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Introducción
Durante los estudios fitoquímicos de las partes de una la planta se muestra la presencia de una amplia variación de metabolitos secundarios como polifenoles, flavonoides, terpenoides, alcaloides, glucósidos, fitoesteroles, saponinas, taninos y ácidos grasos, etc. Así, en la tronadora (Tecoma stans L.) se ha descrito un mayor contenido de alcaloides en base seca durante la etapa de prefloración que durante la etapa de floración. Así, ambas etapas mostraron diferentes niveles de fitoquímicos en las hojas, lo que depende en gran medida de la etapa fisiológica de la planta, seguido del tipo de medio de extracción empleando disolventes de distintas polaridades. Sin embargo, la resistencia de las plantas al estrés ambiental, es decir, a las altas temperaturas, la sequía, la alta exposición solar y la salinidad del suelo, también puede ser el factor estimulante que permite la biosíntesis y la acumulación de estas sustancias durante las diferentes fases de su crecimiento (Anand & Basavaraju, 2021).
Por otro lado, en el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales, un callo se define como una masa de células indiferenciadas (no especializadas) o desdiferenciadas (que pierden su especialización), las cuales proliferan de forma desorganizada como respuesta a estímulos físicos químicos u hormonales o como conjunto de células en crecimiento desorganizado, que se desarrollan en respuesta a una lesión química o física en condiciones hormonales determinadas (Pierik R, 1990). El callo se puede obtener a partir de un explante y sólo algunas de las células del callo exhiben la totipotencia celular. Esta habilidad de diferenciarse en tejidos, órganos e incluso embriones, las hace capaces de regenerar plantas enteras (Pierik R, 1990). Por otra parte, Kondamudi et al. (2009) mencionan que, en muchos experimentos de cultivo de tejidos, como primer paso es necesaria la inducción de callo a partir del explante; pues el cultivo de callo se utiliza para estudiar el aislamiento de protoplastos, tipos de células, la selección celular, la embriogénesis somática, la organogénesis y la producción de metabolitos secundarios. Respecto a la familia Euphorbiaceae,Lee & Starratt (1972) cultivaron raíces de plántulas deEuphorbia esulaL. yEuphorbia cyparissiasL. para obtener callos con ácido α-naftalenacético (ANA), y fue mejor regulador de crecimiento vegetal que kinetina (Kin), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indolacético (AIA) o ácido-4-amino-3,5,6 tricloropicolínico (picloram). El ácido giberélico no tuvo algún efecto. Ripley & Preece (1986) mencionan que la citocinina 6-benciladenina (BA) no fue necesaria para la proliferación de brotes axilares en Euphorbia lathyris L., pero sí para la producción de callos y brotes adventicios. En Mallotus philippensis Lam.,Abbas (1993) obtuvo callo en continuo crecimiento empleando medio de Murashige & Skoog (MS) con 2,4-D (1.3 mg L-1) y Kin (0.5 mg L-1). Jasrai et al. (2003) en Euphorbia pulcherrima Willd, reportaron la inducción de callos rojos con medio MS suplementado con 2.0 mg L-1 de 2-iso-penteniladenina (2i-p) y ANA (0.5 mg L-1). Pickens et al. (2005), mencionan que la mayoría de callos y brotes en Euphorbia pulcherrima Willd, se obtuvieron a partir de secciones de la vena media de hojas cultivadas in vitro, con 2.0 a 3.0 mg L-1 de BA y 3.0 mg L-1 de AIA durante un mes. Xu et al. (2008), plantearon un protocolo de regeneración celular para Euphorbia ésula L. empleando medio MS adicionado con 0.25 mg L-1 de 6-bencilaminopurina (BAP) y 0.4 mg L-1 de ácido indolbutírico (AIB), obteniendo después de 30 días de cultivo, brotes de forma directa e indirecta. En Euphorbia pulcherrima Willd, Perera & Trader (2010), mencionan el cultivo de yemas apicales y axilares con medio MS adicionado BA (2.25 mg L-1) para producir callo color rojo, o BA y AIA (2.25 y 0.7 mg L-1, respectivamente) para obtener algunos callos color blanco y gris-verde después de un mes de cultivo. En Ricinus communis L., se menciona la obtención de callo friable (90%) de color marrón blanquecino con medio MS más 0.5 mg L-1 de ANA y 2.5 mg L-1 de BAP a partir de tejidos de hojas cotiledonales (Naz et al., 2011).
