Establecimiento de los sistemas semi-hidropónicos

Se construyeron cuatro sistemas semi-hidropónicos, para cada uno se utilizaron tubos de PVC hidráulico (19 mm de diámetro) los cuales fueron cortados y unidos en forma de un cubo para sostener en la parte superior a seis tubos (75 mm), con un espacio de 8 cm entre cada uno de los tubos, cada tubo en la parte superior con cuatro perforaciones de un diámetro de 10 cm en los cuales se colocaron las plántulas de Agave cupreata y A. salmiana, cada sistema con capacidad para 40 plantas (Figura 1). En la parte superior se colocó un despachador con seis mangueras, por las cuales circuló la solución nutritiva (en ppm, mg/L: N=166.01, P=31.35, K=277.38, Ca=182.06, Mg=49.08, S=110.89, Fe=1.33, Cu=0.00065, Mn=0.201 y Zn= 0.03), pH 5.8-6.0, C.E. 1.5-2.5 dS/m según lo reportado por (^{Castañeda-Cervantes & Arzate-Fernández, 2025}) en un contenedor de 40 L y dentro de éste una bomba sumergible de agua con una capacidad de 300 L/h y 65 w, para recircular el agua al sistema y una bomba de aire con una capacidad de 60 L. Se utilizó un DATA LOG GSP-8 para el monitoreo de temperatura y humedad en el invernadero, el cual registró una temperatura promedio de 15.3° C, una máxima de 43.8° C, y una mínima de -2.9° C, y una humedad promedio de 75.2%, en un período de 12 meses.

Figura 1 Sistema semi-hidropónico de PVC con capacidad para 40 plantas. 

Origen y germinación de la semilla

En el presente estudio se utilizaron semillas de Agave cupreata y A. salmiana, colectadas en el Estado de Guerrero en 2021 y almacenadas en el banco de semillas del Laboratorio de Biología Molecular Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México.

Para la germinación de las semillas se preparó un sustrato a base de turba, agrolita y fibra de coco en una proporción 1:1:1, se homogenizó y esterilizó en una autoclave a 120 °C durante 20 min a una presión de 1.1 kg/cm². Posteriormente, se colocó una capa de 5 cm de altura del sustrato en una charola germinadora de 25x40 cm., y se colocaron las semillas previamente desinfectadas en hipoclorito de sodio al 5% v/v durante 3 min (^{Rodríguez-García et al. 2020}), y encima del sustrato, sobre las semillas, se colocó una capa delgada de ocoxal de pino, y finalmente se regó con suficiente agua para que el sustrato estuviera húmedo.

Trasplante de las plántulas a los sistemas semi-hidropónicos

A partir de la cuarta semana de germinación, apareció la primera hoja o penca en las plántulas de agave, estas fueron desinfectadas durante 10 min en agua con ozono, posteriormente fueron transferidas a vasos de plástico biodegradable con una capacidad de 200 mL, los cuales fueron perforados 5 mm de diámetro en la base y se introdujo un hilo-estambre de 15 cm que ayudó a absorber el agua por capilaridad, cada vaso se llenó con sustrato a base de 100% tepojal con un diámetro de partícula de 2 mm, enseguida fueron establecidos en un sistema semi-hidropónico para el crecimiento y endurecimiento de las plantas.

Riego de las plantas y tratamientos

En cada sistema semi-hidropónico se colocaron 24 plantas creciendo con las mismas características físicas (edad, vigor), además todas con el mismo sustrato, solución nutritiva y la misma frecuencia de riegos tres veces al día (por la mañana, en la tarde y por la noche, cada riego durante 15 min de lunes a sábado) durante 2 meses. Después de este período se establecieron los tratamientos con tres concentraciones de Ácido salicílico (1.0, 3.6 y 7.2 µM) y el testigo (0.0 µM), empleando sólo agua para el tratamiento control, según la técnica descrita por (^{Gutiérrez-Coronado et al., 1998}). Los tratamientos se aplicaron durante 6 meses consecutivos directamente en el contenedor del sistema semi-hidropónico.

