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Introducción
La familia Asparagaceae (anteriormente Agavaceae), subfamilia Agavoideae, perteneciente al orden Asparagales, constituye un linaje monofilético de plantas monocotiledóneas ampliamente adaptadas a entornos xerofíticos a través de sofisticadas adaptaciones morfofisiológicas (García-Mendoza, 2002). Este clado agrupa sistemáticamente a nueve géneros neotropicales, entre los que destacan Agave, Furcraea y Yucca, con aproximadamente 300 especies, de las cuales un notable 90.6% (272 taxones) presentan distribución endémica en el territorio mexicano, lo que posiciona al país como un punto crítico de diversidad genética y centro de diversificación evolutiva para este grupo (Álvarez-Ríos et al., 2020; Trejo et al., 2024). Esta riqueza específica está estrechamente correlacionada con procesos de radiación adaptativa impulsados por condiciones edafoclimáticas extremas, particularmente en el Eje Neovolcánico Transversal y en zonas de transición árido-tropical, donde estas especies han desarrollado estrategias fisiológicas altamente especializadas para maximizar la eficiencia en el uso del agua y la captación de nutrientes (Dávila et al., 2002).
El género Agave destaca por su relevancia ecológica, económica y biotecnológica. Su metabolismo ácido de las crasuláceas (CAM, Crassulacean Acid Metabolism) y su capacidad de sintetizar y almacenar fructanos de alta masa molecular le confieren una notable resiliencia ambiental y lo hacen apto para múltiples aplicaciones industriales (Pérez‐Zavala et al., 2020). Estas aplicaciones incluyen la producción de bebidas destiladas mediante hidrólisis termoenzimática de fructooligosacáridos (como el tequila y el mezcal), el desarrollo de ingredientes funcionales como prebióticos y edulcorantes, la síntesis de bioetanol de segunda generación, y la extracción de compuestos bioactivos como saponinas esteroidales con propiedades farmacológicas (Gutiérrez-Mora et al., 2014; Zizumbo-Villarreal et al., 2009). Sin embargo, la biología reproductiva del género, caracterizada por su monocarpismo, largos ciclos ontogénicos, baja viabilidad seminal y limitada propagación vegetativa espontánea, representa una barrera crítica para su conservación y explotación sostenible (Aguirre-Dugua & Eguiarte, 2013).
Particularmente, Agave angustifolia Haw., una especie diploide (2n = 2x = 60), muestra una marcada vulnerabilidad ecológica y genética, atribuible a su escaso flujo génico, alta especialización ecológica y grado elevado de domesticación (Flores-Maya et al., 2015). Proyecciones recientes advierten una reducción de hasta el 68 % en sus poblaciones silvestres para el año 2040, como consecuencia de la ausencia de intervenciones de conservación efectivas y la creciente presión extractiva de la industria mezcalera. Ante esta problemática, la implementación de estrategias biotecnológicas orientadas a su propagación masiva, conservación ex situ y mejora genética resulta imperativa (Gutiérrez-Mora et al., 2014).
La embriogénesis somática (ES) se erige como una herramienta fundamental, capaz de generar sistemas de propagación clonal eficientes, establecer bancos de germoplasma in vitro, facilitar la crioconservación de recursos fitogenéticos y constituirse una plataforma para la transformación genética (Aronen et al., 2025; Desai et al., 2022). El proceso embriogénico en Agave implica una compleja reprogramación celular, mediada por mecanismos epigenéticos y moleculares como la remodelación de la cromatina (vía modificaciones postraduccionales de histonas), patrones de metilación diferencial del ADN, reorganización del citoesqueleto y la generación de gradientes auxínicos mediados por reguladores del crecimiento vegetal (RCV) exógenos (Alvarez-Aragón et al., 2020; Gulzar et al., 2020; Reyes-Díaz et al., 2017, 2018).
En continuidad con investigaciones previas sobre A. angustifolia, se reconoce que los sistemas desarrollados hasta ahora han contribuido significativamente al entendimiento de la embriogénesis somática en esta especie (Reyes-Díaz et al., 2017, 2018). No obstante, es necesario seguir optimizando aspectos clave del proceso, como la frecuencia de inducción embrionaria, la sincronía en el desarrollo de los embriones, la estabilidad morfogénica y la conservación de la competencia embriogénica en cultivos prolongados (Aronen et al., 2025). En este contexto, el presente estudio tiene como objetivo evaluar el efecto de tres auxinas (2,4-diclorofenoxiacético [2,4-D], ácido indolacético [AIA] y ácido naftalenacético [ANA]) combinadas con N6-benciladenina (BA) sobre la inducción de embriogénesis somática en A. angustifolia, a partir de ejes embrionarios cigóticos. La comparación del efecto de auxinas naturales y sintéticas combinadas con BA es esencial para optimizar la embriogénesis somática en A. angustifolia, especie clave para la producción y conservación de germoplasma. Aunque el 2,4-D es el regulador más utilizado para inducir callo proembriogénico, su respuesta depende del genotipo y puede inducir variaciones somaclonales. Alternativamente, el AIA y el ANA, con diferentes propiedades fisiológicas y estabilidad metabólica, pueden modular rutas específicas de desdiferenciación y reprogramación embriogénica. La inclusión de BA permite evaluar sinergias auxina-citocinina críticas para la adquisición de competencia embrionaria. Este enfoque permite definir condiciones hormonales óptimas para lograr altos niveles de regeneración, estabilidad genética y escalabilidad, fortaleciendo plataformas biotecnológicas para la propagación y conservación sostenible de agaves.