Así mismo, el cultivo de tejidos vegetales fue introducido desde finales de la década de los 60´s del siglo XX, como una alternativa posible para el estudio y producción de metabolitos secundarios (Bourgaud et al., 2001). A partir de entonces, se han realizado numerosos estudios con el objetivo de incrementar y obtener los compuestos deseados. Sin embargo, Kreis (2007) menciona que no es posible obtener los mismos compuestos (en cantidad y calidad) en células indiferenciadas que los obtenidos en las plantas madre, ya que muchos metabolitos se sintetizan integrados a eventos de diferenciación celular. No obstante, Janarthanam et al. (2010) mencionan que en Stevia rebaudiana Bert. (Asteraceae), lograron obtener callo abundante (11.6 g) con metabolitos secundarios a partir de explantes foliares cultivados en un medio MS con 0.5 mg L-1 de ANA, 0.5 mg L-1 de 2,4-D y 1.0 mg L-1 de Kin. También, Aguilar et al. (2019) mencionan el uso de BAP (0.5 mg L-1) para la propagación in vitro de Stevia rebaudiana Bert. a partir de segmentos nodales, con la posible presencia de metabolitos secundarios (esteviósidos). Estos resultados fueron similares a lo publicado por Vázquez-Baxcajay et al. (2014), quienes encontraron que las plantas de Stevia rebaudiana Bert. micropropagadas, conservaron su capacidad para sintetizar distintos esteviósidos. Por otra parte, Ali & Tariq (2013) en Momordica charantia cv. Jaunpuri (Cucurbitaceae), mencionan a BAP, AIA, y 2,4-D en medio MS para inducir callogénesis y extraer los principios activos ahí generados, resultando BAP con 2,4-D, la mejor combinación en diferentes concentraciones para la inducción de callo a partir de diferentes explantes. Recientemente, Andújar et al. (2023), mencionan el aumento de niveles endógenos de diterpenos en Stevia rebaudiana Bert. cultivada con 12.5 mg L-1 de nanopartículas de planta en condiciones in vitro. Con base en los antecedentes sobre inducción de callo en plantas de la familia Euphorbiaceae, el uso de reguladores de crecimiento en esta familia, y la falta de estudios en Euphorbia nutans Lag., especie premisoria para aplicaciones farmacológicas, en este trabajo el objetivo planteado fue la inducción de callo in vitro de Euphorbia nutans Lag. para comparar mediante cromatografía en placa delgada y espectroscopía de resonancia magnética nuclear de protón (RMN de 1H), los metabolitos así obtenidos contra los de las plantas silvetres.
Materiales y métodos
Material vegetal
La inducción de callos in vitro se realizó a partir de segmentos nodales, hojas y segmentos foliares de plantas de Euphorbia nutans Lag. generadas in vitro. La obtención de extractos a partir de hojas y tallos de plantas silvestres de Euphorbia nutans Lag., fue mediante plantas recolectadas en la Mixteca Poblana México (Izúcar de Matamoros, Puebla) e identificadas en el Herbario Jorge Espinosa Salas de la Universidad Autónoma Chapingo, al igual que el material vegetal para el establecimiento y obtención de plantas in vitro. Las plantas recolectadas tenían aproximadamente dos meses de edad.
Inducción de callo a partir del cultivo in vitro de segmentos nodales de Euphorbia nutans Lag.
El medio de cultivo empleado fue con las sales inorgánicas de Murashige & Skoog (1962) al 100%, suplementado con mio-inositol 100 mg L-1, tiamina-HCl 0.40 mg L-1, sacarosa 30.0 g L-1 y 3.0 mg L-1 nitrato de plata (AgNO3) de acuerdo a Aguilar-Jiménez & Rodríguez-De-la-O (2020). Además, se adicionó por separado con 10.0 mg L-1 de citocininas (Kin, 2i-p, BA) y de auxinas (ANA, 2,4-D, TDZ), formando así, un diseño factorial 3x3 más un tratamiento control (MS) con diez repeticiones cada uno. A cada tratamiento se adicionaron 7.0 g L-1 de agar y se ajustó el pH a 5.7 ± 0.01 con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico. Todos los reactivos empleados son marca SIGMA®. Después de disolver el agar en el medio de cultivo, éste se vertió en tubos de ensaye en una cantidad de 10 mL por recipiente, se cubrieron con tapas de polipropileno y se esterilizaron 20 minutos en una autoclave tipo horizontal a 121 °C y a 1.5 kg cm2 de presión marca AESA®. Posteriormente, se sembró un segmento nodal por tubo de ensayo, fueron incubados a 26 ± 2 °C con 24 horas de luz artificial mediante lámparas de luz fluorescente blanca (38.0-45.7 µmol.m-2. s-1), durante ocho semanas.
