisis químicos y sensoriales en algunos alimentos como manzana (^{Porębska et al., 2017}), granada (^{Benjamin y Gamrasni, 2020}) y jugo de aronia (^{Błaszcza et al., 2017}), mismos que han sido tratados a presiones que varían desde 200 hasta 600 MPa a temperatura ambiente, sin reportar alteraciones significativas en la calidad aromática.

Efecto sobre la supervivencia de E. coli O157:H7

Las altas presiones inducen cambios de tipo morfológico y bioquímico que tienen lugar en la membrana y la pared celular de los microorganismos. Además, provocan cambios en el funcionamiento de enzimas esenciales para el crecimiento y reproducción de los microorganismos (^{Gohrbandt et al., 2022}). Los resultados mostrados en la Tabla 2 sugieren que algunos de estos cambios influyeron en el efecto letal de las altas presiones a partir de 150 MPa y 35 °C o bien a 200 MPa y 25 °C. Estos resultados están de acuerdo a lo reportado en cepas de E. coli O157:H7 tratadas con APH a partir de los 150 MPa hasta los 550 MPa, por lo tanto, se puede mejorar la seguridad alimentaria sin comprometer la calidad del producto (^{Yang et al., 2023}). En ese sentido, algunos estudios demuestran que las bacterias son más resistentes a la presión a 20 y 30 °C, pero se vuelven extremadamente sensibles a partir de temperaturas de 35 °C a causa de los cambios de fase de los lípidos de la membrana (^{Gohrbandt et al., 2022}), manifestando un efecto de la presión y la temperatura sobre la viabilidad de las bacterias. Es importante mencionar que bajo las condiciones menos severas empleadas en este estudio (150 MPa y 25 °C), no se encontró una total inhibición de E. coli logrando sólo reducciones que van de 2.56 hasta 4.36 log₁₀ UFC/mL al momento de la aplicación del proceso y el efecto incrementó durante al almacenamiento. Lo anterior indica que la viabilidad de E. coli O157:H7 fue sensiblemente afectada conforme incrementó la severidad de los tratamientos, así también, se puede aseverar, a partir de los datos de viabilidad de E. coli, que conforme transcurren los días de almacenamiento el daño ocasionado a la bacteria por el proceso de presurización es irreversible y le impide sobrevivir en el jugo de maracuyá. ^{Prieto-Calvo et al. (2014)} utilizando presiones entre 50 - 900 MPa encontraron daños irreversibles en la membrana celular en E. coli produciendo pérdida de viabilidad. Adicionalmente, la aplicación de presión en tiempos cortos, genera significativamente daños en la estructura e integridad de membrana en E. coli de acuerdo a lo observado en SEM en donde se identifica una mayor pérdida de componentes intracelulares por el daño a la membrana (^{Yang et al., 2023}).

Así mismo, ^{Carvalho et al. (2018)} encontraron una reducción en la viabilidad de E. coli O157:H7 931 de 5 log₁₀ aplicando una presión de 300 MPa durante 15 min en jugo de guayaba y 4.2 log₁₀ en jugo de mango. Por otro lado, se puede apreciar un comportamiento similar aplicando 200 MPa durante 15 min en jugo de aronia para la inhibición de levaduras y mohos después de presurizar en comparación con muestras sin tratamiento (^{Błaszczak et al., 2017}).

Por lo tanto, las APH resultan ser una tecnología eficaz en la inhibición de patógenos en bebidas como jugos. En ese sentido ^{Kim et al. (2024)}, afirman que la perdida de viabilidad de microorganismos patógenos a los alimentos, tales como E. coli O157:H7, se ve incrementada a valores de pH < 4 debido a la presencia de ácidos orgánicos como el ácido cítrico; con este estudio se hace evidente que las altas presiones hidrostáticas en combinación con temperatura moderada y un medio acidificado, puede ser un método efectivo para inhibir microorganismos tanto resistentes como sensibles a la presión, así como los patógenos reconocidos en alimentos. En el caso del jugo de maracuyá, empleado en este estudio, su pH natural es de 3.4 lo que explica el efecto favorable de la APH sobre la inactivación de E. coli O157:H7. La variabilidad de estos resultados se debe a la combinación de diversos factores incluyendo la composición propia de las muestras. Se ha demostrado que un pH bajo, aumenta la inactivación de microorganismos significativamente de Listeria monocytogenes en 2 min a 500 MPa a pH de 4.5. Además, al incrementar el tiempo con un pH mayor a 5 la inactivación es más lenta (^{Jung et al., 2013}). Por lo tanto, para inhibir microorganismos en matrices a pH bajos, se requiere menor tiempo.

Optimización del proceso

En la Figura 3 se muestra la gráfica de superficie de respuesta obtenida en base a las concentraciones de los principales compuestos aromáticos y la disminución de viabilidad de E. coli O157:H7 y la interacción de los tres como variable de respuesta en el análisis del diseño experimental. Se puede observar claramente, que la mayor deseabilidad se obtiene a valores de presión elevados y temperaturas bajas en cortos periodos de proceso. Las condiciones óptimas de operación para este proceso resultaron ser 200 MPa, 35 °C y 10 min, con las que de acuerdo al análisis de superficie de respuesta se obtendrían un jugo libre de E. coli O157:H7 y sin cambios significativos en su composición aromática (Tabla 3). Resultados similares de optimización se obtuvieron en néctar de mango para la inhibición de E. coli O157:H7 con 250 MPa, 36.15 °C y 14.08 min manteniendo los compuestos aromáticos e incluso manteniendo el sabor y olor (^{Calderón-Santoyo et al., 2019}).

Figura 3 Gráfico de superficie de respuesta para los principales compuestos aromáticos y reducción logarítmica en el jugo de maracuyá tratado por APH.  

Figure 3 Response surface plot for the main aroma compounds and log reduction in the passion fruit juice treated by HHP.