Introducción

La naturaleza fitopatógena de los hongos depende en gran medida de su capacidad y modo de interactuar con el organismo huésped. En este sentido, existe una clasificación que delimita tres grupos representativos distintos, que son: fitopatógenos biotróficos, necrotróficos y hemibiotróficos (^{Meinhardt et al., 2014}). Moniliophthora roreri se considera un hongo basidiomiceto fitopatógeno perteneciente a la familia Marasmiaceae del orden Agaricales (^{Aime y Phillips-Mora, 2005}). El organismo se caracteriza por atacar únicamente frutos de diversas especies de los géneros botánicos Herrania y Theobroma, por lo que se considera el agente causal de la moniliasis en este último (Figura 1) (^{Evans, 1981}). La infestación en plantas de cacao resulta evidente cuando la especie fitopatógena causa daños necróticos en el tejido interno del fruto, lo que culmina en la mayoría de los casos en la pérdida de éste (^{Phillips-Mora et al., 2007}; ^{Hipólito Romero et al., 2017}).

Figura 1 Fruto de cacao tipo trinitario infectado por M. roreri en una plantación de cacao, Ranchería Galeana segunda sección, Jalpa de Méndez, Tabasco, México. Fotografía tomada por MTC.
Figure 1. Fruit of trinitarian type cocoa infected by M. roreri in a cocoa plantation, Ranchería Galeana second section, Jalpa de Méndez, Tabasco, Mexico. Photograph taken by MTC. 

A nivel molecular, existen pocos antecedentes sobre la naturaleza genómica de M. roreri. Por mencionar algunos ejemplos importantes; ^{Costa et al. (2012)} reportaron la secuencia del genoma mitocondrial (mt) de esta especie, cuyos resultados se compararon parcialmente con su pariente más cercano Moniliophthora perniciosa. Entre muchas características interesantes, el ADNmt de M. roreri (94 Kb) posee una topología circular que hipotéticamente codifica 14 genes relacionados con procesos de fosforilación oxidativa. Además de ello, éste transcribe genes tipo ARNr (ARN ribosomal), subunidades proteicas ribosomales, 13 marcos de lectura abierta intrónica (ORFs; Open Reading Frames) y un complemento de 27 genes tipo ARNt (ARN de transferencia). Estudios posteriores permitieron secuenciar y ensamblar 52,3 Mpb representados por 3,298 cóntigos (secuencias consenso de ADN) correspondientes al genoma de una cepa de M. roreri proveniente del estado de Los Ríos, Ecuador (^{Meinhardt et al., 2014}). Por su parte, ^{Barbosa et al. (2018)} realizaron la secuenciación y caracterización molecular de los genomas de seis cepas del género Moniliophthora divididas en subpoblaciones empleando plataformas de nueva generación.

Es importante mencionar que parte del genoma de M. roreri codifica proteínas relacionadas con fenómenos de retrotransposición, especies reactivas de oxígeno (ROS; Reactive Oxygen Species) y degradación de pared celular. Por otra parte, el considerable número de genes que codifica monooxigenasas citocromo P450, sugiere que el género Moniliophthora posee un gran potencial de detoxificación, al igual que síntesis de toxinas y distintos tipos de compuestos indólicos, lo que conferiría una alta capacidad de adaptación ambiental a sus especies fúngicas. El género en mención también es capaz de secretar polipéptidos ricos en cisteína, así como expresar genes involucrados en metilotrofía y biosíntesis de hormonas de crecimiento vegetal (e.g. giberelinas y auxinas). Los pocos análisis profundos de la familia de genes de Moniliophthora sugieren que transcribe cantidades considerables de carboxilesterasas (^{Mondego et al., 2008}).

A la luz de las consideraciones anteriores, este trabajo tuvo como objetivo principal; caracterizar parte del genoma de una cepa de M. roreri, previamente aislada de cacao en el Estado de Tabasco, México. Para lo anterior, se diseñó un conjunto de metodologías que permitieron la construcción de biobancos y su respectiva secuenciación a través de plataformas de nueva generación, incluyendo distintos análisis computacionales que, en conjunto, dieron un vistazo a un fragmento de la naturaleza genómica de la cepa fúngica. De esta forma se develaron parcialmente algunos de sus mecanismos de evolución adaptativa así como de competencia interespecífica, pero principalmente mediante reconstrucciones filogenéticas; la presencia de supuestos genes que estarían relacionados con adaptación al estrés, metabolismo secundario y capacidad necrótica vegetal, cuyos procesos metabólicos son considerados imperativos durante el ciclo de infestación de los hongos hemibiotróficos.