Inducción de callo a partir del cultivo in vitro de hojas completas y segmentos foliares de Euphorbia nutans Lag.
A partir del caso anterior, y según los antecedentes sobre el efecto de BA para inducción de callo en otras plantas del género Euphorbia (Ripley & Preece, 1986; Jasrai et al., 2003; Pickens et al., 2005 y Perera & Trader, 2010), el medio de cultivo empleado fue Murashige & Skoog (1962) 100%, suplementado con mio-inositol 100 mg L-1, tiamina-HCl 0.40 mg L-1, sacarosa 30 g L-1, BA con ANA en 10.0 mg L-1, 7.0 g L-1 de agar y 3.0 mg L1 de AgNO3 (Aguilar-Jiménez & Rodríguez-De-la-O, 2020), ajustando el pH a 5.7 ± 0.01. Después de disover el agar en el medio de cultivo, se vertió y se esterilizó como se mencionó anteriormente. En seguida, se elaboró un experimento con arreglo factorial 2 x 2 al sembrar hojas completas y segmentos foliares con el haz en contacto con el medio de cultivo y con el haz invertido; así como dos experimentos separados empleando segmentos foliares con el haz en posición normal e invertido, pero con hendidura de la nervadura central por la mitad. Todos los tratamientos tuvieron cinco repeticiones, considerando a cada tubo de ensayo con un explante como unidad experimental. Con respecto a los segmentos foliares, se obtuvieron tras eliminar los extremos de las hojas con ayuda de un bisturí. Posteriormente, se mantuvieron en incubación a 26 ± 2 °C y con 24 horas de luz artificial mediante lámparas de luz fluorescente blanca (38.0-45.7 µmol.m-2. s-1) por un periodo de ocho semanas.
Análisis fitoquímico de extractos a partir de plantas silvestres y de callos obtenidos in vitro de Euphorbia nutans Lag.
Para la extracción de metabolitos secundarios a partir de plantas silvestres recolectadas, 3.534 Kg de material vegetal se secó por dos semanas a temperatura ambiente y bajo sombra. A partir de este material, se efectuaron extracciones por meceración con diferentes disolventes siguiendo un orden ascendente de polaridad. Se añadieron 12 L de hexano y se dejó reposar por tres días; después se filtró el extracto y se destiló a vacío con ayuda de un rotaevaporador Büchi Heating Bath B-491 para recuperar el disolvente; esta operación se repitió tres veces. A continuación, al residuo vegetal se agregaron 10 L de cloruro de metileno bajo maceración por tres días, esta operación se repitió también tres veces; y finalmente, también se agregaron 10 L de metanol (MeOH) al residuo vegetal recuperado, efectuando el mismo procedimiento tres veces. Se obtuvieron 107.1 g de extracto hexánico, 85.8 g de extracto de diclorometano y 167.6 g de extracto de metanol, cuyo proceso de extracción se aprecia en la Figura 1.
Figura 1 Diagrama del proceso para la obtención de extractos vegetales a partir de plantas silvestres de Euphorbia nutans Lag.
Posteriormente, cada extracto se analizó mediante cromatografía en columna de vidrio (4.5 cm x 130 cm), empacada con 250 g de silicagel 60 (Malla 0.063-0.200 mm, Merck); se inició la separación de metabolitos secundarios con hexano y con cantidades crecientes de AcOEt y finalmente con AcOEt puro; se recogieron fracciones de 20 mL, mismas que fueron monitoreadas empleando cromatografía en capa delgada (Merck, TLC Silica gel 60 F254 25 Aluminium sheets 20 x 20 cm). Las fracciones fueron reunidas por su semejanza cromatográfica y se sometieron a estudios de RMN de 1H.
Para la extracción de metabolitos secundarios a partir de callos in vitro de Euphorbia nutans, primero se retiraron de los frascos de cultivo y se dejaron a temperatura ambiente por 24 horas. Posteriormente, se pesaron 3.41 g y se sometieron a la técnica de reflujo por dos horas, la cual se repitió tres veces con tres disolventes diferentes, iniciando con el de menor a mayor polaridad (hexano, diclorometano y metanol, respectivamente) según lo recomendado por (Harborne, 1984). Los extractos obtenidos se concentraron con ayuda de un Rota evaporador Büchi Heating Bath B-491 y se mantuvieron en frascos color ambar hasta su posterior análisis mediante cromatografía en capa delgada y RMN de 1H
Análisis de datos
Los datos obtenidos para cada variable se sometieron a análisis de varianza y se aplicó la prueba de Tukey (p≤0.05) para definir la diferencia entre los efectos medios de los tratamientos. El paquete estadístico empleado fue Minitab 17.
