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Introducción
En las últimas décadas el cultivo de cacao se ha visto en crisis debido a un decrecimiento en la producción desde que iniciaron los brotes de enfermedades severas como la moniliasis, la mancha negra de la mazorca y la escoba de bruja (Aguirre-Medina et al., 2010; Hernández-Gómez et al., 2015). Estas enfermedades ocasionan del 10 al 25% de pérdidas de la producción mundial de cacao; esto conlleva a que los productores cambien sus plantaciones de cacao por otras alternativas, poniendo en riesgo las variedades genéticas criollas asociada con su cultivo (Aguirre-Medina et al., 2010).
Ante esta problemática, el Campo Experimental Rosario Izapa (CERI) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), en Chiapas, inició un programa de mejoramiento genético en 2004, dirigido a la obtención de clones resistentes a la moniliasis. El resultado fue más de 600 híbridos evaluados en la región del Soconusco Chiapas (Aguirre-Medina et al., 2010), de los cuales ha sido posible el registro de nuevas variedades por métodos convencionales de mejoramiento y por selección participativa (Avendaño-Arrazate et al., 2018; Solís et al., 2015).
Durante el mejoramiento genético convencional, la disponibilidad de flores en campo y la asincronía entre genotipos de interés representa una limitante en un programa de cruzamientos y los enfoques in vitro, donde diversas estructuras florales -como pétalos, estaminodios y anteras- son utilizadas como explantes para inducir embriogénesis somática o establecer líneas embriogénicas haploides (Robles, 2015; Silva et al., 2005).
Si bien la crioconservación de polen podría beneficiar directamente los cruzamientos convencionales, durante los programas de mejoramiento genético, la conservación de estructuras florales somáticas tiene un enfoque distinto: preservar material genético de alto valor con la capacidad de regenerar plantas completas a través de procesos biotecnológicos (Ballesteros et al., 2024). Por ello, la crioconservación de pétalos, estaminodios y anteras puede convertirse en una herramienta estratégica para la propagación clonal futura de materiales élite, así como para la generación de nuevas variantes genéticas vía embriogénesis somática o transformación genética (Guan et al., 2016; Mohammadi et al., 2023).
Por lo antes expuesto, en un programa de inducción de embriogénesis somática en cacao, con fines de conservación de la diversidad o creación de variabilidad genética, es importante contar con un número adecuado y constante de flores. Sin embargo, los explantes florales de cacao no pueden ser conservados en condiciones ambientales más de dos días, pues tienden a necrosarse rápidamente, por lo que se ha buscado nuevas técnicas de conservación apoyadas en el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales, que aseguren la viabilidad del material por tiempo prolongado y permitan su disponibilidad independiente de la temporada de floración, para estudios de conservación y propagación in vitro.
La crioconservación es un método de conservación a largo plazo, el cual consiste en llevar un material biológico desde su temperatura fisiológicamente normal a temperaturas ultra bajas: a -196 °C sumergido en nitrógeno líquido, o a -150 °C en la fase de vapor de nitrógeno líquido (Engelmann & González-Arnao, 2013; Mosa et al., 2023). A esta temperatura la división celular y los procesos metabólicos cesan, por lo que el material puede permanecer almacenado por tiempo indefinido sin presentar deterioro fisiológico ni alteraciones metabólicas significativas. Sin embargo, el éxito del proceso depende del acondicionamiento que se dé al material vegetal para que resista tanto el congelamiento, como el descongelamiento. Tal acondicionamiento consiste en provocar una deshidratación protectora en las células y tejidos de manera que se evite la formación de cristales de hielo que provocan grandes daños en las membranas de la mayoría de las células (Engelmann & González-Arnao, 2013; Gowthami et al., 2025).
Las técnicas de crioconservación podrían ser una alternativa para optimizar el uso de estos tejidos en cualquier estación del año (Adu-Gyamfi et al., 2016). Hasta el momento hay estudios sobre la crioconservación de embriones somáticos por el método de encapsulación-deshidratación (Pence, 1991), así como de callos por el método de encapsulación-vitrificación (Pineda-Aguilar et al., 2016). Sin embargo, es poco lo que se ha explorado sobre el potencial de conservar otros tipos de explantes de cacao, como los florales, los cuales representan el punto de partida en la inducción de embriogénesis somática y su preservación permitiría disponer de material embriogénico durante todo el año, reduciendo la dependencia de la floración natural y asegurando la continuidad de los programas de propagación in vitro.
El presente trabajo tiene como objetivo evaluar la influencia del genotipo, tipo de explante floral y variantes en las técnicas criogénicas de encapsulación-vitrificación y encapsulación-deshidratación en la viabilidad de explantes florales de cacao sometidos a crioconservación.
Materiales y métodos
Los experimentos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biotecnología del Campo Experimental Rosario Izapa del INIFAP en Tuxtla Chico, Chiapas, México. El material biológico utilizado como explantes fue: pétalos, estaminodios y anteras, de los híbridos interclonales F9P10 y F10P3, producto del cruzamiento de cacaos forasteros resistentes a la moniliasis, con cacaos criollos de calidad (Iracheta-Donjuan et al., 2017). Previamente, botones florales sin daños (cerrados), con 5 mm de diámetro y 5 a 7 mm de longitud, fueron etiquetados en árboles en campo y se les asperjó durante tres días con fungicida Amistar®, cuyo ingrediente activo es la azoxistrobina (50%, 1.5 g L⁻¹), un compuesto de acción sistémica y de contacto que inhibe la respiración mitocondrial de los hongos fitopatógenos (Bartlett et al., 2002).