Materiales Y Métodos

Resultados

Reconstrucción filogenética

Mediante reconstrucciones filogenéticas se generó un árbol radial óptimo empleando el método NJ (Figura 2) que involucró la alineación de secuencias nucleotídicas de 35 cóntigos que mostraron máxima identidad en los análisis correspondientes. La suma total de longitud de las ramas fue de 28.6254 sustituciones por sitio, incluyendo las distancias evolutivas para cada una de éstas y tomando en cuenta su probabilidad máxima compuesta. Al eliminar todas las posiciones que contenían espacios faltantes, se generó un conjunto final de datos de 219 nucleótidos distintos. La Figura 2 muestra una reconstrucción que sugiere la presencia de seis grupos principales, que a su vez albergan subgrupos adyacentes conformados por accesiones genéticas previamente anotadas y predichas. La mayoría de las predicciones respectivas para Moniliophthora y Theobroma sugieren conjunción en subgrupos, inclusive para el caso de las secuencias hipotéticas.

Figura 2 Reconstrucción filogenética radial óptima de vecinos cercanos (NJ) (^{Saitou y Nei, 1987}) que muestra las máximas similitudes de secuencias de nucleótidos identificadas en parte del genoma de M. roreri CPMRT01. Cada número (etiqueta) corresponde al cóntigo identificado. Los cóntigos predichos se encuentran en recuadros.
Figure 2. Optimal radial phylogenetic reconstruction of Neighbor Joining (NJ) (Saitou and Nei, 1987) showing the maximum similarities of nucleotide sequences identified within the M. roreri CPMRT01 genome. Each number (label) corresponds to the identified contig. Predicted contigs are found in boxes. 

Las Figuras 3 (MLE) y 4 (UPGMA) muestran los resultados de los análisis evolutivos moleculares complementarios, respectivamente. La suma total de la longitud de las ramas fueron las siguientes: MLE= -19,207,954.26 y UPGMA= 0.00925867 sustituciones por sitio (probabilidad de registro más alta). Se calculó la divergencia evolutiva con estimadores mínimos para cada caso y en virtud de ello, se observó una reagrupación distinta de las muestras. La filogenia evolutiva obtenida con los métodos de unión de secuencias vecinas (Figura 2) y agrupamiento jerárquico aglomerado (Figura 4) sugiere que los grupos se organizan por pares o subramas primarias dependiendo de los valores obtenidos de los parámetros de remuestreo replicado. No obstante, mediante el análisis de máxima verosimilitud (Figura 3), se observó un aglomerado en pares de cuatro secuencias consenso (i.e. cóntigos 4478 y 2879; 4961 y 8564) que representa la rama primaria de la filogenia (out group) que da origen a los clados restantes.

Figura 3 Reconstrucción filogenética de máxima verosimilitud (MLE) de secuencias de nucleótidos identificadas en parte del genoma de M. roreri CPMRT01 bajo el modelo Tamura-Nei (^{Tamura y Nei, 1993}). La suma total de la longitud de las ramas fue de -19,207,954.26 sustituciones. Los números entre las coyunturas de las ramas representan la supuesta estabilidad de los grupos. Cada número (etiqueta) corresponde al cóntigo identificado. Los cóntigos predichos se encuentran en recuadros.
Figure 3. Maximum likelihood phylogenetic reconstruction (MLE) of nucleotide sequences identified within the M. roreri CPMRT01genome under the Tamura-Nei model (Tamura and Nei, 1993). The total sum of the length of the branches was -19,207,954.26 substitutions. Numbers between the joints of the branches represent the supposed stability of the groups. Each number (label) corresponds to the identified contig. Predicted contigs are found in boxes. 

Figura 4 Reconstrucción filogenética de agrupamiento jerárquico aglomerado simple (UPGMA) (^{Sneath y Sokal, 1973}) de secuencias de nucleótidos identificadas en parte del genoma de M. roreri CPMRT01. Se muestra el árbol óptimo con la suma de la longitud de rama = 0.00725912. El porcentaje de árboles replicados en los taxones asociados, agrupados en la prueba de arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas. Cada número (etiqueta) corresponde al cóntigo identificado. Los cóntigos predichos se encuentran en recuadros.
Figure 4. Phylogenetic reconstruction of single agglomerated hierarchical clustering (UPGMA) (^{Sneath y Sokal, 1973}) of nucleotide sequences identified within the M. roreri CPMRT01genome. The optimal tree is shown with the sum of the branch length = 0.00725912. The percentage of trees replicated in the associated taxa, grouped in the boot test (500 repetitions) are shown next to the branches. Each number (label) corresponds to the identified contig. Predicted contigs are found in boxes. 