Para el análisis de metabolitos secundarios, los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de 1H, 13C y DEPT en una dimensión, y los bidimensionales HSQC, HMBC y COSY, se determinaron en un espectrómetro Agilent 400 MHz DD2 (Santa Clara, CA, USA) con sintonías a 100 MHz para RMN de 13C y a 400 MHz para RMN de 1H. Los desplazamientos químicos se midieron en CDCl3 (Cloroformo deuterado), las muestras fueron disueltas en 600 µL y colocadas en tubos de RMN de 5 mm de diámetro, empleando TMS (Tetrametil silano) como referencia interna y realizar su respectiva comparación. El equipo se ubica en el Laboratorio de Productos Naturales, Área de Química, Departamento de Preparatoria Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo.
Resultados y discusión
Inducción de callo a partir del cultivo in vitro de segmentos nodales de Euphorbia nutans Lag.
La inducción de callo estuvo influenciada principalmente por el tipo de auxina, siendo ANA la auxina con mejor efecto independientemente de la citocinina empleada (Kin, 2i-p o BA), a excepción del tratamiento con Kin + 2,4-D, que también favoreció la formación de tejido calloso, los resultados se presentan en la Figura 2 y Tabla 1. Por lo tanto, en Euphorbia nutans Lag. estos resultados no coinciden con lo publicado por Lozzi et al. (2018), quienes emplearon 2,4-D (0.55 mg L-1) para formar callos de color blanco cremoso a partir de cotiledones maduros en Ceratonia siliqua L.; así como la respuesta obtenida por Hernández-Amasifuen et al. (2021) en Capsicum pubescens al emplear medio MS con 0.7 y 1.0 mg L-1 de 2,4-D; y por Millones-Yamunaqué et al. (2021), quienes obtuvieron una tasa del 100 % de callos friables en Loxopterygium huasango Spruce ex Engl. cultivando nudos cotiledonales en medio MS con 2,4-D desde 0.1 a 5.0 mg L-1. Esto sugiere que, la respuesta a formar callo depende de la especie vegetal y 2,4-D no es de uso universal, o debe emplearse sin otros reguladores de crecimiento para favorecer esa respuesta. También, las respuestas obtenidas difieren de lo mencionado por Pierik (1990) y Kondamudi et al. (2009), pues la formación de callo en Euphorbia nutans Lag. no sucedió en el corte del tejido, sino en el segmento nodal donde existen yemas axilares (Figura 2, A-F) y tejidos con crecimiento activo. Esto coincide con lo reportado por Isah (2019), quien menciona la obtención de callo a partir de meristemos apicales en Gymnema sylvestre R. para regenerar brotes de forma indirecta; por lo tanto, estos resultados indican de la importancia de tejidos en crecimiento activo para favorecer la formación de callo, sin depender de la especie, coincidiendo con lo publicado por Perera & Trader (2010) en Euphorbia pulcherrima Will, quienes mencionan la obtención de callo a partir de yemas apicales y axilares empleando un medio de cultivo MS adicionado con BA y AIA, e incluso, adicionando únicamente BA como publicó Jasrai et al. (2003). Al analizar los resultados obtenidos con los de otras especies, parce indicar que, en Euphorbia nutans Lag., los explantes a partir de segmentos nodales no son idóneos para regenerar plantas in vitro de forma indirecta (Figura 2), pues según Albarrán-Mondragón et al. (2022), la mejor respuesta para inducción de callo a partir de secciones foliares en Bromelia karatas L., fue empleando un medio MS con BA (1.0 mg L-1) + 2,4-D (0.0, 0.5, 1.0 y 2.0 mg L-1); y Fallah et al. (2022), mencionan algo similar para inducir callo a partir de brotes en zanahoria con medio MS adicionando BAP y 2,4-D (0.5 mg L-1). También, tal vez falta evaluar otros reguladores de crecimiento, concentraciones y combinaciones como lo publicado por López-Ramírez et al. (2021), quienes lograron inducir callo en Yucca carnerosana Trel. empleando un medio MS adicionado con BA y ácido 4-aminotricloropicolínico (Picloram); pues con BA y 2,4-D, obtuvieron callos de aspecto compacto y necróticos como los obtenidos en la presente investigación con Euphorbia nutans Lag. (Figura 2).