Materiales y métodos
Ubicación del área experimental
El presente estudio fue desarrollado en el Laboratorio de Biología Molecular Vegetal, perteneciente al Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Fitomejoramiento (CIEAF), adscrito a la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMéx).
Material biológico
Se recolectaron semillas maduras de A. angustifolia (Figura 1A) en poblaciones silvestres del municipio de Zumpahuacán, Estado de México (18°48’N, 99°35’W). Las semillas fueron desinfectadas mediante un lavado inicial con detergente líquido neutro complementado con Tween® 20 al 0.1% (v/v) durante 15 minutos, seguido de un enjuague con agua destilada estéril. Posteriormente, se realizó una inmersión en etanol absoluto (96% v/v) durante un minuto y, enseguida, una desinfección con hipoclorito de sodio al 2% (p/v), bajo agitación orbital constante a 100 rpm durante 15 minutos. Finalmente, las semillas fueron enjuagadas tres veces con agua destilada estéril bajo condiciones asépticas en campana de flujo laminar. Una vez desinfectadas, se colocaron en agua estéril y refrigeración a 4-6º C en oscuridad absoluta durante 48 horas, como tratamiento de hidratación y estratificación previa. Al término de este periodo, se procedió a la disección manual de las semillas bajo microscopio estereoscópico (40×) para extraer asépticamente un total de 1620 ejes embrionarios cigóticos (EEC) maduros (Figura 1B), los cuales fueron utilizados como explantes para los experimentos de embriogénesis somática.
Figura 1 Proceso de embriogénesis somática en A. angustifolia a partir de ejes embrionarios cigóticos: A. Semilla madura de A. angustifolia. B. Eje embrionario cigótico aislado como explante inicial. C. Inicio de la desdiferenciación celular a los 5 ddic. D. Formación de callo proembriogénico compacto de color amarillo perlado a los 40 ddic. E. Desarrollo de estructuras globulares indicativas de embriones somáticos globulares tempranos (flechas). F. Embriones somáticos en transición de estadios globular a escutelar (flechas), con morfología definida. G. Producción de embriones somáticos en estadio coleoptilar a los 100 ddic, en el tratamiento que contenía 22.62 µM de 2,4-D y 13.32 µM de BA. H. Plántulas completamente desarrolladas y exitosamente aclimatadas a condiciones ex vitro en invernadero, a los 202 ddic.
Inducción de callo proembriogénico (CPE)
Los EEC de A. angustifolia fueron establecidos en un medio de cultivo diseñado específicamente para la inducción de CPE y subsecuente histodiferenciación para la formación de embriones somáticos (ESS). El medio basal consistió en sales minerales MS (Murashige y Skoog, 1962) al 25% de su concentración estándar, suplementado con 60.0 g L⁻¹ de sacarosa, el complejo vitamínico L2 (250.0 mg L⁻¹ de inositol, 0.5 mg L⁻¹ de piridoxina y 2.0 mg L⁻¹ de tiamina), y combinaciones específicas de RCV. El diseño experimental fue completamente al azar con un arreglo factorial 3×3×3, en el cual se evaluó un gradiente de concentraciones auxina-citocinina compuesto por tres auxinas, cada una en tres concentraciones: 2,4-D (13.57, 18.10 y 22.62 µM), ANA (16.11, 21.48 y 26.85 µM) y AIA (17.13, 22.83 y 28.54 µM), combinadas con tres concentraciones de BA (4.44, 8.88 y 13.32 µM), generando un total de 27 tratamientos. Cada tratamiento fue replicado tres veces, utilizando una caja Petri como repetición, en cada repetición se establecieron 20 EEC; donde cada EEC se consideró como una unidad experimental individual.
El pH de los medios fue ajustado a 5.7 antes de la adición de 8.0 g L⁻¹ de agar como agente gelificante. La esterilización se realizó mediante autoclave a 121 °C y 1.1 kg·cm⁻² de presión durante 20 minutos. Las cajas fueron incubadas en oscuridad continua a 25 ± 2 °C durante un periodo de 60 días. Al finalizar este periodo (60 días después de iniciado el cultivo), se cuantificó el porcentaje de callogénesis y se clasificó el callo inducido en dos categorías morfológicas: CPE, distinguido por su textura compacta, color blanquecino brilloso a amarillento translúcido, apariencia nodular y organización celular densa; y callo no proembriogénico (CNPE), caracterizado por su consistencia friable, color blanco opaco a marrón, estructura desorganizada y tendencia a la oxidación.
