Medio de cultivo

Se usaron las sales del medio de ^{Murashige y Skoog (1962)}, en concentración de 50% para L. autumnalis y al 75% para E. cordigera, dado que fueron las concentraciones donde las plántulas de cada especie crecieron más en el experimento de germinación, previamente estudiada. Los medios se suplementaron con 0.5 mg L^-1 de tiamina HCl, 100 mg L^-1 de mioinositol y tres concentraciones de sacarosa (15, 30 y 45 g L^-1), en combinación con carbón activado (0, 1 y 3 g L^-1), para promover el crecimiento de las plántulas. El pH de los medios de cultivo se ajustó a 5.7; y se solidificó con agar agar (Hycel^®, 7 g L^-1). El medio se dosificó en frascos de 235 mL de capacidad, colocando 30 mL de medio de cultivo por cada frasco; se esterilizó en autoclave vertical durante 18 min a 121 °C y 15 lb de presión. Posteriormente, en cada frasco se colocaron 10 plántulas y se establecieron en el área de incubación, con fotoperiodo de 16 h luz y 8 de oscuridad, 24 ± 1 °C e intensidad luminosa de 32 μMol m^-2 s^-1.

Diseño experimental

En cada especie de orquídea se usó un diseño completamente al azar, con arreglo factorial de tratamientos, considerando a la sacarosa en tres niveles (15, 30 y 45 g L^-1) y cantidades de carbón activado (0, 1 y 3 g L^-1) en tres niveles, bajo un diseño experimental completamente al azar.

Variables evaluadas y análisis estadístico

A los 46 días (L. autumnalis) y 81 días (E. cordigera) se evaluó la altura de las plantas (mm), desde la base del tallo hasta el ápice de las hojas; longitud de hoja, se midió desde el inicio de la lámina foliar hasta el ápice; longitud de raíces, se midió cada raíz desde la base del tallo hasta el ápice de la raíz y se determinó la longitud promedio, estas tres variables se midieron en mm, con una regla. El número de hojas y número de raíces, se determinaron mediante conteo. El diámetro de protocormo (mm) fue evaluado con Vernier digital (Stanunless Hardened), dado que este órgano es de menor tamaño. Finalmente, la materia seca de la parte aérea y de la raíz (mg) se obtuvo mediante secado en horno (Luzeren, modelo DHG9070A) a 70 °C durante 72 h, y se pesó en una balanza analítica (Ohaus^®, Pioneer PA214).

Los datos obtenidos se estudiaron mediante análisis de varianza, en las variables donde hubo efecto de los tratamientos, se efectuó la prueba de comparación de medias Tukey (P ≤ 0.05), con el paquete estadístico SAS v. 9.2.

Crecimiento de plántulas de Laelia autumnalis

Las variables morfológicas mostraron la influencia de las concentraciones de sacarosa y carbón activado en el crecimiento de plántulas de L. autumnalis. La mayor altura se registró en el medio con 45 g L^-1 de sacarosa y 1 g L^-1 de carbón activado, estadísticamente igual con las plántulas cultivadas en el medio con 15 y 30 g L^-1 de sacarosa con 0 y 3 g L^-1 de carbón activado, respectivamente. En general, se observó que, con 15 g L^-1 de sacarosa, las plántulas tuvieron menor altura, en comparación con las de los medios que tenían 30 y 45 g L^-1 de sacarosa (Cuadro 2).

La cantidad de hojas por plántula varió de 4 a 6; el mayor número de hojas se registró en el medio con 30 g L^-1 de sacarosa con 1 y 3 g L^-1 de carbón activado. Al disminuir la concentración de sacarosa a 15 g L^-1, el número de hojas disminuyó significativamente. Por el contrario, la longitud de hoja tuvo mejor resultado en el medio con mayor concentración de sacarosa combinada con 1 y 3 g L^-1 de carbón activado. Al igual que en número de hojas, al reducir la cantidad de fuente de carbono se observó menor longitud, presentando los valores menores con 15 g L^-1 del carbohidrato y 3 g L^-1 de carbón activado. En términos generales, el crecimiento en número y longitud de hoja fue menor con 15 g L^-1 de sacarosa, con poco efecto de la concentración de carbón activado (Cuadro 2).