Los botones se llevaron al laboratorio en un recipiente con algodón humedecido con una solución antioxidante-fungicida (Ácido cítrico 0.15 g L-1 + ácido ascórbico 0.1 g L-1 + sacarosa 30 g L-1 + Amistar® 1.5 g L-1). Enseguida se procedió a eliminar impurezas superficiales de los botones florales: estos se colocaron en una canastilla metálica y se lavaron con una solución de detergente líquido comercial y agua corriente durante 2 min, seguido de un enjuague con el flujo de agua de grifo por 2 min. Después, los botones en la canastilla se sumergieron en una solución de Amistar ® (1.5 g L⁻¹) esterilizada en autoclave (120 °C con 1.1 kg cm⁻² de presión, por 20 min) durante 10 min con agitación constante.
La desinfección se realizó en campana de flujo laminar siguiendo el protocolo de (Iracheta-Donjuan et al., 2017), consistente en lavados sucesivos en una solución de hipoclorito de sodio al 2 % (Cloralex ® ), durante 20 min, seguidos de tres enjuagues con agua destilada esterilizada en autoclave. Finalmente, los botones se transfirieron a una solución antioxidante de ácido cítrico (0.15 g L⁻¹), ácido ascórbico (0.1 g L⁻¹) y sacarosa (30 g L⁻¹), esterilizada en autoclave. Los botones permanecieron en esta solución durante todo el tiempo que duró la obtención de los explantes.
Para el establecimiento y mantenimiento se utilizó el medio de cultivo de inducción de callo embriogénico DKW (Driver & Kuniyuki, 1984) modificado por Iracheta-Donjuan et al. (2019), con la adición de 0.25 mg L-1 de Kinetina, 1.0 mg L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, suplementado con 30 g L-1 de glucosa, con pH de 5.7 y gelificado con 3.0 g L-1 de Gelrite (Sigma-Aldric®).
Experimento 1: Crioconservación por el método de encapsulación-deshidratación
Los explantes se precultivaron en medio DKW modificado durante un día, bajo condiciones asépticas, previo a la aplicación de los tratamientos de crioconservación. Este paso permitió disponer oportunamente del material vegetal para su posterior encapsulación y tratamiento criogénico.
Metodología (Figura 1): Para la encapsulación, los explantes previamente cultivados se colocaron dentro de una campana de flujo laminar en láminas de aluminio esterilizados en autoclave, de 10 × 40 mm con cinco cavidades a manera de crioplacas. En cada cavidad se adicionaron de 6 a 10 μL de alginato de sodio al 3 % (esterilizado), según Marassi et al. (2006), y los explantes se recubrieron con un volumen similar de la misma solución. Posteriormente, se agregaron 6 μL de cloruro de calcio (100 mM, esterilizado) para inducir la gelificación del alginato, y las crioplacas se dejaron reposar dentro de la campana de flujo laminar durante 15 min para completar la encapsulación. Después, las crioplacas (conteniendo los tejidos encapsulados), se sumergieron en una solución de carga SC (sacarosa 0.4 M + glicerol 2 M) durante 30 min, de acuerdo con Matsumoto & Niino (2017) (Figura 1B). En total se llenaron 48 crioplacas, con cinco explantes cada una (ocho crioplacas de cada tipo de explante por genotipo).
Figura 1 Proceso de encapsulación-deshidratación. Encapsulado (A), inmersión en SC (B), deshidratación con gel de sílice (C), deshidratación con flujo laminar (D), crioplaca con explantes en criovial (E), inmersión en nitrógeno líquido (F), descongelamiento (G) y recuperación de explantes para siembra (H).
Posteriormente, las crioplacas se extrajeron y escurrieron sobre cajas Petri con doble papel filtro esterilizado. Luego, las crioplacas fueron sometidas a diferentes métodos y tiempos de deshidratación: 24 crioplacas (4 crioplacas de cada explante por genotipo) se colocaron sobre cajas Petri dentro de un desecador con gel de sílice, 12 crioplacas (2 crioplacas de cada explante por genotipo) se dejaron por 3 h y las otras 12 por 5 h (Zhang et al., 2017) (Figura 1C); mientras que las 24 crioplacas restantes se dejaron directamente expuestas al flujo de la campana, 12 crioplacas (2 crioplacas de cada explante por genotipo) se dejaron expuesta por 3 h y las otras 12 crioplacas por 5 h) (Figura 1D). Una vez completada la deshidratación, las crioplacas se colocaron individualmente dentro de crioviales (Figura 1E), estos se fijaron cerrados en las criocañas y se sumergieron en nitrógeno líquido durante 1 h (Figura 1F). Al término del tiempo, las crioplacas se rescataron de los crioviales sumergidos en nitrógeno líquido y se pasaron a crioviales con 2 mL de solución de calentamiento (sacarosa 1.0 M, a temperatura ambiente), se taparon y se dejaron en temperatura ambiente a 25 °C durante 15 min (Figura 1G). Nuevamente, las crioplacas se escurrieron en cajas Petri con doble papel filtro.