Análisis de las variables físicas

Después de completarse un período de 15 meses las plantas fueron extraídas de los sistemas semi-hidropónicos y se registraron los siguientes datos: número hojas, longitud y ancho de la hoja. Se midió el diámetro del tallo con un Vernier digital (Truper, CALDI- 6MP). Posteriormente, las plantas fueron seccionadas en tres partes: hoja, tallo y raíz para los análisis de biomasa y determinación de azúcares reductores en laboratorio.

Análisis de biomasa

Se obtuvieron los pesos frescos de hoja, tallo y raíz de cada planta, con una balanza analítica (Sartorius, BP221S), después, cada una de estas muestras se colocaron en una incubadora (Felisa, Modelo FE133A) a una temperatura de 65 °C durante 72 h para eliminar la humedad. Posteriormente, las muestras se pesaron para determinar la cantidad de biomasa seca y finalmente fueron molidas hasta su pulverización con un molino eléctrico (General Electric, modelo 5XBG00G), con una criba de 20 micras. La materia orgánica seca de las hojas y tallo se depositó en un crisol de porcelana a peso constante, el cual previamente se colocó en una mufla a 550 °C durante una hora, posteriormente el crisol se puso en un desecador y se dejó enfriar a temperatura ambiente, se determinó el peso del crisol en balanza analítica y se registraron los datos como la variable A. Después se tomó una muestra representativa de 5 g previamente seca, se colocó en el crisol y se determinó el peso en la balanza analítica y se registró el dato, como la variable B. Enseguida se incineraron las muestras utilizando un mechero hasta que no emitiera humo y las paredes del crisol estuvieron blancas, entonces se introdujo el crisol, con la muestra calcinada, a la mufla a 550 °C durante 24 h; pasado el tiempo, se pasó el crisol al desecador y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, por último se determinó el peso del crisol con la muestra calcinada y se registró el valor como la variable C.

Ecuación:

Donde:

A= Peso del crisol vació en gramos

B= Peso del crisol y la muestra seca en gramos

C= Peso del crisol y la muestra calcinada en gramos

Cuantificación de azúcares reductores

Se cuantificó la concentración de azúcares reductores por el Método DNS de Miller con algunas modificaciones. Se seleccionaron al azar muestras de hoja y de tallo de las plantas de 15 meses de edad, establecidas en los sistemas semi-hidropónicos. Las muestras se lavaron con agua corriente. En un matraz de 500 mL se disolvieron 4.8 g de NaOH (hidróxido de sodio) y se agregaron 120 mL de agua destilada, posteriormente se colocó sobre un agitador orbital, y se adicionaron 90 g de Na-K.4H₂O (tartrato de sodio y potasio), finalmente se aforó hasta 240 mL con agua destilada y se homogenizó la solución. Enseguida se añadieron 3 g de DNS (ácido 3,5-dinitrosalisílico), se agregaron 140 mL de agua destilada, se dejó en agitación 12 h, por último, se filtró la solución y se almacenó en un frasco ámbar a 4 °C. Para evaluar la concentración de azúcares reductores, se determinó una curva patrón de calibración de absorbancia en función de la concentración. Para esto, se prepararon soluciones de 0-5 mg/L, utilizando glucosa como estándar, se agregó 0.5 g de muestra y se aforó a 10 mL y se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 minutos para obtener la muestra deseada. A cada una de las muestras se aplicó el método DNS, cuya reacción se llevó a cabo en tubos de cristal de 10 mL, a los cuales se adicionaron 0.5 mL de muestra y 0.5 mL del reactivo DNS, se colocaron a ebullición durante 5 min, se enfriaron con hielo y se les añadió 5 mL de agua destilada, se homogenizó la muestra. A cada una de las muestras se les tomó una lectura de las absorbancias a una longitud de onda 540 nm en el espectrofotómetro (Genesys 10 vis) y el mismo procedimiento se realizó para el blanco para lo cual se utilizó agua destilada.