Figura 2 Formación de callos a partir de segmentos nodales de Euphorbia nutans Lag. en condiciones in vitro. A y B) Callos obtenidos con Kin + ANA, C y D) Callos obtenidos con 2i-p + ANA, E) Callos obtenidos con BA + ANA, F) Callos obtenidos con Kin + 2,4-D. Barra = 5 mm.
Tabla 1 Inducción de callos in vitro a partir de segmentos nodales de Euphorbia nutans Lag.Table 1. In vitro callus induction from nodal segments of Euphorbia nutans Lag.
| Tratamiento | Porcentaje de respuesta (%) |
Características del callo | Peso de callo (g) | |
|---|---|---|---|---|
| Color | Textura | |||
| Kin con ANA | 70 | Marrón/cremoso | Compacta | 0.0321 a |
| 2i-p con ANA | 90 | Cloróticos | Compacta | 0.0381 a |
| BA con ANA | 40 | Gris obscuro | Compacta | 0.0401 a |
| Kin con 2,4-D | 70 | Gris obscuro | Compacta | 0.0245 b |
Por otra parte, el peso de los callos parcialmente formados en los tratamientos con ANA, fue significativamente mejor con respecto a los demás tratamientos evaluados (Tukey, p≤0.05). No obstante, al comparar esa respuesta con la obtenida en otras especies empleando los mismos reguladores de crecimiento, son resultados inferiores, por ejemplo, a lo reportado por Lozzi et al. (2018), quienes a partir de explantes de cotiledones en Ceratonia siliqua L. lograron 32.5 g de callos blancos cremosos con 2,4-D (0.55 mg L-1). Sin embargo, la respuesta para formar callo en Euphorbia nutans Lag. a partir de segmentos nodales, tal vez dependa de ANA sin citocinina y en diferente concentración (Tabla 1). Tal es el caso de 2,4-D, ya que los resultados obtenidos no coinciden con lo publicado por Lozzi et al. (2018), Hernández-Amasifuen et al. (2021) y Millones-Yamunaqué et al. (2021), quienes mencionan a 2,4-D para formar callo. Pero en este trabajo, el efecto de 2,4-D se vio inhibido por las citocininas, excepto cuando se combinó con Kin y favoreció parcialmente callo tipo 2 en el 70 % de explantes, respuesta que coincide con Abbas (1993) al emplear 2,4-D y Kin. También, ANA + BA tuvieron menor respuesta (40%) que Kin y 2i-p con ANA (70%), posiblemente porque BA está indicada para organogénesis directa como indica Rangel-Estrada et al. (2015) en Euphorbia pulcherrima Will, a partir de segmentos nodales y en concentraciones menores (2.0 y 1.0 mg L-1) a las manejadas en este trabajo, pudiendo causar antagonismo con ANA. Esto sugiere que, en estudios posteriores, se evalue con otras citocininas, diferentes concentraciones y otros explantes; pues Preciado et al. (2016) mencionan al ANA con cinetina (1.0 mg L-1) para formar callos en Jatropha cuneata Wiggins & Rollins a partir de hojas. Por otra parte, Rodríguez et al. (2014) publicaron que ANA fue el mejor regulador para inducir callo en Ugni molinae T., igualmente son resultados similares a los publicados por Lee & Starratt (1972) en Euphorbia esula L. y Euphorbia cyparissias L. para obtener callos con ANA, coincidiendo parcialmente con los obtenidos en Euphorbia nutans Lag. Esto indica que ANA, favorece la desdiferenciación celular, resultando interesante para regenerar plantas in vitro de manera indirecta independientemente de la especie (Tabla 1).
Respuestas a la formación de callo in vitro en segmentos nodales de Euphorbia nutans Lag., por tratamiento. Los tratamientos que tienen la misma letra no son estadísticamente diferentes (Tukey, p≤0.05).
Responses to callus formation in vitro in nodal segments of Euphorbia nutans Lag., by treatment. Treatments that have the same letter are not statistically different (Tukey, p≤0.05).