Para la recuperación y establecimiento de los explantes, las crioplacas se colocaron en caja Petri se extrajeron los explantes encapsulados de las crioplacas y luego se rescataron de las cápsulas (Figura 1H), para enseguida sembrarlos en medio DKW modificado, se establecieron 10 explantes por tratamiento.
Diseño experimental
Veinticuatro tratamientos fueron establecidos, con 10 repeticiones cada uno, en los que un explante de pétalo, estaminodio o antera correspondió a una repetición. El total de tratamientos se obtuvo a partir de la interacción de dos genotipos, tres tipos de explantes, dos métodos de deshidratación y dos tiempos de deshidratación. Adicionalmente se establecieron seis blancos, los cuales consistieron en dos genotipos y tres tipos de explantes encapsulados, pero estos solo se sometieron a la SC por 30 min y se establecieron en medio DKW modificado sin pasar por el resto del proceso.
Experimento 2: Crioconservación por el método de encapsulación-vitrificación
Los explantes se precultivaron en medio DKW modificado con dos condiciones de sacarosa (sin sacarosa y 0.75 M) durante cinco días, con el objetivo de evaluar el efecto de la acumulación de carbohidratos sobre la recuperación de los explantes crioconservados
Metodología (Figura 2): Los explantes se encapsularon (Figura 2A) como fue descrito anteriormente, una vez que lo explantes se encontraran en las crioplacas, se sumergieron en la solución de carga SC (Figura 2B) como se especifica anteriormente. En total se llenaron 48 crioplacas con 5 explantes cada una (8 crioplacas de cada tipo de explante por genotipo).
Posteriormente, las crioplacas se extrajeron, escurrieron como se describe anteriormente y 24 crioplacas (dos crioplacas de cada explante por genotipo y condición de sacarosa en precultivo) se sumergieron en el crioprotector PVS2 [Glicerol 30%+ etilenglicol 15% + DMSO (Dimetilsulfóxido) 15% + sacarosa 0.4 M], por 15 min y las 24 crioplacas restantes se sumergieron en PVS4 (Glicerol 35 %+ etilenglicol 20 % + sacarosa 0.6 M), por el mismo tiempo (Pineda-Aguilar et al., 2016). Al término del tiempo, las crioplacas se sacaron y se escurrieron nuevamente.
Después del tratamiento con el crioprotector, las crioplacas se colocaron en crioviales, estos se fijaron a las criocañas y se sumergieron en nitrógeno líquido 1 h. Luego, las criocañas se sacaron de nitrógeno líquido, y se retiraron los crioviales, las crioplacas se pasaron a crioviales con 2 ml de solución de calentamiento, se taparon y se dejaron reposar 15 min.
Las crioplacas se escurrieron en una caja Petri con doble papel filtro. Finalmente, las crioplacas se colocaron en caja Petri y se recuperaron los explantes de las cápsulas, los cuales se sembraron en medio de cultivo MI (Figura 2). Se colocaron cinco explantes del mismo tipo por caja.
Diseño Experimental
En total se establecieron veinticuatro tratamientos, con 10 repeticiones cada uno, en los que un explante individual de pétalo, estaminodio o antera correspondió a una repetición. Este número se obtuvo a partir de la interacción entre los factores, dos genotipos, tres tipos de explantes, dos concentraciones de sacarosa en precultivo y dos crioprotectores. Adicionalmente se establecieron seis tratamientos testigos, denominados blancos, los cuales consistieron en los dos genotipos y tres tipos de explantes, estos se extrajeron y sembraron en medio DKW modificado un día antes del establecimiento final y solo se sometieron a la solución SC por 30 minutos y se establecieron en medio DKW modificado sin pasar por el resto del proceso.
Para ambos experimentos, los tratamientos y repeticiones se incubaron de acuerdo con un diseño experimental completamente a alzar con arreglo factorial. Los explantes se mantuvieron en un cuarto de incubación bajo condiciones controladas de temperatura a 25 ± 1 °C y en oscuridad total. El periodo de incubación duró 28 días, con evaluaciones a los 3, 7, 14 y 28 días después del establecimiento.
Las variables respuesta consistieron en: 1) Necrosamiento, determinado visualmente con base en el cambio de coloración de la superficie adaxial del explante; 2) Incremento de volumen, evaluado de forma cualitativa mediante la comparación visual del tamaño o volumen general respecto al tamaño inicial al momento de la siembra, considerándose incremento cuando el explante mostraba expansión evidente de tejidos o abultamiento; 3) Explantes con Callo, se consideraron aquellos explantes que presentaron la formación de un conglomerado amorfo de células no diferenciadas, de textura friable o compacta, visible en cualquier región del explante; 4) Viabilidad, evaluada mediante tinción diferencial con sales de tetrazolio al 1.0 % y azul de Evans al 0.25 %. Se consideraron viables los explantes que mostraron tinción parcial o total con el reactivo de tetrazolio (coloración rosada o rojiza), mientras que los tejidos muertos se tornaron azulados con el colorante de Evans, la evaluación de esta última variable se realizó a los 35 días después del establecimiento.