Caracterización de dominios conservados

Respecto a la caracterización de dominios conservados, se observaron similitudes secuenciales en al menos cuatro cóntigos distintos (i.e. 1295, 1609, 1961, 8353) (Figura 5). Los análisis predictivos sugieren la presencia de posibles marcos de lectura abierta pertenecientes a superfamilias de proteínas ricas en cisteína (SCP), peptidasas tipo S8 y transposasas tipo Tnp4, entre otras. También se detectaron dominios de proteínas relacionadas con procesos de fitopatogenicidad, sitios de hibridación y enlace, y ORFs relacionados con el metabolismo secundario de Moniliophthora, incluyendo procesos de transcripción y retrotransposición. De manera complementaria, se observaron distintos sitios activos y catalíticos en un rango de 250 a 1000 pb mediante la alineación de 11 secuencias de cóntigos relacionados con M. perniciosa y proteínas hipotéticas de T. cacao (considerándolo como organismo homólogo). Las principales alineaciones de nucleótidos se predicen entre las 610 y 710 pb a lo largo de los cóntigos (Figura 5).

Figura 5 Representación gráfica de la predicción de dominios conservados hipotéticos con máximas similitudes identificados en parte del genoma de M. roreri CPMRT01. La alineación inferior múltiple de aminoácidos basada en restricciones por pares muestra 11 transcritos que sugieren similitud con sus secuencias residuales en donde el color azul representa regiones similares y el rojo regiones altamente conservadas.
Figure 5. Graphical representation of the prediction of hypothetical conserved domains with maximum similarities identified in part of the genome of M. roreri CPMRT01. The multiple lower alignment of amino acids based on peer restrictions shows 11 transcripts that suggest similarity to their residual sequences where the blue color represents similar regions and the red highly conserved regions. 

Discusión

En el caso del reino de los hongos, es posible estudiar mediante técnicas moleculares la naturaleza de interacciones fitopatógeno-hospedador, las bases bioquímicas de conidiación, así como rutas metabólicas que conducen a la reproducción sexual, entre otros conceptos fisiológicos. En relación con aspectos filogenéticos de T. cacao, el genoma del clon Matina 1-6 se ha anotada en un 99 % respecto a su variabilidad secuencial, observándose un tamaño aproximado de 445 Mpb, lo que resulta considerablemente más grande que el genoma de la variedad criolla (430 Mpb) (^{Motamayor et al., 2013}). Estos antecedentes permitieron identificar y caracterizar distintos genes de interés biotecnológico y agrícola (^{Ricaño-Rodríguez et al., 2018}) incluyendo al campo de la fitopatología, pues el correcto entendimiento de la organización genómica del cacao develaría el origen de respuestas epigenéticas desencadenadas por la interacción con su principal antagonista, Moniliophthora roreri. Lo anterior se fundamenta en el comportamiento biotrófico de los géneros Theobroma y Moniliophthora, y en virtud de ello, se abre la posibilidad de que el fenómeno sea estudiado inclusive a nivel transcriptómico (^{Jones y Dangl, 2006}).

Respecto al género Moniliophthora, tales antecedentes se complementan con el estudio de su mecanismo de fitopatogenicidad para con el cacao a nivel molecular (^{Teixeira et al., 2014}). Es importante mencionar que ^{Barbosa et al. (2018)} realizaron la secuenciación genómica de seis subpoblaciones de M. perniciosa y M. roreri. Los genomas de estas cepas oscilaron entre las 44 y 47 Mpb, lo que representa en promedio el 87.5 % del genoma reportado por ^{Meinhardt et al. (2014)} y un 13.5 % del genoma de M. roreri CPMRT01. A la luz de las consideraciones anteriores y de acuerdo con los resultados de esta investigación referentes a la reconstrucción filogenética de secuencias consenso de ADN la cepa CPMRT01, se concluye que los índices de máxima identidad encontrados corresponden a los géneros Moniliophthora y Theobroma, pues las predicciones muestran porcentajes >85 % en relación con accesiones de genes tipo PR-1e (estrictamente involucrados en procesos de fitopatogenicidad) (^{Aime y Phillips-Mora, 2005}), metanol oxidasas y retrotransposones, genes CP01 relativos a mecanismos de defensa al igual que fosfoproteínas y proteasas, entre otras (^{Teixeira et al., 2014}).