El número de raíces promedio por plántula varió de 1.4 a 2.4, el mayor número se obtuvo en los medios que contenían 15 y 45 g L^-1 de sacarosa con 0 g L^-1 de carbón activado. No hubo una tendencia clara del efecto del hidrato de carbono en el número de estos órganos. Por el contrario, el aumento en el carbón activado generó menos raíces por plántula. El crecimiento en longitud de raíz varió de 5.8 a 8.6 mm; los valores mayores se tuvieron con 30 g L^-1 de sacarosa combinada con 1 y 3 g L^-1 de carbón activado, así como en el medio con 45 g L^-1 combinada con 1 g L^-1 de carbón activado. En los medios que contenían 15 g L^-1 de azúcar con o sin carbón activado, la longitud de raíces fue menor. El crecimiento del sistema radical fue mayor con las dos cantidades más elevadas del azúcar y del carbón activado (Cuadro 2).

Fue evidente el efecto positivo del incremento en la concentración del carbohidrato en el diámetro de protocormo, ya que éste fue superior en el medio con 30 g L^-1 de sacarosa y 3 g L^-1 de carbón activado; aunque fue estadísticamente similar que cuando se usó 45 g L^-1 de este azúcar con 1 y 3 g L^-1 de carbón activado; por el contrario, cuando se disminuyó la concentración a 15 g L^-1 de sacarosa sin carbón activado, esta variable presentó el valor más bajo, evidenciando la necesidad del carbohidrato para mayor crecimiento (Cuadro 2).

La materia seca de plántulas varió de 2.69 a 6.57 mg, en el medio con 45 g L^-1 de sacarosa y 1 g L^-1 de carbón activado fue donde se presentó el valor más alto, en comparación con los demás tratamientos. Por lo que, los medios que tenían una menor concentración de sacarosa con y sin carbón activado, generaron menor peso de esta parte de la plántula; evidentemente, los menores resultados se tuvieron en las plántulas de los medios con 15 g L^-1 de sacarosa independientemente de la cantidad de carbón activado (Cuadro 2). De manera similar, la materia seca de las raíces en el medio con 45 g L^-1 de sacarosa en combinación con 0 y 1 g L^-1 de carbón activado se presentaron los valores más altos, sin diferencias estadísticas. Al usar menor cantidad de sacarosa se observó el menor peso seco de raíces (Cuadro 2).

En este estudio, se encontró que 45 g L^-1 de sacarosa fue apropiado para altura, largo de hoja y de raíces, así como para diámetro de protocormo, indicando que el crecimiento ocurre en mayor grado cuando se dispone de más fuente de carbono asimilable para los tejidos. La sacarosa es el principal proveedor de energía de carbono y participa en la regulación del proceso de desarrollo (^{Huh et al., 2016}). Al respecto, ^{Sasamori et al. (2015)} observaron que en Cattleya intermedia la altura de la parte aérea, número de hojas por planta, materia fresca, número de raíces por planta y longitud de la raíz, mostraron mayor desarrollo cuando las plantas estuvieron cultivadas en medio MS al 50 % con 45 a 60 g L^-1 de sacarosa. De manera similar, ^{Endres et al. (2014)} evaluaron 10, 30 y 60 g L^-1 de sacarosa, adicionando 10 g L^-1 de carbón activado en plántulas de Anathallis adenochila y reportaron que la altura de la parte aérea y longitud de raíces fueron mayores en los medios con 30 o 60 g L^-1 de sacarosa.