No obstante, Ripley & Preece (1986) mencionan que BA no es necesaria para la proliferación de brotes axilares en Euphorbia lathyris L., pero sí fue fundamental para la obtención de callo y brotes adventicios. Sin embargo, en Euphorbia nutans Lag. BA no fue favorable para obtener callo cuando se combinó con 2,4-D y TDZ, sólo con ANA; esto sugiere que BA no es compatible con otras auxinas para formar callo, coincidiendo esta observación con lo mencionado por Janarthanam et al. (2010) en Stevia rebaudiana Bert. (Asteraceae), quienes obtuvieron callo para análisis de metabolitos secundarios empleando 0.5 mg L-1 de ANA + 0.5 mg L-1 de 2,4-D y 1.0 mg L-1 de Kin, sin BA. Sin embargo, BA sí es importante para el proceso de organogénesis como mencionan Xu et al. (2008) en Euphorbia ésula L., quienes obtuvieron brotes a partir de callo después de treinta días de cultivo in vitro en medio MS adicionando BAP y AIB, así como a lo reportado por Ali & Tariq (2013) en Momordica charantia cv. Jaunpuri (Cucurbitaceae) cuando emplearon BAP, AIA y 2,4-D, al ser mejor la combinación BAP + 2,4-D al igual que lo publicado por Fallah et al. (2022); o a lo mencionado por Preciado et al. (2016) en Jatropha cuneata Wiggins & Rollins, y ser mejor ANA con cinetina que 2,4-D. Sin embargo, Arzate-Fernández et al. (2020) publican que a mayor concentración de 2,4-D en todos los explantes de Agave marmorata R., el peso de callo aumentó, resultados totalmente diferentes a los obtenidos en Euphorbia nutans Lag., donde la única combinación que favoreció la formación de callo de coloración gris obscuro y poco friable, de manera similar a López-Ramírez et al. (2021), fue con Kin + 2,4-D. Así mismo, Álvarez-Aragón et al. (2020) mencionan el empleo de 2,4-D con BA para la obtención de callo a partir de semillas maduras en Agave marmorata R., y Fallah et al. (2022) también mencionan a 2,4-D y BAP para inducir callo a partir de brotes de zanahoria. Sin embargo, en el presente trabajo con Euhorbia nutans Lag., esa respuesta no fue favorecida. Esto sugiere que las respuestas morfogénicas pueden estár controladas a nivel de receptores celulares, y dichos receptores pueden variar no sólo de la especie, sino del tipo de explante; o incluso, dichas respuestas dependan de la especie, de la concentración y combinación de reguladores de crecimiento como señala Gätjens-Boniche et al. (2018) en Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews (Orchidaceae) al obtener callos protocórmicos con BAP y 2,4-D en 1.0 y 0.5 mg L-1 respectivamente; y a lo mencionado por Wu et al. (2019), quienes lograron mantener cultivos de callos de Lilium brownii FEBr. ex Meillez. empleando medio MS suplementado con 30.0 g L-1 de sacarosa, 8.0 g L-1 de agar, adicionado con 2,4-D, ANA y BA o thidiazuron (TDZ) o zeatina.
Inducción de callo a partir del cultivo in vitro de hojas completas y segmentos foliares de Euphorbia nutans Lag.
Los resultados indican que la posición de la hoja en el medio de cultivo no representa un factor determinante en la formación de callo (Tabla 2), sino el contacto de la parte basal de la hoja con éste. Como se puede apreciar en la Figura 3, el callo se formó en el peciolo de las hojas, por lo tanto, la formación de callo será positiva siempre y cuando la hoja lleve parte del peciolo y éste quede en contacto con el medio de cultivo, independientemente de si el haz foliar se coloca hacia arriba o hacia abajo sobre el medio de cultivo. Por ello, las respuestas obtenidas con hojas como explantes sí coinciden con lo citado por Pierik (1990) y Kondamudi et al. (2009), ya que parece ser necesario causar una herida para inducir respuesta callogénica en los explantes, lo que resulta similar a la respuesta obtenida (callo) en otras especies como reporta Albarrán-Mondragón et al. (2022) cuando cultivaron secciones de hojas en Bromelia karatas L. De igual forma, los resultados obtenidos fueron similares a lo mencionado por Mathur & Hülskamp (2002) sobre la importancia de los microtúbulos y microfilamentos de actina, así como el citoesqueleto en el control de la morfogénesis de las plantas; pues como es evidente, en ninguna otra parte de la hoja se indujo la formación de callo sino sólo en el peciolo, el cual fue “herido” con el bisturí. No obstante, es fundamental que el tejido herido quede en contacto con el medio de cultivo, ya que los peciolos heridos que quedaron sin contacto con el medio no tuvieron respuestas (Figura 3).