Diseño experimental

El manejo estadístico de la información consistió en un análisis de regresión completamente al azar, para el cual se tomaron siete plantas por tratamiento incluyendo al control, de la cuales se realizaron tres repeticiones para ambas especies, la variable independiente fue la concentración del ácido salicílico (AS) y las variables dependientes fueron aquellas respuestas relacionadas con las características fenológicas (número de hojas, longitud, ancho de la hoja, diámetro del tallo y materia seca) y una variable química (azúcares reductores). Los datos obtenidos se analizaron por medio del programa estadístico Stathgraphics Plus Versión 5.0. En aquellas variables donde se presentó diferencia significativa, se realizó una prueba de comparación de medias (método DMS) con un nivel de significancia del 95%. No se realizaron pruebas adicionales con los datos que no presentaron diferencias significativas.

Análisis de las variables físicas

Número de hojas

Los resultados de la evaluación del efecto del Ácido salicílico, en el número, la longitud y ancho de hoja así como en el diámetro del tallo de las plantas de A. cupreata y A. salmiana, mostraron lo siguiente: en ambas especies de agave, se observó la formación completa de la primera hoja a partir de la cuarta semana, después de la germinación. En la Figura 2A, se puede observar la gráfica de las medias respecto al número de hojas en A. cupreata donde, la primera barra corresponde al tratamiento control en el cual se registraron 10 hojas por planta, mientras que, en los tres tratamientos con 1.0, 3.6 y 7.2 µM de AS se registraron 11 hojas por planta, lo que indica que no hubo diferencias significativas entre las concentraciones aplicadas para promover la diferenciación celular en las hojas de esta especie. Sin embargo, en A. salmiana (Figura 2B), si hubo diferencias significativas, ya que el control mostró una media de 8.0 hojas por planta y para los tratamientos con 1.0, 3.6 y 7.2 µM de AS, registraron una media de 9.3, 9.5 y 7.8 hojas, respectivamente, donde con la concentración de 3.6 µM se observó el mayor número de hojas en comparación con el testigo, por lo que el AS mostró tener un efecto favorable para diferenciación celular en nuevas hojas en la planta que cuando se aplicó 1.0 y 3.6 µM, pero la concentración de 7.2 µM no favoreció el número de hojas en esta especie, incluso fue ligeramente menor al control el cual registró 8.2 hojas. Sin embargo, al comparar el efecto del AS en el número de hojas en ambas especies, A. cupreata registró una media de 11 hojas por planta y el testigo 10.2, mientras que A. salmiana registró 8.9 hojas por planta en promedio y su testigo 8.2, esto indica que el AS estimula de manera positiva en el desarrollo de hojas en la planta según la especie, teniendo una mejor respuesta en A. salmiana. Esto se debe a que el ácido salicílico es una hormona vegetal que regula el crecimiento, desarrollo, así como la respuesta al estrés oxidativo en las plantas, incluyendo el agave. Cuando el AS se encuentra dentro de la planta se encarga de bajar los niveles de estrés, se activan los mecanismos fisiológicos y las rutas metabólicas relacionadas con la fotosíntesis (^{Ogunsiji et al., 2023}; ^{Abdi et al., 2023}). Los azúcares son los productos más importantes de la fotosíntesis y la planta los distribuye de manera eficiente en toda su estructura para la formación de órganos, tales como la hoja. Es importante destacar que, si los azúcares se dirigen a las hojas jóvenes, estas crecen más rápido, es decir, entre mayor cantidad de azúcares mayor es el crecimiento de las hojas. De aquí la importancia de que el AS esté presente, pero en concentraciones adecuadas, para no inhibir su actividad. Por otra parte, a la planta le favorece tener hojas sanas y grandes, ya que de esta manera se mantiene activa la fotosíntesis y se reduce el estrés oxidativo en plantas como el agave.

Figura 2 Efecto del Ácido salicílico en el número, la longitud y ancho de hoja, y el efecto en el diámetro del tallo de las plantas de A. cupreata y A. salmiana, de 15 meses de edad. 