^{Zahara et al. (2017)} reportaron que el medio MS al 50 % con 20 g L^-1 de sacarosa, fue óptima para mejorar la altura, número, ancho y longitud de hojas, longitud de raíces, peso freso y seco de plántulas de Phalaenopsis, lo que indica que los requerimientos de carbono para el crecimiento de L. autumnalis estudiada en esta investigación son diferentes a las orquídeas Phalaenopsis. También, ^{De Melo Ferreira et al. (2017)} evaluaron el efecto de la sacarosa y otros factores sobre la multiplicación y crecimiento de plántulas de 120 días de edad de Alatiglossum fuscopetalum, y reportaron la mayor formación de brotes, longitud de raíces y materia seca de raíces con 30 g L^-1 de sacarosa, evidenciando que la necesidad de carbohidratos varía según la especie.

En general, la sacarosa se emplea principalmente en el cultivo de tejidos vegetales porque tiene alta solubilidad en agua y puede atravesar fácilmente la membrana plasmática (^{Baskaran & Jayabalan, 2005};^{Javed & Ikram, 2008}). La sacarosa en los medios de cultivo in vitro aporta una fuente de carbono, ya que los explantes no son capaces de realizar la fotosíntesis suficiente para sustentarse por sí mismos. Ésta tiene funciones celulares importantes, como producción de energía mediante la respiración, regulación de la estabilidad de la membrana y soportar el proceso de formación de nuevas células en las plantas (^{Heriansyah, 2019}; ^{Karimah et al., 2022}). Por lo tanto, es indispensable para las plántulas cultivadas in vitro debido a la reducida capacidad fotosintética que presentan por la dificultad para obtener carbono de la atmosfera. Por lo que, es crucial proporcionar una fuente exógena de carbono para su crecimiento. Sin embargo, es importante usarla en las concentraciones adecuadas, puesto qué, dosis excesivas pueden causar estrés osmótico (^{Reyes-Díaz et al., 2018}). Tanto las dosis altas o bajas pueden tener efectos negativos, ocasionando crecimiento deficiente (^{Zahara et al., 2017}).

Los resultados mostraron que la adición de carbón activado al medio de cultivo favoreció el crecimiento de materia seca de la parte aérea de plántula, lo que concuerda con los resultados obtenidos por ^{Lima et al. (2024)}, quienes señalan que en plántulas de Cyrtopodium cardiochilum, la curva dosis-respuesta indicó que las concentraciones de 3.0 g L^-1 de carbón activado y 33 g L^-1 de sacarosa produjeron la mayor cantidad de materia seca en callos y plántulas. El carbón activado favorece los procesos de crecimiento en las orquídeas (^{Pedroza-Manrique, 2009}), porque mejora el crecimiento y la supervivencia de las plantasin vitro, dado que disminuye los compuestos fenólicos, además de tener alta afinidad de adsorción por los compuestos inhibidores y sustancias morfo genéticamente activas o tóxicas no identificadas (^{Hossain et al., 2021}).

Crecimiento de plántulas de Encyclia cordigera

Los resultados mostraron que las concentraciones de sacarosa y carbón activado afectaron significativamente el crecimiento de plántulas de E. cordigera. La mayor altura se obtuvo en el medio con 45 g L^-1 de sacarosa y 3 g L^-1 de carbón activado, 34 a 70% más altura que con 15 g L^-1 de sacarosa. La altura fue mayor conforme se incrementó la cantidad del carbohidrato en el medio. Lo mismo ocurrió con la concentración de carbón activado, de tal modo que las plantas de menor altura fueron las cultivadas sin carbón activado y 15 g L^-1 de hidratos de carbono (Cuadro 3).

DMSH: Minimum Significant Honest Difference. Means followed with the same letter in each column are statistically equal (Tukey, P ≤ 0.05).