Asimismo, se observaron similitudes con los géneros Trichoderma y Tremella del reino Fungi, al sugerir la presencia de transcritos hipotéticos. Así, se sabe que durante su interacción biotrófica con el cacao, el género Moniliophthora expresa distintos alelos que codifican transcritos de interés biotecnológico (e.g. citoquininas deshidrogenasas, glicósido hidrolasas, proteínas I3, proteínas ricas en cisteína, peptidasas, transposasas y thaumatinas). Algunos de estos metabolitos se encuentran relacionados con procesos de fitopatogenicidad al igual que transposición replicativa y transcripción, y se involucran en rutas metabólicas que desencadenan respuestas sistémicas en la planta huésped (^{Jones y Dangl, 2006}; ^{Teixeira et al., 2014}).

Hoy en día, aún con la atención prestada al estudio de las interacciones moleculares entre los géneros Theobroma y Moniliophthora, existe relativamente poca información respecto a la naturaleza del genoma y secretoma de este último fitopatógeno fúngico. ^{Meinhardt et al. (2014)} ensamblaron 52,3 Mb en 3,298 cóntigos que representan el genoma completo de M. roreri, prediciendo 17,920 ORF´s y validando 13,760 secuencias mediante RNA-seq. De los 1,535 genes que transcriben teóricamente proteínas, 1,355 de estos podrían transcribirse en fases biotróficas y necrotróficas. Igualmente, el análisis de datos revelados por el secretoma de M. roreri sugiere correlación con procesos de infección y crecimiento intercelular en la fase biotrófica, al igual que con el crecimiento invasivo y la correspondiente fase necrótica por parte del hospedador.

Mediante nuestro trabajo se predijeron distintos cóntigos en M. roreri con altos porcentajes de identidad respecto a secuencias de T. cacao (>95 %) (Tabla 1) previamente anotadas y, cuya predicción funcional refiere proteínas aun sin caracterizar, pero que podrían clasificarse como fosfoproteínas vasodilatadoras, proteasas y factores de transcripción cloroplásticos. Todos ellos involucrados en el metabolismo secundario del hongo. ^{Tiburcio et al. (2010)} sugieren que el género Moniliophthora posee al menos tres genes que han sido adquiridos mediante transferencia horizontal (HGT; horizontal gene transfer) (i.e. (1) proteínas inductoras de necrosis (NIPs; necrosis-inducing proteins), (2) hidrolasas dependientes de metal (MDH; metallo-dependent hydrolases) y (3) deshidrogenasas manitol fosfato (MPDH; mannitol phosphate dehydrogenase).

De acuerdo con esta información y analizando los resultados obtenidos de las respectivas reconstrucciones filogenéticas a partir de los cóntigos ensamblados de M. roreri CPMRT01 (Figuras 2, 3 y 4), aquí proponemos “hipotéticamente” que existe la posibilidad de que algunas de las regiones conservadas de los genes estudiados se heredarían de oomicetes, actinobacterias y firmicutes (i.e. con base a las supuestas anotaciones funcionales observadas que se relacionarían con especies diferentes y que son el resultado del proceso evolutivo de genomas que provienen de organismos antecesores comunes). A partir de este antecedente es que se propone la idea de una posible divergencia evolutiva interespecífica. Esto explicaría (aunque de manera muy limitada) la predicción hipotética de proteínas en nuestro trabajo que aun no han sido anotadas y que mostraron un alto porcentaje de similitud respecto a secuencias de aminoácidos de otros géneros, e inclusive, especies de otros reinos. Por otra parte, los aglomerados y subgrupos de taxones observados en los análisis correspondientes sugieren variación en su estructura nucleotídica y, la proximidad de cada componente dependería en gran medida de la naturaleza de dichas regiones nucleotídicas. De ser correcto lo anterior, un solo taxón representaría dentro de la población a los componentes con mayor rastro evolutivo, pues en principio; cada grupo de secuencias consenso forman inclusive clústeres subconjuntos (^{Ricaño-Rodríguez et al., 2018}). Tomando en cuenta dichos resultados, los aglomerados restantes se encuentran directamente emparentadas con los cóntigos 4478, 2879, 4961 y 8564, aunque como se ha mencionado en repetidas ocasiones, las predicciones al ser heurísticas sólo sugieren una aproximación a la naturaleza genómica de la especie (^{Motamayor et al., 2013}).