Longitud y ancho de hoja

Por otra parte, en la Figura 2C se puede observar el efecto del AS en la longitud (barras de color naranja) y el ancho de hoja (barras de color amarillo). En A. cupreata se encontró que la longitud de hoja fue mayor (11 cm) cuando se aplica una concentración de 1.0 µM de AS, comparada con el tratamiento control (8.69 cm), esto sugiere que el AS tiene un efecto positivo en la elongación de hojas. En esta especie, también se observó que el ancho de la hoja fue ligeramente mayor cuando se aplicó 1.0 µM y 3.6 µM (11.7 cm y 10.2 cm, respectivamente) con respecto al control (4.86 cm), por lo tanto, no hubo diferencias significativas para esta variable entre los tratamientos, pero si con respecto al control. Para el caso de A. salmiana (Figura 2D ), al aplicar 1.0 y 3.6 µM de AS la longitud de las hojas fue ligeramente mayor con 7.77 cm y 7.78 cm, respectivamente, comparado con el control (3.80 cm), sin embargo, para el ancho de hoja tampoco hubo diferencias significativas en esta especie. Así mismo se observó que, cuando se aplica una concentración de 7.2 µM de AS hay un menor ancho de hoja, lo cual indica que, esta concentración no favorece la elongación celular en la especie, sin embargo, no existen reportes en la literatura que muestren el efecto reportado en el presente trabajo. Aunque, ^{Anchondo-Aguilar et al., (2011)} demostraron que bajas concentraciones de AS favorecen la altura y el número de hojas en Fragaria annassa. Por otra parte, ^{Martin-Mex et al. (2012)} han señalado que el AS también influye positivamente en la producción de frutos en Carica papaya ya que, al aplicar concentraciones de 0.01 µM incrementaron significativamente la altura y el grosor de la planta, así como el número y peso de los frutos. Estos resultados coinciden con los estudios reportados por ^{Khoshbakht & Asgharei (2015)} donde bajas concentraciones de AS influyeron en el incremento de la tasa fotosintética y en el crecimiento foliar en cítricos.

Diámetro de tallo

El efecto del AS sobre el diámetro del tallo se puede observar en la Figura 1E, en donde para A. cupreata se observó que al aplicar una concentración de 1.0 µM de AS el tallo fue mayor (43.2 mm) comparando con el tallo del testigo (40.9 mm), mientras que cuando se aplicó 7.2 µM de AS el diámetro fue menor (38.8 mm) comparando con el tallo del tratamiento testigo (40.9 mm). Por otra parte, en A. salmiana, cuando se aplicó 3.6 µM de AS el diámetro del tallo fue mayor (39 cm) comparado con el control, pero cuando se aplicó 7.2 µM el diámetro del tallo registró un valor menor comparado, sin embargo, no hubo una diferencia significativa entre estos tratamientos. Estos resultados son importantes, ya que se observó un incremento del tallo en poco tiempo, esto quiere decir que, el AS pudo promover la elongación del tallo. Esto se debe a que el AS induce la expresión de genes relacionados con la síntesis de celulosa y hemicelulosa, componentes clave de la pared celular, además, el AS aumenta la actividad enzimática de la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL), lo que conduce a un aumento en la síntesis de lignina, un componente importante de la pared celular. Debido a esto, el AS puede promover o inhibir el crecimiento celular, dependiendo de la concentración. En concentraciones bajas el AS puede estimular el crecimiento celular y aumentar la biomasa. Tal como sucedió en este estudio con la aplicación de concentraciones bajas en las plantas de agave. Sin embargo, es importante tener en cuenta que, el efecto del AS en el incremento de la biomasa puede variar dependiendo de la especie de la planta así como de las condiciones ambientales. En cambio, altas concentraciones pueden inhibir el crecimiento actuando como regulador negativo. Tal como se observó en los resultados del presente estudio. Esto tiene una gran influencia positiva, ya que se ha reportado que el AS activa genes relacionados con la síntesis de la RuBisCO (Ribulosa 15, Bifosfato, Carboxilasa, Oxigenasa) y sus subunidades LSU y SSU. Esto significa que las plantas tratadas con AS pueden producir mayor cantidad de la enzima en los cloroplastos lo que favorece la apertura estomática y optimiza el intercambio gaseoso en el mesófilo de la hoja. Al aumentar la concentración interna de CO₂, la RuBisCO tiene mayor sustrato disponible para catalizar la carboxilasa, aumentando su eficiencia. Finalmente, como la RuBisCO es muy sensible al estrés oxidativo por calor, sequía o salinidad, el ácido salicílico activa enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), y peroxidasa (POD) que reducen especies reactivas de oxígeno (ROS). Esto protege la estructura y la función de la RuBisCO, evitando su degradación o su desactivación, esto implica que la producción de azúcares está segura para el tallo del agave, donde se acumulan los azúcares en forma de jugos, que servirán para la elaboración de bebidas como el mezcal y el pulque, favoreciendo la calidad y la cantidad de alcohol. Resultados similares han sido reportados por ^{Tucuch et al. (2017)}donde en plántulas de trigo los valores del diámetro del tallo estuvieron por encima del control al aplicar 1.0 µM de AS. Estos resultados también coinciden con los reportes de ^{Hayat y Ahmad (2007)} donde demostraron que la aplicación de AS en bajas concentraciones favorecieron el incremento de la bioproductividad, sobre todo en el tamaño del área foliar, así como la longitud y densidad de las raíces, bajo condiciones de invernadero. Estos resultados coinciden con los estudios realizados por ^{Khodary (2004)} quien reportó que aplicaciones de 10 mM de AS en Zea mays aceleraron la actividad de la enzima RuBisCO, aumentando la actividad fotosintética; permitiendo un incremento en el contenido de clorofila a y b, de carotenoides y de carbohidratos; provocando un aumento también en la longitud, peso fresco y seco de la raíz; altura, biomasa seca y fresca de la parte aérea de la planta. En este estudio al analizar y comparar los resultados del efecto del AS sobre estas variables se puede decir que, la especie de A. salmiana respondió favorablemente en el crecimiento, número, longitud y ancho de las hojas, así como el incremento del diámetro de tallo, por lo tanto, la concentración de 3.6 µM influye positivamente en las tres variables evaluadas.