El promedio en número de hojas varió de 4.4 a 5.9, la mayor cantidad se obtuvo en los medios con 15 y 45 g L^-1 de sacarosa, con 1 y 3 g L^-1 de carbón activado respectivamente, sin diferencias estadísticas entre ambos medios de cultivo. Mientras que, la mayor longitud de estos órganos se observó en el medio con 45 g L^-1 de sacarosa y 3 g L^-1 de carbón activado. Fue evidente que hubo mayor crecimiento al aumentar la cantidad de azúcar y de carbón activado, ya que las hojas más pequeñas fueron las del medio de cultivo con 15 g L^-1 de sacarosa, sin carbón activado (Cuadro 3).

El promedio de número de raíces por plántula varió de 3.2 a 8.0, la mayor cantidad se obtuvo en el medio con 45 g L^-1 de sacaros y 3 g L^-1 de carbón activado. La cantidad de estos órganos fue mayor al aumentar el carbohidrato y carbón activado en el medio de cultivo, indicando el efecto benéfico de ambos componentes, razón por la que las plantas con menos raíces fueron las del medio con 15 g L^-1 de azúcar sin carbón activado. Con relación a la longitud de raíz, esta varió de 1.13 a 2.95 cm; los valores más altos se registraron en las plantas cultivadas con 15 g L^-1 de sacarosa combinada con 1 y 3 g L^-1 de carbón activado. En tanto que, en el medio con 15 g L^-1 de sacarosa sin carbón activado se observó el menor tamaño (Cuadro 3).

El crecimiento de los protocormos varió de 1.71 a 3.2 mm de diámetro, los de mayor diámetro fueron los de las plantas cultivadas con mayor concentración de sacarosa combinadas con 1 g L^-1 de carbón activado. En los medios sin carbón activado las plantas presentaron el menor crecimiento en el diámetro de este tallo (Cuadro 3).

La materia seca de las plántulas tuvo la variación más alta, de 4.8 a 27.7 mg. Las plantas que acumularon la mayor cantidad fueron las que estuvieron en el medio con 45 g L^-1 de sacarosa y 3 g L^-1 de carbón activado, superiores a las de los otros ocho medios. Por el contrario, los medios sin carbón activado, independientemente de la cantidad de sacarosa, generaron menor peso de la parte aérea de la plántula (Cuadro 3). La acumulación de materia seca se incrementó conforme aumentó el azúcar en el medio de cultivo; en el caso del carbón activado ocurrió algo similar. También la materia seca de raíces fue mayor en las plantas cultivadas en el medio con 45 g L^-1 de sacarosa y 3 g L^-1 de carbón activado y las de menor peso fueron las del medio con 15 g L^-1 de glúcido y sin carbón activado. La tendencia observada fue que la materia seca de estos órganos aumentó al incrementar la concentración de los dos componentes del medio de cultivo evaluados (Cuadro 3).

Los resultados mostraron que 45 g L^-1 de sacarosa favoreció el crecimiento de plántulas de E. cordigera. Al respecto, ^{Sasamori et al. (2015)} observaron que en plantas de Cattleya intermedia, la altura de la parte aérea, número de hojas por planta, materia fresca, raíces por planta y longitud de la raíz, tuvieron mayor desarrollo cuando las plantas se cultivaron en medio MS al 50 % con 45 a 60 g L^-1 de sacarosa. De manera similar, ^{Endres et al. (2014)} evaluaron 10, 30 y 60 g L^-1 de sacarosa, adicionando 10 g L^-1 de carbón activado en plántulas de Anathallis adenochila y reportaron que la altura de la parte aérea y longitud de raíces fueron mayores en los medios con 30 o 60 g de sacarosa.

Los resultados anteriores muestran que altas concentraciones de carbohidratos ejercen un efecto positivo en el crecimiento de plántulas de orquídeas. También ^{Rittirat et al. (2012)} informaron que después de 5 meses de cultivo en medio New Dogaschima, suplementado con 40 g L^-1 de sacarosa y 2 g L^-1 de carbón activado se tuvieron los mejores resultados en peso fresco, altura de plántula, longitud de hoja, ancho de hoja, número de raíces y longitud de raíces, en plántulas de Phalaenopsis. Los resultados anteriores coinciden con los obtenidos en la presente investigación para E. cordigera, en la que los valores más altos para la mayoría de las variables se tuvieron en el medio que contenía 45 g L^-1 de sacarosa.