Análisis estadísticos
Para ambos experimentos, se realizó un análisis de varianza y comparación de medias, utilizando la prueba de Tukey con un nivel de significancia de 0.05, mediante el paquete estadístico SAS® 9.3. Los datos fueron transformados para darles una distribución normal, para ello se empleó la fórmula “
Resultados
Experimento 1: Crioconservación por el método de encapsulación-deshidratación
Se realizó un ANOVA y comparación de medias para las variables de necrosamiento y viabilidad a los 28 días después del establecimiento (Tabla 1), ya que no se observó incremento de volumen ni explantes con callo en los explantes crioconservados; a diferencia de los blancos (Tabla 2), de quienes se observó que las anteras fueron los explantes más afectados con el cultivo in vitro, toda vez que presentaron el mayor grado de necrosamiento (53.5 y 56.5 %), menor incremento de volumen (20 y 30 %) y menor producción de callo (0 y 10 %), respecto al resto de explantes. Y únicamente las anteras del genotipo F9P6 presentaron un 50 % de viabilidad. Por otra parte, si bien los estaminodios de ambos genotipos presentaron menor porcentaje de necrosamiento (0 y 17 %), fueron los explantes de pétalo los que indujeron mayor producción de callo (78 y 90 %).
Tabla 1 Niveles de Necrosamiento y supervivencia de explantes florales de dos genotipos de cacao crioconservados, sometidos a dos tiempos y métodos de deshidratación. Promedio a los 28 días después del establecimientoTable 1. Necrosis and survival levels of floral explants from two cryopreserved cacao genotypes subjected to two dehydration methods and durations. Mean values at 28 days after establishment
| Tratamientos | Necrosamiento | Viabilidad† | ||
|---|---|---|---|---|
| Genotipo/Explante/Deshidratación/Tiempo | (%) | (%) | ||
| T1: F9P6/P/Flujo/3h | 80.0 | ab†† | 80.0 | ab |
| T2: F9P6/P/Flujo/5h | 81.0 | ab | 0.0 | c |
| T3: F9P6/P/SG/3h | 74.0 | ab | 80.0 | ab |
| T4: F9P6/P/SG/5h | 83.0 | ab | 100.0 | a |
| T5: F9P6/E/Flujo/3h | 30.0 | cde | 0.0 | c |
| T6: F9P6/E/Flujo/5h | 21.0 | de | 0.0 | c |
| T7: F9P6/E/SG/3h | 26.5 | de | 0.0 | c |
| T8: F9P6/E/SG/5h | 25.0 | de | 0.0 | c |
| T9: F9P6/A/ Flujo/3h | 45.5 | bcde | 0.0 | c |
| T10: F9P6/A/ Flujo/5h | 30.5 | cde | 0.0 | c |
| T11: F9P6/A/ SG/3h | 21.5 | de | 0.0 | c |
| T12: F9P6/A/SG/5h | 35.0 | cde | 0.0 | c |
| T13: F19P3/P/ Flujo/3h | 71.0 | ab | 70.0 | b |
| T14: F19P3/P/ Flujo/5h | 77.0 | ab | 100.0 | a |
| T15: F19P3/P/ SG/3h | 82.0 | ab | 100.0 | a |
| T16: F19P3/P/SG/5h | 84.0 | a | 0.0 | c |
| T17: F19P3/E/ Flujo/3h | 59.0 | abc | 0.0 | c |
| T18: F19P3/E/ Flujo/5h | 55.0 | abcd | 0.0 | c |
| T19: F19P3/E/ SG/3h | 31.0 | cde | 0.0 | c |
| T20: F19P3/E/SG/5h | 30.5 | cde | 0.0 | c |
| T21: F19P3/A/ Flujo/3h | 32.0 | cde | 20.0 | c |
| T22: F19P3/A/ Flujo/5h | 22.5 | e | 0.0 | c |
| T23: F19P3/A/ SG/3h | 30.5 | cde | 0.0 | c |
| T24: F19P3/A/SG/5h | 33.0 | cde | 0.0 | c |
| CV | 24.86 | 6.08 | ||
C.V.= Coeficiente de variación datos transformados (
Tabla 2 Niveles de Necrosamiento, incremento de volumen, explantes con callo y supervivencia de explantes florales de dos genotipos de cacao no crioconservados (Blancos). Promedio a los 28 días después del establecimiento.Table 2. Necrosis levels, volume increase, explants with callus, and survival of floral explants from two non-cryopreserved (Blank) cacao genotypes. Mean values at 28 days after in vitro establishment.