Tabla 2 Inducción de callos in vitro a partir de hojas completas y segmentos foliares de Euphorbia nutans Lag.Table 2. In vitro callus induction from complete leaves and leaf segments of Euphorbia nutans Lag.
| Explante | Porcentaje de respuesta (%) | Características del callo | Peso de callo (g) | |
|---|---|---|---|---|
| Color | Textura | |||
| Hoja completa HazA | 100 | Verde claro | Poco cristalino | 0.0174 c |
| Hoja completa HazB | 40 | Clorótico | Poco cristalino | 0.0113 c |
| Segmento foliar HazA | 100 | Gris obscuro | Compacta | 0.8830 b |
| Segmento foliar HazB | 100 | Gris obscuro con tonos rojos | Compacta | 0.8220 b |
| Segmento foliar HazA con nervadura central hendida | 100 | Verde limón | Friable | 1.9355 a |
| Segmento foliar HazB con nervadura central hendida | 100 | Verde limón | Friable | 1.9078 a |
Figura 3 Callos formados en hojas completas in vitro de Euphorbia nutans Lag. A) Hoja completa de Euphorbia nutans Lag., B) y C) Respuesta para formación de callo en hojas completas con el haz hacia arriba, D y E) Respuesta para formación de callo en hojas completas con el haz hacia abajo. Barra = 5 mm.
Respuestas a la formación de callo in vitro en segmentos nodales de Euphorbia nutans Lag., por tratamiento. Los tratamientos que tienen la misma letra no son estadísticamente diferentes (Tukey p≤0.05).
HazA: Envés de la hoja en contacto con el medio de cultivo.
HazB: Haz de la hoja en contacto con el medio de cultivo.
Responses to callus formation in vitro in nodal segments of Euphorbia nutans Lag., by treatment. Treatments that have the same letter are not statistically different (Tukey p≤0.05).
BeamA: Underside of the leaf in contact with the culture medium.
BeamB: Beam of the leaf in contact with the culture medium.
Con respecto al color de callo obtenido en Euphorbia nutans, los resultados son similares a lo publicado por Perera & Trader (2010) en Euphorbia pulcherrima Will empleando medio MS + BA y BA + AIA, así como a lo mencionado por Jasrai et al. (2003), pues también observaron la presencia de callos color blanco y color gris-verde después de un mes de cultivo. Esto sugiere que probablemente, son respuestas en común para plantas de la familia Euphorbiaceae (Figura 4); aclarando que en Euphorbia nutans Lag., las tonalidades color rojo aparecieron después de tres semanas de cultivo in vitro y no fue una coloración homogénea del callo, sólo en ciertos sitios de manera similar a lo que sucede en las hojas de las plantas en campo (Figura 4).
Figura 4 Respuestas a la formación de callo in vitro en segmentos de lámina foliar media de Euphorbia nutans Lag. sin hendir la nervadura central por la mitad. A) Restos de hoja después de aislar la parte media, B) Inicio de respuesta a callo en el margen foliar herido con el bisturí, C) Formación de callo a los 30 días de cultivo in vitro a partir del segmento de lámina foliar con el haz en contacto con el medio de cultivo, D) Formación de callo con coloración rojiza en segmento de lámina foliar a los 15 días de cultivo in vitro con el envés en contacto con el medio de cultivo. Barra = 5 mm.
Por otra parte, la inducción de callo friable en Euphorbia nutans Lag., sucedió de forma significativa (Tukey, p≤0.05) cuando se sembraron segmentos de lámina foliar y se escindió la nervadura central justo por la mitad (Tabla 2 y Figura 5). Con ello, la respuesta obtenida fue independientemente de la posición del explante, resultados que refuerzan lo publicado por Šamaj et al. (2004) y Mathur & Hülskamp (2002) sobre la importancia de exponer dichas estructuras celulares directamente con el medio de cultivo. Así mismo, Pickens et al. (2005) mencionan que la mayoría de callos y brotes en Euphorbia pulcherrima Will., se obtuvieron a partir de secciones de la vena media de las hojas cultivadas in vitro con BA y AIA durante un mes, y Naz et al. (2011) menciona tejidos de hojas cotiledonales de Ricinus communis L. para inducción de callo. De acuerdo a las respuestas obtenidas en Euphorbia nutans Lag., y a lo citado por Ripley & Preece (1986) en Euphorbia lathyris L. con BA para formación de callo, Jasrai et al. (2003) y Perera & Trader (2010) en Euphorbia pulcherrima Will. con BA y AIA, se puede ver que BA juega un papel muy importante para la formación de callo con o sin auxinas, dependiendo de la concentración, especie vegetal y explante utilizado como explicó Arzate-Fernández et al. (2020) para obtener callos compactos color crema, compactos amarillentos y hasta callos friables con cubierta mucilagenosa en especies de Agave. No obstante, recordar que la mejor respuesta para obtener callo en Jatropha cuneata a partir de hojas por Preciado et al. (2016), fue cuando emplearon ANA con cinetina y no con 2,4-D. Esto sugiere que, la combinación de BA y ANA, puede ser una excelente alternativa para la desdiferenciación celular de tejidos vegetales in vitro, y que explantes a partir de hojas pueden ser una excelente alternativa como fuente de explantes para la formación de tejido calloso (Hernández-Amasifuen et al., 2021; Albarrán-Mondragón et al., 2022). Por lo tanto, es importante seguir trabajando en detallar protocolos de respuestas morfogénicas en Euphorbia nutans Lag. de acuerdo a los estudios posteriores que resulten de interés.