Efecto del ácido salicílico sobre el contenido de materia seca orgánica y azúcares reductores

Los resultados de la evaluación del efecto del AS sobre el contenido de materia seca orgánica y de azúcares reductores en A. cupreata mostraron diferencias significativas (Figura 3), indicando que con 1.0 µM de AS el contenido de materia orgánica se incrementó a (23 g/100 g) en el tallo, no así para la hoja y raíz, ya que se obtuvieron valores de 10 y 11 g/100 g, respectivamente, sin embargo, cuando se aplicó el AS a una concentración de 7.2 µM la materia orgánica seca disminuyó en el tallo y hoja, lo cual coincide con los resultados obtenidos de la formación de hojas y tamaño del tallo, donde el efecto fue negativo para la planta. Para el caso de la materia seca orgánica en A. salmiana (Figura 3B), en el tratamiento con 3.6 µM de AS, se obtuvo un valor de 23 g/100 g para la raíz, en cambio para el tallo y la hoja fue de 9 y 11 g/100 g, respectivamente, muy similar a los valores del tratamiento control de ambos órganos de la planta, sin embargo, se esperaba encontrar valores altos de materia seca orgánica cuando se aplicó 1.0 µM y coincidir con los valores registrados respecto al número de hoja y longitud de tallo. Esto se debe a que el AS favoreció la formación de las raíces laterales y el alargamiento de la raíz principal, lo que mejora la absorción del agua y nutrientes. Así como también, el AS promueve la traslocación de azúcares a las raíces aumentando el desarrollo celular. Esto también obedece a que el AS interactúa con otras fitohormonas como las auxinas y las citoquininas que coordinan la división celular, el crecimiento de raíces y brotes. Estos resultados coinciden con ^{Gutiérrez-Coronado et al. (1998)} quienes reportaron que, en soya la aplicación de bajas concentraciones de AS favoreció significativamente el crecimiento de la raíz.