| Blancos (Genotipo/Explante) |
Necrosamiento (%) |
Incremento de volumen (%) |
Explantes con callo (%) |
Viabilidad† (%) |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| B1: | F9P6/P | 25.0 | abc | 89.0 | a | 78.0 | a | 100.0 | a |
| B2: | F9P6/E | 0.0 | c | 100.0 | a | 40.0 | ab | 100.0 | a |
| B3: | F9P6/A | 53.5 | a | 20.0 | b | 0.0 | b | 50.0 | b |
| B4: | F19P3/P | 40.0 | ab | 100.0 | a | 90.0 | a | 100.0 | a |
| B5: | F19P3/E | 17.0 | bc | 60.0 | ab | 40.0 | ab | 100.0 | a |
| B6: | F19P3/A | 56.5 | a | 30.0 | b | 10.0 | b | 100.0 | a |
| CV | 31.20 | 11.81 | 13.82 | 23.73 | |||||
C.V.= Coeficiente de variación datos transformados (
Necrosamiento
En el análisis factorial, la interacción entre los factores no fue significativa para la necrosis, mientras que para la viabilidad si presentó efectos significativos; no obstante, en ambas variables, el efecto simple del factor tipo de explante fue el que contribuyó más a la variabilidad del experimento. Para el factor genotipo, a los 28 días de cultivo, los explantes de ambos genotipos presentaron porcentajes desde 21 a 84%, el material del genotipo F9P6 presentó menos oscurecimiento durante todo el cultivo (Figura 3-A). En cuanto al factor tipo de explante (Figura 3-B), los estaminodios y anteras resistieron mejor el necrosamiento (29.5% y 30.06% respectivamente) que los pétalo (70.15%).
Figura 3 Porcentaje de necrosamiento promedio de los explantes crioconservados, para los dos genotipos de Theobroma cacao (A) y los tres tipos de explantes florales (B). Letras distintas por fecha de evaluación indican diferencias significativas (Tukey P≤0.05). Agrupamientos estadísticos de datos promedio a los 28 días con base a la transformación
El mejor tratamiento para el genotipo F9P6 correspondió al T3 (pétalos deshidratados con gel de sílice) y para el F19P3 el T13 (pétalos deshidratados en flujo), en ambos casos deshidratados durante 3 h (Tabla 1). Sin embargo, al comprar ambos tratamientos con sus respectivos blancos durante los 28 días de cultivo, los tratamientos T3 y T13 mostraron una acelerada necrosis durante los primeros 14 días, la cual tendió a estabilizarse en valores cercanos al 70% a partir de los 21 días (Figura 4). En general, los explantes sometidos a deshidratación presentaron mayor necrosamiento que los blancos, a excepción de las anteras, donde el necrosamiento de los blancos fue mayor que los tratamientos (Tabla 1 y 2).
Figure 4 Percentage of necrosis in petals under the best-performing treatments for the necrosis variable, in comparison with controls. T3: Petals of genotype F9P6 dehydrated with silica gel for 3 h; T13: Petals of genotype F19P3 dehydrated by airflow for 3 h; B1: Petals of genotype F9P6; B4: Petals of genotype F19P3.
Los explante de los blancos (sin tratamiento de deshidratación) fueron los únicos que presentaron un incremento de volumen (Tabla 2), siendo los explantes de pétalo y estaminodios los que expresaron mayor incremento de volumen (18 y 16%, respectivamente), no se observó diferencias significativas entre genotipos (Figura 5).
Figure 5 Volume increase by genotype (F9P6 and F19P3) and type of explant (petals, staminodes and anthers) of Theobroma cacao, in blanks. Different letters per factor indicate significant differences (Tukey’s test, P≤0.05). Statistical groupings based on mean values at 28 days using the √(x+1) transformation.
Explantes con callo
Los explantes blancos fueron los únicos que indujeron callo. Se observó que ambos genotipos presentaron una respuesta similar para esta variable. Los explantes de pétalo fueron los que expresaron mayor formación de callo (14 %), seguido de los estaminodios (6%), mientras que las anteras no presentaron incremento de volumen por formación de callo (Figura 6).
Figure 6 Explants with callus according to the genotype (F9P6 and F19P3) and type of explants (petals, staminodes and anthers) of Theobroma cacao, in blanks. Different letters per factor indicate significant differences (Tukey’s test, P≤0.05). Statistical groupings based on mean values at 28 days using the √(x+1) transformation.
Viabilidad
La prueba de viabilidad a los 35 días reveló tejido aún vivo en pétalos y anteras de los tratamientos, siendo los pétalos los que presentan porcentajes de hasta 100 % de sobrevivencia (Cuadro 1).
No obstante, los altos índices de necrosamiento en los explantes, la prueba demostró la viabilidad en pétalos y anteras, a los 35 días después de ser recuperados del nitrógeno líquido, por lo que la encapsulación y deshidratación permitieron la viabilidad del explante, aunque se notan ciertas partes del explante muertas o zonas teñidas (Figura 7).
Experimento 2: Crioconservación por el método de encapsulación-vitrificación
Se realizó un ANOVA y comparación de medias únicamente para las variables de necrosamiento y viabilidad a los 28 días (Tabla 3), ya que solo los blancos presentaron incremento de volumen y callo. Se observó que, si bien no hubo diferencias en el porcentaje de necrosamiento (25.63 - 54.44 %), los pétalos y estaminodios presentaron mayor incremento de volumen (100 %) que las anteras (50 y 56%); sin embargo, no hubo diferencia estadística en la producción de callo (25 - 80%). Todos los explantes de los blancos presentaron 100 % de viabilidad (Tabla 4).