De los 12 genes tipo PR-1 identificados en el genoma de M. roreri, 10 de estos poseen similitud con secuencias descritas en M. perniciosa (^{Texeira et al., 2012}). Estas proteínas se regulan durante la fase biotrófica, aunque también es posible observarlas en la fase necrotrófica. Todas las proteínas tipo MrPR-1 tienen al menos un dominio SCP conservado. El C-terminal de la proteína MrPR-1g que se encuentra tanto en M. perniciosa como en M. roreri tendrían una función específica en su fase fitopatogénica (^{Meinhardt et al., 2014}), resultado que es consistente con la predicción de ciertos dominios conservados en el genoma de nuestra cepa (Figura 5). Otro dato importante es que; durante la interacción con plantas de cacao, el micelio de M. roreri tiene acceso a estructuras plasmodesmáticas y por consiguiente, a los nutrimentos que pasan a través de ellas. En este sentido, las proteínas tipo PR-1 son importantes para la virulencia, y se ha sugerido que intervienen en la diseminación sistémica del hongo, posiblemente limitando la susceptibilidad de defensa del huésped, actuando como efectoras que suprimen su mecanismo de defensa (^{Prados-Rosales et al., 2012}).

Las proteínas PR-1 interaccionan también de manera independiente en las fases biotrofas y necrotrofas. Por otra parte, estos péptidos alteran las paredes celulares de Theobroma como si fueran inhibidores competitivos, minimizando la respuesta de defensa de la planta e inclusive mostrarían actividad antimicrobiana, para prevenir infecciones subsiguientes y el desarrollo de microorganismos competidores. En principio, este fenómeno sugeriría el planteamiento de una hipótesis que explique parte de las causas por las cuales Moniliophthora ha sido un agente causal de moniliasis en el estado de Tabasco, México, lo cual evidencia su alta capacidad de adaptación epigenética al medio ambiente, apoyando el viejo modelo propuesto de fitopatogénesis (^{Garcia et al., 2007}).

Las proteínas secretadas en la fase biotrófica se asocian principalmente con la descomposición de la matriz intercelular del fruto de cacao, así como con el proceso de modificación de micelios fúngicos, posiblemente para enmascarar al hongo de la defensa de la planta. Igualmente, las proteínas que se hacen presentes en la fase necrotrófica atacan las paredes celulares de su huésped (^{Ricaño-Rodríguez et al., 2018}). En virtud de lo anterior, a través del estudio de predicción de dominios conservados en el genoma de la cepa CPMRT01 se propone la presencia de sitios catalíticos relacionados con enlaces a histonas, ácidos nucleicos y NTP e hibridación ADN/ARN. Todos ellos serían factores moleculares importantes en la fase necrotrófica del hongo (^{Texeira et al. 2012}; ^{Meinhardt et al., 2014}) y que soportarían una explicación plausible sobre el origen de la naturaleza virulenta del hongo al menos contra el género Theobroma.

Por último, cabe mencionar que el estudio genómico de esta especie fúngica permite desarrollar una mejor comprensión sobre cómo la interacción Moniliophthora-Theobroma concluye en una enfermedad vegetal progresiva, lo que se traduce en la necesidad de implementar nuevas herramientas que reduzcan su impacto agrícola en ambos sentidos; tanto económico como sociocultural.

Conclusiones

Hasta donde los autores sabemos, éste es uno de los primeros trabajos realizados en México donde se propone una aproximación heurística a la naturaleza genómica de una cepa de M. roreri aislada de frutos de cacao nativos del Estado de Tabasco, México. La evaluación de calidad de las lecturas de secuenciación generadas mostró distribuciones muy variadas y, los resultados de clasificación para las muestras guardaron relación con el organismo estudiado. Tanto los estudios de reconstrucción filogenética como las hipotéticas predicciones funcionales de regiones conservadas, permitirían identificar posibles alelos que aún no han sido reportados en el repositorio del NCBI, incluyendo proteínas transcritas tipo RP-1 asociadas a procesos de fitopatogenicidad. Lo anterior aportaría valioso conocimiento sobre la capacidad de adaptación de Moniliophthora a distintas condiciones ambientales. Los resultados de caracterización de dominios conservados y su consiguiente evolución molecular taxonómica, sugieren la reagrupación de cóntigos que teóricamente evolucionaron de manera conjunta a partir de un clado primario. Por otra parte, los marcos de lectura abierta de los cóntigos estudiados codificarían en principio; superfamilias de proteínas ricas en cisteína, peptidasas tipo S8 y transposasas tipo Tnp4, por citar a las más relevantes.