El crecimiento de las plantas de orquídeas varía también en función de la parte de la planta (hojas, raíces, tallos/protocormos o brotes) que se evalúa; ^{Rohmah y Taratima (2021)}, usaron protocormos de Cymbidium aloifolium y evaluaron diferentes concentraciones de sacarosa y reportaron que el mayor número de hojas se obtuvo con 20 g L^-1, en tanto que, el número de brotes fue mayor con 25 g L^-1 y la longitud de los brotes fue mayor con 35 g L^-1 de sacarosa. Lo anterior muestra que el crecimiento de las plantas varía en función de la concentración de sacarosa y de la característica de la orquídea que evalúa. La sacarosa es el producto final de la fotosíntesis y el principal azúcar transportado en el floema, en la mayoría de las plantas; en los tejidos no fotosintéticos, la sacarosa transportada es la materia prima para muchos procesos metabólicos (^{Stein & Granot, 2019}). Los resultados de este estudio mostraron que las concentraciones de sacarosa más altas incrementaron el crecimiento de plantas de ambas especies de orquídeas; dado que los azúcares son sustratos metabólicos que participan en la modulación de varios procesos en las plantas durante diferentes fases del desarrollo (^{Siddiqui et al., 2020}); en esta investigación, los esqueletos de carbono probablemente se usaron para producción de materia orgánica como aminoácidos, nucleótidos, carbohidratos estructurales y energía (^{Stein & Granot, 2019}), para los procesos metabólicos necesarios para el crecimiento.

El efecto del carbón activado fue estudiado por ^{Koene et al. (2019)} quienes utilizaron medio WPM y MS50% y diferentes concentraciones de carbón activado o sacarosa en plántulas de Acianthera prolifera y reportaron que los explantes cultivados con carbón activado presentaron mejores resultados que aquellos cultivados en medio sin este componente; no hubo diferencias por efecto de la concentración de carbón activado; sin embargo, recomiendan 1 g de carbón activado para reducir costos. También reportaron que el medio WPM con 60 g L^-1 de sacarosa generó las raíces más largas, mayor longitud de brotes y mayor masa fresca, en tanto que, en el medio MS50% con 15 g L^-1 de sacarosa hubo mayor longitud de raíces y masa fresca, estos resultados coinciden con lo obtenido en la longitud de raíces en plántulas de E. cordigera, ya que presentaron mayor longitud de órgano con 15 g L^-1 de sacarosa.

Los resultados que se obtuvieron en esta investigación, mostraron que la adición de carbón activado en el medio de cultivo favoreció el crecimiento y desarrollo de las plántulas de ambas especies de orquídea. El carbón activado en el medio de cultivo puede promover o inhibir el crecimiento in vitro, según la especie y el tejido utilizados. Los efectos promotores del carbón activado sobre la morfogénesis pueden deberse principalmente a la adsorción irreversible de compuestos inhibidores en el medio de cultivo y a la disminución sustancial de metabolitos tóxicos y exudados fenólicos. Así como la liberación de sustancias presentes de forma natural en el carbón activado, que promueven el crecimiento, la alteración y el oscurecimiento de los medios de cultivo, la adsorción de vitaminas, reguladores del crecimiento como el ácido abscísico y el etileno (^{Thomas, 2008}; ^{Morales-Rubio et al., 2016}), producidos por los tejidos in vitro; así como la sacarosa y mio-inositol (^{Morales-Rubio et al., 2016}), agregados al medio de cultivo.

Se estudio el crecimiento de las plantas de las dos especies, en la etapa previa a la aclimatación; por lo que, es importante señalar que la materia seca acumulada tanto en la parte aérea como en las raíces fueron las características más importantes para definir la combinación de sacarosa y carbón activado que generan mayor crecimiento en cada especie.