Tabla 3 Niveles de necrosamiento y viabilidad en explantes florales de dos genotipos de cacao, sometidos a precultivo con y sin sacarosa y dos soluciones crioprotectoras. Promedio de niveles de factores a los 28 ddsTable 3. Necrosis levels and viability in floral explants of two cacao genotypes subjected to preculture with or without sucrose and two cryoprotectant solutions. Mean factor levels at 28 days after culture initiation
| Tratamientos | Necrosamiento | Viabilidad† | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Genotipo/Explante/Deshidratación/Tiempo | (%) | (%) | |||
| T1: F9P6/P/PreC0.0/PVS2 | 89.00 | a†† | 100.0 | a | |
| T2: F9P6/P/PreC0.0/PVS4 | 85.00 | a | 100.0 | a | |
| T3: F9P6/P/PreC0.75/PVS2 | 86.00 | a | 80.0 | a | |
| T4: F9P6/P/PreC0.75/PVS4 | 89.00 | a | 100.0 | a | |
| T5: F9P6/E/PreC0.0/PVS2 | 63.00 | abcd | 0.0 | b | |
| T6: F9P6/E/PreC0.0/PVS4 | 50.00 | bcdef | 0.0 | b | |
| T7: F9P6/E/PreC0.75/PVS2 | 45.50 | def | 0.0 | b | |
| T8: F9P6/E/PreC0.75/PVS4 | 60.00 | abcde | 0.0 | b | |
| T9: F9P6/A/PreC0.0/PVS2 | 34.50 | ef | 0.0 | b | |
| T10: F9P6/A/PreC0.0/PVS4 | 51.00 | cdef | 0.0 | b | |
| T11: F9P6/A/PreC0.75/PVS2 | 46.00 | def | 0.0 | b | |
| T12: F9P6/A/PreC0.75/PVS4 | 56.88 | abcdef | 0.0 | b | |
| T13: F19P3/P/PreC0.0/PVS2 | 73.50 | abcd | 100.0 | a | |
| T14: F19P3/P/PreC0.0/PVS4 | 81.11 | abc | 80.0 | a | |
| T15: F19P3/P/PreC0.75/PVS2 | 83.00 | ab | 80.0 | a | |
| T16: F19P3/P/PreC0.75/PVS4 | 84.00 | ab | 20.0 | b | |
| T17: F19P3/E/PreC0.0/PVS2 | 60.50 | abcde | 0.0 | b | |
| T18: F19P3/E/PreC0.0/PVS4 | 69.00 | abcd | 0.0 | b | |
| T19: F19P3/E/PreC0.75/PVS2 | 45.00 | def | 0.0 | b | |
| T20: F19P3/E/PreC0.75/PVS4 | 55.50 | abcde | 0.0 | b | |
| T21: F19P3/A/PreC0.0/PVS2 | 50.00 | def | 0.0 | b | |
| T22: F19P3/A/PreC0.0/PVS4 | 51.00 | cdef | 0.0 | b | |
| T23: F19P3/A/PreC0.75/PVS2 | 28.50 | f | 0.0 | b | |
| T24: F19P3/A/PreC0.75/PVS4 | 50.50 | cdef | 0.0 | b | |
| CV | 16.51 | 6.82 | |||
C.V.= Coeficiente de variación datos transformados (
Tabla 4 Niveles de Necrosamiento, incremento de volumen, explantes con callo y supervivencia de explantes florales de dos genotipos de cacao no crioconservados (Blancos). Promedio a los 28 días después del establecimientoTable 4. Necrosis levels, volume increase, explants with callus, and survival of floral explants from two non-cryopreserved cacao genotypes (Blanks). Mean values at 28 days after establishment
| Blancos (Genotipo/Explante) |
Necrosamiento (%) |
Incremento de volumen (%) |
Explantes con callo (%) |
Viabilidad† (%) |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| B1: | F9P6/P | 42.50 | a†† | 100.0 | a | 50.0 | a | 100.0 | a |
| B2: | F9P6/E | 26.50 | a | 100.0 | a | 80.0 | a | 100.0 | a |
| B3: | F9P6/A | 54.44 | a | 56.0 | b | 33.0 | a | 100.0 | a |
| B4: | F19P3/P | 41.50 | a | 100.0 | a | 50.0 | a | 100.0 | a |
| B5: | F19P3/E | 31.00 | a | 100.0 | a | 40.0 | a | 100.0 | a |
| B6: | F19P3/A | 25.63 | a | 50.0 | b | 25.0 | a | 100.0 | a |
| CV | 25.51 | 8.98 | 17.14 | 0.0 | |||||
C.V.= Coeficiente de variación datos transformados (
Necrosamiento
De acuerdo con el análisis factorial, a lo largo de 28 días, el necrosamiento aumentó progresivamente en ambos genotipos, y no se apreciaron diferencias significativas entre ellos (Figura 8-A). En el caso del factor tipo de explante, éstos presentaron altos porcentajes de necrosamiento (Tabla 3), no obstante, los pétalos fueron los más afectados desde el inicio hasta el final de experimento (76%) (Figura 8-B).