También, se observó que los valores más bajos de materia seca para raíz, tallo y hoja se obtuvieron con 7.2 µM de AS, lo cual tiene una correspondencia a lo encontrado para el crecimiento de estos órganos en esta especie evaluada. En cuanto a los resultados de azúcares reductores en A. cupreata (Figura 3C), se pudo observar que la mayor concentración de azúcares fue superior en las hojas (56 g/100 g) que en el tallo y la raíz (8 y 2 g/100 g), respectivamente cuando se aplicó 1.0 µM de AS, y que estos disminuyeron con 7.2 µM de AS. En el caso de A. salmiana (Figura 3D), también la mayor concentración de azucares se obtuvo con 1.0 µM de AS, donde el tallo y la hoja registraron una concentración de 76 g/100 g, comparado con el tratamiento control el cual alcanzó 30 g/100 g. Mientras que, la raíz alcanzó una concentración de 18 g/100 g. Estos resultados coinciden con los estudios reportados por ^{González-Díaz et al. (2020)} quienes mencionan que los azúcares, tales como los fructanos representan más del 80% del peso seco de las plantas de agave, incluyendo inulinas, fructooligosacáridos y estos dependen de la especie del agave y la edad de la planta. Además, los fructanos pueden localizarse en órganos superficiales como las hojas. También en el presente estudio, se reveló claramente que la concentración de 7.2 µM de AS no tiene un efecto potencializador en el crecimiento de la planta, ni en el contenido de materia seca orgánica y tampoco en la concentración de los azúcares reductores.

Figura 3 Efecto del ácido salicílico sobre el contenido de la materia seca orgánica y azúcar en plantas de A. cupreata (A y C) y A. salmiana (B y D) de 15 meses de edad. Las barras representan la DMS (p ≤ 0.05). 

Los resultados de la concentración de azucares en las plantas de A. cupreata y A. salmiana, con respecto a la edad de las plantas y la concentración de AS, se observan en la Figura 4. Para el caso de A. cupreata, a los 145 días de edad de la planta, se observó el mayor porcentaje de azúcares reductores 85 mg/100 g a una concentración de 3.0 µM de AS. En A. salmiana, el máximo nivel de azúcar se observó a una edad de 135 días de las plantas y con 2 μM de AS, lo que refleja la capacidad de esta especie de almacenar carbohidratos a temprana edad, específicamente fructanos, ya que las plantas de A. tequilana almacenan frúctanos como principal carbohidrato de reserva según lo reportado por ^{López et al. (2003)}; ^{González-Díaz et al. (2020)}. Estos resultados coinciden con un estudio realizado por ^{Medallo-Mojica y López-Pérez (2013)} quienes reportaron que en plantas de Agave tequilana Weber var. azul extraídas a una edad de 2 a 7 años, las cuales mostraron que conforme aumenta la edad de la planta en campo, los fructanos almacenados se vuelven moléculas más complejas y muestran un incremento gradual. Esto sugiere que, en este estudio, si se hubiera continuado con las aplicaciones de AS podría haber aumentado el grado de polimerización de los fructanos. Por lo tanto, se podrán cosechar los tallos de agave en periodos relativamente más cortos. Además, el efecto del AS se comportó de forma diferenciada para cada uno de los tratamientos según la especie en estudio. Por otra parte, los resultados indican que este tipo de plantas con metabolismo CAM responden favorablemente a este regulador de crecimiento, incluso aplicado en bajas concentraciones, pero en niveles altos puede producir un efecto inhibitorio.

Figura 4 Iso-concentración de azúcares según la dosis de ácido salicílico y la edad de las plantas de A. cupreata (imagen izquierda) y A. salmiana (imagen derecha) de 15 meses de edad. 

La producción de plantas de agave en sistemas semi-hidropónicos bajo condiciones de invernadero con aplicación de AS, podría ser una estrategia eficiente para potenciar la velocidad de crecimiento en las plantas al incrementar su biomasa, lo que implica la obtención de azúcares reductores en menos tiempo y ahorro de agua en el riego, lo cual lo hace un sistema eficiente y ecológico que ayuda a capturar más luz solar y dióxido de carbono, y esto también podría contribuir a disminuir el impacto del calentamiento global.