Histodiferenciación de ESS
Los CPE, con una incipiente formación de ESS en estadio globular, fueron subsecuentemente transferidos a un medio de histodiferenciación, diseñado para promover la progresión a los estadios escutelar y coleoptilar. Este medio consistió en sales MS al 50% de su concentración original, vitaminas MS, 30.0 g L⁻¹ de sacarosa y suplementado con 0.45 µM de 2,4-D, 0.54 µM de ANA o 0.57 µM de AIA, según correspondiera, en todos los casos sin la adición de BA. Las condiciones de incubación se mantuvieron en oscuridad absoluta a 25 ± 2 °C durante un periodo adicional de 60 días, alcanzando un total de 120 días. La completa histodiferenciación fue evaluada cuantificando el número de ES coleoptilares generados por callo al término del periodo.
Germinación de ESS, conversión a plántulas y adaptación de plántulas a condiciones ex vitro
Para evaluar la conversión embrionaria a plántula, por tratamiento, se seleccionaron aleatoriamente diez ESS en el estadio coleoptilar. La selección aleatoria se realizó con el propósito de evitar sesgos asociados a la elección subjetiva de estructuras con diferente grado de desarrollo o vigor, garantizando así la representatividad biológica de la muestra dentro de cada tratamiento. Este procedimiento asegura que las variaciones observadas en la tasa de conversión reflejen de manera más objetiva el efecto de los RCV y las condiciones de cultivo, en lugar de diferencias atribuibles a la selección de los explantes.
Estos embriones en estado coleoptilar fueron transferidos a un medio de germinación, MS al 50% sin adición de RCV, bajo un fotoperiodo de 16 h luz/8 h oscuridad y a 25 ± 2 °C, hasta que la plántula alcanzara una altura promedio de 5 cm. Las plántulas regeneradas se extrajeron cuidadosamente de los frascos de cultivo in vitro, eliminando los restos de medio de cultivo mediante enjuagues suaves con agua destilada estéril para evitar contaminación. Posteriormente, se seleccionaron aquellas con raíces bien desarrolladas, turgentes y sin signos de necrosis. Cada plántula se trasplantó en una maceta individual previamente esterilizada, que contenía una mezcla homogénea de perlita, composta y suelo agrícola en proporciones 1:1:1, previamente autoclavada para garantizar la asepsia del sustrato. Las macetas se colocaron en un invernadero con temperatura y humedad controladas, bajo luz difusa, y se mantuvieron cubiertas con plástico transparente durante la primera semana para conservar una alta humedad relativa y reducir el choque hídrico. Durante las tres semanas de aclimatación, las cubiertas se retiraron gradualmente para favorecer la adaptación de las plántulas a condiciones ex vitro, hasta alcanzar su total exposición al ambiente del invernadero.
Variables evaluadas
Las variables morfogenéticas cuantificadas incluyeron:
a) Porcentaje de callos proembriogénicos (%): proporción de explantes que desarrollaron estructuras callogénicas respecto al total de explantes cultivados a los 60 días después de iniciado el cultivo (ddic), expresada como porcentaje.
b) Densidad embriogénica: número de embriones somáticos coleoptilares por callo, cuantificados a los 120 ddic mediante conteo directo bajo microscopio óptico en cámara de Neubauer.
c) Eficiencia embriogénica: promedio de embriones somáticos coleoptilares generados por tratamiento a los 120 ddic, expresado como el número total de embriones somáticos coleoptilares dividido entre el número total de explantes (eje embrionario cigótico) por tratamiento.
d) Tasa de aclimatación (%): proporción de plántulas viables y completamente adaptadas a condiciones ambientales ex vitro a los 202 ddic, respecto al total de plantas transferidas desde condiciones in vitro.
Análisis estadístico
Los datos cuantitativos obtenidos para las variables morfogenéticas, porcentaje de CPE, densidad embriogénica, eficiencia embriogénica y tasa de aclimatación, fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA), empleando el software MENU versión 2.5, con el objetivo de identificar diferencias significativas entre los tratamientos. En los casos en que se detectaron diferencias estadísticas significativas (F test, P< 0.05), se procedió a realizar una comparación de medias mediante la prueba de rango múltiple de Tukey con un nivel de confianza del 95%. Los resultados fueron expresados como medias ± error estándar.
Resultados
Inducción de CPE
La formación de CPE en EEC de A. angustifolia dependió de la interacción entre auxinas y citocininas, con una respuesta claramente modulada por el tipo de auxina aplicada. La desdiferenciación celular fue un evento temprano y evidente desde los 5 ddic (Figura 1C). A partir de los 20 ddic (Figura 1D) y hasta los 60 ddic, las masas callosas alcanzaron un desarrollo significativo, permitiendo distinguir visualmente diferencias morfológicas entre CPE y CNPE.
Entre las combinaciones evaluadas, los tratamientos que incluyeron 2,4-D junto con BA fueron los únicos eficientes para la formación de CPE (Tabla 1). Destacó particularmente la combinación de 18.10 µM de 2,4-D y 4.44 µM de BA, la cual alcanzó una callogénesis del 97.8 ± 1.6%, significativamente superior al resto de los tratamientos de acuerdo con el análisis estadístico. Este tratamiento promovió la formación de callos con rasgos característicos de competencia embriogénica (CPE), incluyendo textura friable, color amarillo perlado, superficie homogénea y la presencia de estructuras globulares compatibles con embriones somáticos en estadios tempranos, en concordancia con lo señalado por Reyes-Díaz et al., (2017, 2018). En contraste, los CNPE, mostraron una morfología irregular, con tejidos gelatinosos, oxidación evidente y estructura heterogénea.