Figura 8. Porcentaje de necrosamiento en los genotipos F9P6 y F19P3 de Theobroma cacao (A) y en los pétalos, estaminodios y anteras (B). Letras distintas por fecha de evaluación indican diferencias significativas (Tukey P≤0.05). Agrupamientos estadísticos de datos promedio a los 28 días con base a la transformación
Figure 8 Percentage of necrosis in two Theobroma cacao genotypes (A) and in three types of floral explants (B). Different letters for each evaluation date indicate significant differences (Tukey, P ≤ 0.05). Statistical groupings of mean values at 28 days based on
Los tratamientos de ambos genotipos que incluyen a los explantes de pétalos, fueron los que presentaron los mayores niveles de necrosamiento (73 a 89%) y no presentaron diferencias estadísticas entre ellos. No obstante, fueron los únicos tratamientos que mostraron viabilidad en parte de sus tejidos (Tabla 3). Entre estos tratamientos, el T2 (Pétalos de F9P6 con precultivo sin sacarosa y PVS4 como crioprotector) y T13 (Pétalos de F19P3 con precultivo sin sacarosa y PVS2 como crioprotector), podrían ser seleccionados, toda vez que presentan numéricamente un valor menor de necrosis y 100% de viabilidad. En este caso particular, al ser comprados ambos con los respectivos blancos (B1 y B4) durante 28 días de cultivo (Figura 9), se observó que los blancos presentaron en cada fecha de evaluación aproximadamente la mitad de necrosis que T2 y T13. De igual manera, tanto para los tratamientos T2 y T13, así como para los blancos, el nivel de necrosamiento se incrementó cerca del doble desde el inicio del cultivo hasta el final de la evaluación (Figura 9).
Figura 9 Porcentaje promedio de necrosamiento de Pétalos en los mejores tratamientos, respecto a la variable necrosamiento, en contraste con blancos. T2: Pétalos de F9P6 con sacarosa 0.0 M y PVS4 como crioprotector; T13: Pétalos de F19P3 sin sacarosa y PVS2 como crioprotector; B1: Pétalos de F9P6: B4: Pétalos de F19P3.
Por otro lado, no se detectaron diferencias significativas para necrosamiento entre los tratamientos con estaminodios y anteras como explantes. Si bien en el caso de los explantes de estaminodio y anteras se identificaron tratamientos con bajo porcentaje de necrosamiento (T7, T19 para estaminodio y T9, T23 para anteras), en ningún caso los explantes fueron viables (Tabla 3).
Incremento de volumen
Los explantes crioconservados no presentaron un incremento de volumen luego de ser crioconservados, no así los blancos, en los que sí se apreció un incremento de volumen (Tabla 4).
El análisis factorial permitió identificar que, para los tratamientos blanco, ambos genotipos expresaron el mismo nivel de incremento de volumen, donde los pétalos y estaminodios fueron más reactivos que las anteras (Figura 10).
Figure 10 Volume increase in three floral explants (petals, staminodes and anthers) of two genotypes (F9P6 and F19P3) of Theobroma cacao, in blanks. Different letters for each factor indicate significant differences (Tukey, P ≤ 0.05). Statistical groupings of mean values at 28 days based on √(x+1) transformation.
Explantes con callo
En los explante crioconservados no se observó la presencia de callo. Solo los blancos formaron callo e incrementaron su volumen, en ambos genotipos, expresando una respuesta similar. Nuevamente la reactividad de los pétalos y estaminodios fue similar y superior a las anteras (Figura 11).
Figura 11. Explantes con callo en tres explantes florales (pétalos, estaminodios y anteras) de dos genotipos (F9P6 y F19P3) de Theobroma cacao, en blancos. Letras distintas por factor indican diferencias significativas (Tukey P≤0.05). Agrupamientos estadísticos de datos promedio a los 28 días con base a la transformación √(x+1).
Figure 11 Explants with callus on three floral explants (petals, staminodes and anthers) of two genotypes (F9P6 and F19P3) of Theobroma cacao, in blanks. Means for each factor with different letters different letters differ significantly (Tukey test, P ≤ 0.05). Statistical groupings based on mean values at 28 days using √(x+1) transformation.
Viabilidad
A pesar de los altos índices de necrosamiento observados, fue posible identificar porcentajes de viabilidad entre 20 y 100%, pero solo en explantes de pétalo (Tabla 3). No obstante, no se apreciaron diferencias estadísticas importantes, a excepción del tratamiento T16 con solo 20% de viabilidad, el cual correspondió al genotipo F19P3 con precultivo con sacarosa (0.75 M) y el crioprotector PVS4.