Tabla 1 Porcentaje de callogénesis y tipo de callo generado a partir de ejes embrionarios cigóticos de A. angustifolia cultivados en medio suplementado con distintas combinaciones de auxinas (2,4-D, ANA o AIA) y N6-benciladenina (BA), a los 60 ddic.Table 1. Percentage of callogenesis and type of callus generated from zygotic embryo axes of A. angustifolia cultured on medium supplemented with different combinations of auxins (2,4-D, NAA, or IAA) and N6-benzyladenine (BA), at 60 daci.
| Tratamiento (µM) | Callogénesis (%) (media ± EE) |
Tipo de Callo | ||
|---|---|---|---|---|
| Auxina | Citocinina | |||
| 2,4-D | BA | |||
| 13.57 | 4.44 | 58.7 ± 4.5 | b | CPE - CNPE |
| 8.88 | 52.3 ± 3.9 | bc | CPE - CNPE | |
| 13.32 | 62.1 ± 5.1 | b | CNPE | |
| 18.10 | 4.44 | 97.8 ± 1.6 | a | CPE - CNPE |
| 8.88 | 63.4 ± 4.8 | b | CPE - CNPE | |
| 13.32 | 78.9 ± 3.7 | ab | CPE - CNPE | |
| 22.62 | 4.44 | 94.3 ± 2.2 | a | CNPE |
| 8.88 | 81.5 ± 3.1 | ab | CPE - CNPE | |
| 13.32 | 59.7 ± 5.5 | b | CPE - CNPE | |
| ANA | BA | |||
| 16.11 | 4.44 | 91.4 ± 3.2 | a | CNPE |
| 8.88 | 98.6 ± 1.0 | a | CNPE | |
| 13.32 | 89.3 ± 4.1 | a | CNPE | |
| 21.48 | 4.44 | 79.8 ± 3.9 | ab | CNPE |
| 8.88 | 82.6 ± 3.5 | ab | CNPE | |
| 13.32 | 97.1 ± 1.7 | a | CNPE | |
| 26.85 | 4.44 | 68.9 ± 5.2 | bc | CNPE |
| 8.88 | 83.7 ± 3.3 | ab | CNPE | |
| 13.32 | 99.2 ± 0.5 | a | CNPE | |
| AIA | BA | |||
| 17.13 | 4.44 | 8.4 ± 1.7 | d | CNPE |
| 8.88 | 9.2 ± 2.0 | d | CNPE | |
| 13.32 | 6.8 ± 1.2 | e | CNPE | |
| 22.83 | 4.44 | 10.0 ± 2.5 | d | CNPE |
| 8.88 | 7.5 ± 1.8 | de | CNPE | |
| 13.32 | 6.2 ± 1.0 | e | CNPE | |
| 28.54 | 4.44 | 9.7 ± 2.3 | d | CNPE |
| 8.88 | 5.9 ± 1.1 | e | CNPE | |
| 13.32 | 8.1 ± 1.5 | d | CNPE | |
CPE: Callo proembriogénico, CNPE: Callo no proembriogénico. Letras distintas (a, b, c, d, e) indican diferencias estadísticas significativas entre tratamientos según la prueba de Tukey (P < 0.05). Los valores corresponden a la media de tres repeticiones ± error estándar (EE).
Particularmente, los tratamientos con ANA también indujeron altos porcentajes de formación de callo (frecuentemente superiores al 80%); sin embargo, la morfología resultante difirió notablemente. Los callos presentaron textura compacta a semisólida, tonalidades verde-crema y apariencia heterogénea, sin estructuras nodulares ni masas proembriogénicas bien definidas. En estos cultivos se registró una elevada frecuencia de organogénesis indirecta, reflejada en la aparición de raíces adventicias y brotes emergentes desde el tejido calloso (Figura 2A). No se observaron estructuras compatibles con embriones somáticos en ninguno de los tratamientos basados en ANA, clasificándose como callos no proembriogénicos (CNPE).
Figura 2 Respuesta morfogénica no embriogénica en explantes de A. angustifolia cultivados con ANA o AIA en combinación con BA: A. Formación de callo no proembriogénico con desarrollo de raíces (1.5 cm) y brotes adventicios (3.0 cm) a los 20 ddic, en tratamientos con ácido naftalenacético (ANA) más BA. Las flechas indican estructuras diferenciadas. B. Callo parcialmente oxidado observado entre los 20 y 60 ddic, con brotes de hasta 3.0 cm de longitud formados a los 50 ddic (flechas), en tratamientos suplementados con ácido indolacético (AIA) más BA. Esta respuesta sugiere una vía rizogénica o adventicia alternativa, sin evidencia de embriogénesis somática.
Aún más limitada fue la respuesta obtenida con AIA, donde la callogénesis fue escasa (8.0 ± 1.7% en promedio), sin evidencia de formación de CPE (Tabla 1). No obstante, en algunos explantes tratados con AIA se observó la aparición espontánea de brotes, aunque sin desarrollo embriogénico claro (Figura 2B).
Histodiferenciación de ESS
La histodiferenciación de ESS en A. angustifolia se presentó exclusivamente en los tratamientos que incluyeron la combinación de 2,4-D con BA, lo que evidencia una alta especificidad hormonal para inducir embriogénesis somática en esta especie.
De los nueve tratamientos empleados con 2,4-D (Tabla 2), siete lograron inducir la formación de ESS (Figuras 1E y 1F), aunque con eficiencias variables tanto en número como en frecuencia de aparición. El tratamiento más eficiente fue 22.62 µM de 2,4-D combinado con 13.32 µM de BA siendo significativamente superior al resto de los tratamientos, con una eficiencia embriogénica promedio de 17.6 ± 7.1 ES por explante (Figura 1G), alcanzando hasta 36 embriones en estadio coleoptilar por explante (Tabla 2). Estos embriones emergieron directamente a partir de los CPE.
Tabla 2 Densidad y eficiencia embriogénica en ejes embrionarios cigóticos de Agave angustifolia cultivados inicialmente en medio suplementado con distintas combinaciones de 2,4-D y BA, a los 120 ddic.Table 2. Embryogenic density and efficiency in zygotic embryo axes of Agave angustifolia initially cultured on medium supplemented with different combinations of 2,4-D and BA, at 120 daci.
| Tratamiento (µM) | Densidad embriogénica | Eficiencia embriogénica (media ± EE) |
||
|---|---|---|---|---|
| Auxina | Citocinina | |||
| 2,4-D | BA | |||
| 13.57 | 4.44 | 8 - 11 | 9.5 ± 0.4 | b |
| 8.88 | 4 | 4.0 ± 0.0 | c | |
| 13.32 | - | - | - | |
| 18.10 | 4.44 | 9 - 11 | 10.0 ± 0.6 | b |
| 8.88 | 2 - 6 | 4.0 ± 0.7 | c | |
| 13.32 | 2 - 25 | 13.5 ± 3.5 | ab | |
| 22.62 | 4.44 | - | - | - |
| 8.88 | 6 | 6.0 ± 0.0 | bc | |
| 13.32 | 1 - 36 | 17.6 ± 7.1 | a | |
La densidad embriogénica representa el rango mínimo y máximo de embriones somáticos coleoptilares observados por explante. La eficiencia embriogénica corresponde al número promedio de embriones somáticos coleoptilares por explante ± error estándar (EE). Letras distintas (a, b, c) indican diferencias estadísticas significativas entre tratamientos, según la prueba de Tukey (P < 0.05). El guion (-) indica ausencia de respuesta embriogénica en ese tratamiento.
La identificación de los ESS se realizó mediante observación morfológica a los 60 ddic, destacando su forma globular o escutelar, así como su tonalidad más brillante y definida respecto al callo circundante. Esta distinción permitió su aislamiento y posterior transferencia a medio de histodiferenciación para favorecer su maduración hacia estadios más avanzados, principalmente el cotiledonar o coleoptilar, hacia los 120 ddic.
Otros tratamientos con respuesta embriogénica considerable fueron 18.10 µM de 2,4-D + 13.32 µM de BA y 18.10 µM de 2,4-D + 4.44 µM de BA, con eficiencias de 13.5 ± 3.5 y 10.0 ± 0.6 ES por explante, respectivamente. En contraste, la combinación 13.57 µM de 2,4-D + 8.88 µM de BA produjo escasa cantidad de ESS (4.0).
En cambio, ninguno de los tratamientos que emplearon ANA o AIA fue capaz de inducir embriones somáticos, a pesar de que ambos RCV promovieron una callogénesis abundante (Tabla 1). Los tejidos generados bajo estas condiciones correspondieron exclusivamente a CNPE, sin evidencia de histodiferenciación embrionaria.
Germinación de ESS, conversión a plántulas y adaptación de plántulas a condiciones ex vitro
Los ESS obtenidos a partir de CPE fueron transferidos a un medio de germinación libre de RCV para inducir su conversión en plántulas completas. Este paso resultó fundamental para evaluar la funcionalidad de las estructuras embrionarias generadas. La mayoría de los ESS avanzó hacia la diferenciación de ejes radiculares y meristemos caulinares, presentando características morfológicas típicas de embriones cigóticos en desarrollo, como simetría bilateral, formación de hipocótilo y apertura del coleóptilo. La tasa de conversión fue elevada (96%), especialmente en aquellos tratamientos hormonales donde se observaron densidades embriogénicas más altas y estructuras más organizadas (como en la combinación de 22.62 µM de 2,4-D con 13.32 µM de BA), lo que indica un proceso de embriogénesis somática funcional y eficiente.