Discusión
A pesar de los altos índices de necrosamiento observados, los resultados demostraron que los explantes de pétalo conservaron viabilidad hasta 35 días después de ser recuperados del nitrógeno líquido (Figura 6). Esto indica que las técnicas de crioconservación aplicadas permitieron preservar parcialmente la integridad tisular. No obstante, se observaron daños localizados (zonas teñidas) que probablemente limitaron la reactivación del crecimiento y la reactivación de crecimiento en los explantes crioconservados (hasta los 28 días). De acuerdo con Azofeifa (2009), el oscurecimiento de los tejidos cultivados in vitro puede deberse a la oxidación de compuestos fenólicos, proceso común en explantes sometidos a estrés fisiológico o manipulación, y que también podría contribuir al necrosamiento observado en este estudio. Por otra parte, se ha señalado que la presencia de necrosis en los explantes no descarta completamente su potencial morfogénico, por lo que el necrosamiento observado en los pétalos de cacao no necesariamente implica una pérdida total de viabilidad (Guzmán, 2010; Tirado, 2014), en realidad, estos altos niveles de necrosamiento en los explantes de cacao cultivados in vitro, incluso en los tratamientos blanco de ambos genotipos, son típicos, pues se relaciona con la condición recalcitrante del material (Fuentes, 2014; Orozco, 2008; Suriano, 2009). Por otra parte, Chalker-Scott y Fuchigami (1989) también relacionan el necrosamiento con lesiones causadas por el frío, las cuales se deben a la rotura de las membranas celulares y pueden provocar la muerte del explante. Cabe mencionar que la formación de hielo no es el único factor que puede afectar gravemente a las células: durante la congelación o deshidratación, la salida de agua del citoplasma concentra los solutos intracelulares (iones y sales), alcanzando niveles que pueden resultar tóxicos para las estructuras celulares (Adu-Gyamfi & Wetten, 2012). Asimismo, un exceso de deshidratación puede disminuir peligrosamente el potencial hídrico y la turgencia celular, generando deformaciones estructurales irreversibles (Gowthami et al., 2025).
Aunque se han obtenido resultados favorables sobre el efecto del precultivo en medios enriquecidos con carbohidratos para la recuperación de explantes crioconservados (Abdelnour, 1999; Ballesteros et al., 2024; Fang et al., 2004; Gonzalez-Arnao & Engelmann, 2006), en este estudio los explantes precultivados con 0.75 M de sacarosa no mostraron una respuesta morfogénica superior respecto a los precultivados sin sacarosa.
Si bien la sacarosa cumple una función importante en la crioprotección, algunos tratamientos pueden resultar nocivos, ya sea por concentraciones elevadas (Gowthami et al., 2025) o por tiempos de exposición prolongados durante el precultivo, los cuales pueden inducir la acumulación de compuestos fenólicos y promover el marchitamiento por necrosis, reduciendo la supervivencia (Poobathy et al., 2013; Sakai & Engelmann, 2007).
De acuerdo con Sánchez-Chiang y Jiménez (2010), las soluciones vitrificadoras como PVS2 o PVS4 son mezclas altamente concentradas que pueden causar plasmólisis excesiva y choque osmótico, afectando negativamente los tejidos tras el descongelamiento. Esto puede deberse a la presencia de crioprotectores como el DMSO, que, aunque puede penetrar las células y protegerlas durante la congelación, también puede resultar tóxico para especies tropicales. Por ello, tanto los crioprotectores como sus combinaciones deben seleccionarse cuidadosamente (Sánchez-Chiang & Jiménez, 2010; Zamecnik et al., 2021). Según Sakai et al. (1991), las soluciones vitrificadoras previenen la formación de cristales de hielo en diversas especies; sin embargo, una encapsulación deficiente en este estudio pudo haber provocado daños celulares permanentes que impidieron la reactivación del crecimiento.
En cuanto a la viabilidad, (Zhang et al., 2017), reportaron una exitosa crioconservación y recuperación de anteras de Citrus cavaleriei y Citrus maxima, al pasar por un proceso de deshidratación previamente. En contraste, en el presente estudio no se observó incremento de volumen que indicara actividad celular tras la crioconservación en ninguno de los tres tipos de explantes. Es probable que una deshidratación excesiva durante el proceso haya afectado la integridad de los tejidos (Osorio et al., 2011), reduciendo drásticamente la viabilidad de los estaminodios y anteras, no así en los pétalos, aunque no expresaron respuesta morfogénica, por lo que se innegablemente también sufrieron daño. Dicho daño podría deberse a alteraciones estructurales generadas por la pérdida de agua antes de la crioconservación, que provocan el colapso celular y limitan la recuperación posterior al descongelamiento (Sakai & Engelmann, 2007). Asimismo, no se descarta que durante la crioconservación se formen metabolitos secundarios capaces de inhibir la división celular y la regeneración de los explantes (Cisne, 1992).
Conclusiones
La crioconservación de explantes florales encapsulados de cacao mediante las técnicas de encapsulación-deshidratación y encapsulación-vitrificación permitió preservar la viabilidad de los pétalos en los genotipos F9P6 y F19P3, mientras que los estaminodios y anteras no sobrevivieron al proceso. La encapsulación-deshidratación fue más efectiva al emplear deshidratación con gel de sílice o flujo laminar durante 3 a 5 h, según el genotipo. En tanto, la encapsulación-vitrificación resultó exitosa al utilizar crioprotectores (PVS2 y PVS4) sin precultivo con sacarosa, destacando su eficacia en los pétalos del genotipo F9P6.
Estos resultados constituyen una base útil para el desarrollo de bancos de germoplasma in vitro, que aseguren la disponibilidad de material para la embriogénesis somática y conservación de variedades élite.