Posteriormente, las plántulas regeneradas fueron exitosamente transferidas y aclimatadas a condiciones ex vitro, utilizando un sustrato compuesto en proporciones iguales de perlita, composta, y suelo agrícola (1:1:1) (Figura 1H). Esta formulación ofreció una textura, aireación y retención hídrica adecuadas, permitiendo una transición gradual desde el ambiente in vitro, altamente controlado y estéril, hacia un entorno más complejo y variable. El proceso de aclimatación fue progresivo, iniciando con condiciones de humedad relativa elevada y sombra parcial, y reduciendo estos factores de forma escalonada a lo largo de 3 semanas. El resultado fue una tasa de supervivencia del 100%, lo que representa un indicador de la viabilidad fisiológica y estructural de las plántulas.
Inducción de CPE
La inducción de callo en A. angustifolia mostró una respuesta diferencial según la auxina utilizada, lo que indica que este proceso no depende únicamente del tipo de regulador exógeno, sino del equilibrio entre las concentraciones internas de auxinas y las condiciones fisiológicas del explante. Esta interacción sugiere que la competencia celular para responder a los estímulos hormonales está modulada por la sensibilidad tisular y el estado metabólico del tejido, más que por la naturaleza química de la auxina añadida al medio (Aronen et al., 2025). La interacción entre auxinas y citocininas, particularmente la combinación de 2,4-D con BA, resultó ser determinante para la inducción de CPE, como también ha sido reportado en otros sistemas embriogénicos en A. angustifolia (Reyes-Díaz et al., 2017, 2018). La eficacia de este tratamiento no solo se reflejó en tasas elevadas de inducción, sino también en la calidad morfológica del callo generado, caracterizado por una organización celular compatible con estados embrionarios tempranos reportados previamente por (Reyes-Díaz et al., 2017, 2018). Estos rasgos, se correlacionan con una arquitectura celular organizada y meristemática, con núcleos prominentes, abundante citoplasma y baja vacuolización, condiciones necesarias para la totipotencia celular (Desai et al., 2022).
Desde una perspectiva fisiológica, el 2,4-D se comporta como un potente inductor debido a su estabilidad metabólica y su afinidad con receptores clave de la señalización auxínica, modulando la expresión de genes relacionados con la desdiferenciación celular y la transición al estado embrionario (Gulzar et al., 2020), lo cual podría explicar la mayor proporción de CPE observados en los tratamientos con esta auxina. A su vez, la citocinina BA complementa este efecto al promover divisiones celulares controladas, favoreciendo la formación de estructuras meristemáticas organizadas necesarias para el establecimiento de estructuras embriogénicas (Schaller et al., 2015).
En cambio, los CNPE observados en tratamientos con menor eficacia o con auxinas distintas, presentaron una morfología desorganizada y características como textura gelatinosa y oxidación, lo que sugiere un crecimiento caótico y una insuficiente reprogramación génica para iniciar la embriogénesis. Esta distinción entre CPE y CNPE no solo es morfológica, sino funcional, ya que la presencia de CNPE en un cultivo puede interferir con la maduración de embriones somáticos verdaderos, al competir por recursos y espacio. Adicionalmente, la coexistencia de CPE y CNPE dentro de un mismo sistema de cultivo constituye un fenómeno fisiológico relevante, asociado a la plasticidad de los tejidos bajo condiciones hormonales inductivas. Esta coexistencia se interpreta como la expresión simultánea de rutas morfogenéticas competitivas, donde la porción de tejido con reorganización meristemática adquiere potencial embriogénico, mientras que el tejido no competente expresa vías organogénicas o proliferativas desorganizadas. Esta dinámica ha sido señalada como característica en sistemas con alta presión auxínica, particularmente con 2,4-D, y se reconoce su implicación funcional al influir en la disponibilidad de recursos y en la eficiencia global de la embriogénesis. (Radoeva et al., 2019; Wang et al., 2022).
En contraste con el 2,4-D, el ANA mostró una elevada capacidad de callogénesis (superior al 90%), pero los tejidos inducidos carecieron de potencial embriogénico. Su tendencia a promover rizogénesis y brotación adventicia sugiere que el ANA favorece rutas de desarrollo unipolar, inhibiendo la formación de estructuras embrionarias bipolares (Teale y Palme, 2018). Esta respuesta puede atribuirse a la mayor estabilidad química del ANA, que evita su degradación rápida pero también impide el establecimiento de gradientes hormonales dinámicos, los cuales son necesarios para activar rutas embriogénicas (Ascough y Fennell, 2004; Schaller et al., 2015).
Aún más limitada fue la respuesta observada con el uso de AIA, lo que puede atribuirse a su baja estabilidad fisiológica y, por ende, a una disponibilidad reducida de auxina activa en el medio de cultivo (Azizi et al., 2015). A diferencia de otras auxinas sintéticas como el 2,4-D o el ANA, el AIA, de naturaleza endógena, es susceptible a una rápida degradación por procesos de oxidación fotoinducida o por conjugación enzimática con azúcares y aminoácidos, lo que reduce su vida media incluso bajo condiciones controladas de cultivo; en consecuencia, la limitada estabilidad del AIA podría explicar su escasa eficacia en la inducción de desdiferenciación celular. La aparición esporádica de brotes adventicios en algunos explantes tratados con esta auxina sugiere, más bien, la activación de vías morfogenéticas preexistentes de tipo organogénico, en ausencia de una señal embriogénica específica (Jing y Strader, 2019; Węgrzynowicz-Lesiak et al., 2013).
Un elemento adicional para considerar es el papel del estrés oxidativo moderado como señal inductora de embriogénesis. Se ha propuesto que el 2,4-D genera niveles controlados de especies reactivas de oxígeno (ROS), los cuales pueden actuar como señales para activar vías de desarrollo alternativas (Fehér, 2015). En este contexto, se ha reportado que la incapacidad del ANA y el AIA para inducir una señal ROS adecuada o en el momento preciso podría explicar su limitada eficacia embriogénica y su tendencia a dirigir el desarrollo hacia rutas organogénicas (Desai et al., 2022; Schaller et al., 2015).
En conjunto, estos resultados subrayan la importancia del tipo y concentración de RCV, así como de sus propiedades fisicoquímicas, para la inducción exitosa de CPE. Además, refuerzan la necesidad de establecer condiciones hormonales óptimas que promuevan no solo la proliferación celular, sino también su organización funcional hacia una ruta embrionaria específica.
Histodiferenciación de ESS
La histodiferenciación de ESS en A. angustifolia demuestra una marcada especificidad hormonal que evidencia la selectividad funcional de los RCV en la inducción y desarrollo de estructuras embrionarias completas. La exclusividad de la combinación de 2,4-D y BA para promover la formación de ES destaca la importancia crítica de la interacción sinérgica entre auxinas sintéticas y citocininas en la modulación de rutas señalizadoras y epigenéticas que reprograman células somáticas hacia estados de totipotencia (Radoeva et al., 2019; Zeng et al., 2007).
El análisis diferencial de las respuestas embriogénicas a distintas concentraciones de 2,4-D refleja un patrón clásico de dosis-respuesta no lineal, donde un rango óptimo de concentración es determinante para el equilibrio entre proliferación celular desorganizada y la inducción de programas genéticos específicos para la embriogénesis (Su et al., 2011). Este equilibrio se ve comprometido cuando las concentraciones de auxinas o citocininas están fuera de este rango, lo que puede generar inhibición por supraestimulación o insuficiente activación de vías críticas (Schaller et al., 2015; Su et al., 2011).
El papel del 2,4-D como un regulador clave en la embriogénesis somática está respaldado por su capacidad para inducir modificaciones epigenéticas dinámicas, incluyendo la metilación del ADN y modificaciones de histonas que resultan en la activación de genes maestros de identidad embrionaria (Zhang et al., 2025), tales como LEC1 (LEAFY COTYLEDON 1), BBM (BABY BOOM), WUS (WUSCHEL) y SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTORS LIKE KINASE) (Gulzar et al., 2020; Wang et al., 2022; Zeng et al., 2007). Estos genes forman parte de redes transcripcionales que coordinan la desdiferenciación, proliferación y la posterior organización espacial y funcional de células meristemáticas (Gulzar et al., 2020; Tian et al., 2020). En este contexto, la BA potencia la señalización celular mediante la promoción de divisiones celulares ordenadas y la polarización tisular, fundamentales para la formación de estructuras bipolares características de embriones somáticos coleoptilares maduros (Cárdenas-Aquino et al., 2023; Domínguez-Rosales et al., 2008). Esta morfología coincide con modelos anatómicos y ultraestructurales reportados en otras monocotiledóneas donde la diferenciación embrionaria somática refleja la organización histológica de embriones cigótico (Bai et al., 2000).
Por otro lado, la incapacidad de los tratamientos con ANA y AIA para inducir ESS, a pesar de su capacidad para estimular callogénesis, evidencia la complejidad del metabolismo hormonal y la señalización celular. El ANA, por su alta estabilidad y menor degradación oxidativa, tiende a mantener concentraciones supraóptimas que promueven rutas unipolares como la rizogénesis y la formación de brotes adventicios, probablemente por mantener gradientes hormonales poco dinámicos, esenciales para la embriogénesis (Abas et al., 2021; Teale y Palme, 2018). En cuanto al AIA, su rápida degradación vía AIA-oxidasa y conjugación limita la persistencia del estímulo auxínico necesario para la reprogramación celular, provocando en su lugar la activación de rutas vegetativas preformadas (Batista-Silva et al., 2024).
La dinámica de la señalización hormonal se ve complementada por la reducción progresiva de 2,4-D durante la fase de histodiferenciación (0.45 µM), que actúa como un desencadenante epigenético para la maduración de ESS. Este proceso de “reversión hormonal” facilita la transición de un estado proliferativo a uno de diferenciación morfogénica ordenada, promoviendo la polarización celular y la formación de tejidos organizados, un mecanismo fundamental para la obtención de ESS fisiológicamente competentes (Batista-Silva et al., 2024; Bouchez et al., 2024).
En suma, la embriogénesis somática en A. angustifolia es un proceso multifactorial que requiere la coordinación precisa de señales hormonales, modificaciones epigenéticas y dinámicas celulares. La combinación de 2,4-D y BA no solo promueve la desdiferenciación, proliferación e histodiferenciación, sino que también induce la expresión de redes génicas embrionarias necesaria para la formación y maduración de embriones somáticos funcionales. Los resultados obtenidos aportan evidencia sobre los mecanismos fisiológicos y morfogenéticos asociados al proceso de embriogénesis somática en Agave angustifolia. En particular, destacan la respuesta diferencial de los explantes frente a distintas auxinas y citocininas, así como su influencia en la inducción de callo y la formación de estructuras embriogénicas. Estos hallazgos permiten comprender con mayor precisión las condiciones que favorecen la regeneración somática en esta especie, contribuyendo al establecimiento de un sistema eficiente de propagación in vitro dentro del contexto experimental del presente estudio.
Germinación de ESS, conversión a plántulas y adaptación de plántulas a condiciones ex vitro
La transferencia de ESS obtenidos a partir de CPE a un medio libre de RCV representa un paso crítico para la evaluación funcional y fisiológica de las estructuras embriogénicas generadas. La alta tasa de conversión observada (96 %) evidencia que las condiciones hormonales y nutricionales previas favorecieron la formación de ESS plenamente competentes, capaces de completar la diferenciación de ejes radiculares y meristemos caulinares, emulando con precisión el desarrollo morfológico de embriones cigóticos. Esta simetría bilateral, junto con la formación de hipocótilo y la apertura del coleóptilo, indica una correcta polarización y organización tisular, elementos fundamentales para la viabilidad y funcionalidad post-germinativa (Azizi et al., 2015).
El éxito en la aclimatación ex vitro, con una tasa de supervivencia del 100 %, confirma la calidad morfofisiológica y la integridad estructural de las plántulas regeneradas. La formulación del sustrato, con proporciones balanceadas de perlita, composta y suelo agrícola, proporcionó las condiciones físicas óptimas para asegurar una transición gradual y eficaz desde el ambiente in vitro, altamente regulado y estéril, hacia un entorno ex vitro caracterizado por una mayor variabilidad ambiental. La aplicación de un protocolo progresivo de aclimatación, que inicia con alta humedad relativa y sombra parcial, es congruente con estrategias recomendadas para minimizar el estrés hídrico y fotooxidativo durante la adaptación inicial (Li y Pritchard, 2009).
Estos resultados resaltan que la embriogénesis somática, cuando es inducida bajo un régimen hormonal adecuado, no solo asegura la formación de embriones viables, sino que también contribuye significativamente a la correcta diferenciación de sistemas vasculares funcionales y tejidos especializados, elementos clave para la resiliencia fisiológica en condiciones ex vitro. La conservación de órganos como raíces funcionales y meristemos apicales activos durante la fase de aclimatación indica que la calidad del desarrollo embriogénico impacta positivamente en la capacidad de establecimiento autónomo, eliminando la necesidad de tratamientos adicionales para la adaptación.
Asimismo, se puede inferir que la configuración hormonal empleada, particularmente la combinación de 2,4-D y BA durante las etapas iniciales, influye más allá de la inducción embrionaria, modulando la calidad estructural y fisiológica final de las plantas regeneradas. Este efecto refleja la importancia no solo de la presencia de RCV, sino también de su estabilidad metabólica, interacción sinérgica y efectos epigenéticos acumulativos, factores que deben ser considerados para el diseño y optimización de protocolos eficientes de propagación in vitro (Aronen et al., 2025).
En suma, el protocolo basado en 2,4-D y BA no solo constituye un método eficiente para la inducción de estructuras embriogénicas, sino que establece un modelo hormonal integralmente competente que guía con éxito el proceso regenerativo completo, desde la inducción, maduración y germinación, hasta la aclimatación ex vitro de plántulas viables y fisiológicamente funcionales.
Conclusiones
La embriogénesis somática en A. angustifolia fue inducida exitosamente a partir de ejes embrionarios cigóticos, utilizando medios enriquecidos con RCV específicos. De los tratamientos evaluados, la combinación más eficiente consistió en el medio suplementado con 22.62 µM de 2,4-D y 13.32 µM de BA, la cual promovió la formación de callo embriogénico y la posterior diferenciación de embriones somáticos bien estructurados (17.6 ± 7.1).
Los resultados evidencian una fuerte especificidad hormonal en el proceso embriogénico, con el 2,4-D como el inductor más efectivo de totipotencia celular y la BA como modulador esencial en la organización meristemática. A diferencia del 2,4-D, las auxinas AIA y ANA no promovieron embriogénesis, confirmando su baja eficacia en este sistema. La eficiencia embriogénica mostró una clara dependencia de la concentración y combinación hormonal, con una correlación positiva entre las dosis de 2,4-D/BA y el número de embriones por explante.
Tras la germinación in vitro de los embriones somáticos en medio libre de RCV, las plántulas desarrolladas presentaron morfología y funcionalidad completas. Su transferencia a condiciones ex vitro, empleando un sustrato equilibrado, resultó en una tasa de supervivencia del 100 %, lo que valida la robustez del protocolo y el alto potencial regenerativo de los embriones inducidos.
En conjunto, estos hallazgos posicionan al sistema 2,4-D/BA como una herramienta biotecnológica eficiente para la propagación masiva, conservación y mejoramiento genético de A. angustifolia, con aplicaciones concretas en agricultura sustentable y restauración ecológica.