Figura 5 Obtención de callos in vitro en Euphorbia nutans Lag. a partir de segmentos de lámina foliar, con la nervadura central hendida por la mitad a 7 días de cultivo en medio MS 100% + BA y ANA 10.0 mg L-1. A-B) Haz foliar en contacto con el medio de cultivo, C-D) Envés foliar en contacto con el medio de cultivo. Barra = 5 mm.
Análisis fitoquímico de extractos a partir de callos obtenidos in vitro y de plantas silvestres de Euphorbia nutans Lag.
Los metabolitos identificados en el extracto hexánico fueron: en las fracciones 139-148 eluidas con hexano:AcOEt (95:5), se aisló un solido cristalino denominado acetato de α- amirina, identidad que fue confirmada al comparar sus propiedades espectroscópicas con las descritas en la literatura (Bhattacharyya & Barros, 1985; Ipav et al., 2022b), de las fracciones 200-223 eluidas con hexano:AcOEt (9:1), se obtuvo otro sólido cristalino identificado como β-lupeol, mismo que que coincidió con las características espectroscópicas publicadas recientemente (Ipav et al., 2022a), de las fracciones 252-303 eluidas con hexano:AcOEt (9:1); se visualizaron en su espectro de RMN de 1H, β-sitosterol, estigmasterol y β-lupeol, mismos que fueron separados por recromatografias sucesivas cuyos datos espectroscópicos correspondieron a los esteroles aislados previamente de Rubus suavissimus (Chaturvedula & Prakash, 2012). Por otro lado, los metabolitos identificados en el extracto de dicloromentano (CH2Cl2) son: en las fracciones 97-100 eluidas con hexano:AceOEt (95:5) se aisló e identificó β-sitosterol y una mezcla de 24-metilen cicloartan-3β-ol (Kikuchi et al., 1986). De las fracciones 101-126 eluidas con hexano:AceOEt (95:5) se aisló β-lupeol (Aguilar-Jiménez et al., 2015). En el extracto de metanol los metabolitos identificados fueron: de las fracciones 1-40 eluidas con cloruro de metileno, estigamasterol y β-sitosterol; y de las fracciones 511-570 eluidas con CH2Cl2:MeOH (1:1), se encontró un metabolito tipo iridoide por comparación de sus datos espectroscópicos de RMN de 1H con los descritos en la literatura (El-Naggar & Beal, 1980).
El análisis de extractos mediante TLC, reveló algunas diferencias entre extractos de callos producidos in vitro con respecto a los obtenidos de plantas silvestres (Figura 6). Por lo tanto, sí se está de acuerdo de forma parcial con Kreis (2007), porque existe la posibilidad de no haber obtenido los mismos metabolitos a partir de células indiferenciadas como se aprecia en la placa TLC, específicamente en extracto con hexano de plantas silvestres; observándose en el primer carril, de izquierda a derecha, dos bandas (señaladas con flechas color rojo) que corresponde a dos posibles metabolitos no presentes en el extracto hexánico de callos (Figura 6). Sin embargo, resulta lógico que haya variaciones entre los dos extractos porque las condiciones en campo son diferentes a las condiciones in vitro. Por lo tanto, existen variaciones en la biosíntesis de metabolitos secundarios, moléculas que ayudan a sobrevivir a las plantas bajo ciertas situaciones de estrés (Taiz & Zeiger, 2006; Verpoorte et al., 2000), y no porque se trate de células indiferenciadas. Además, se aprecian en la placa cromatográfica, para los extractos de callos con cloruro de metileno (CH2Cl2) y con metanol (CH3OH), la presencia de las mismas bandas que en extractos de plantas silvestres (Figura 6, carriles 4 y 6, respectivamente), y además, otras bandas (señaladas con flechas color amarillo y azul) que no se observan en los extractos de plantas silvestres con los mismos disolventes (Figura 6, carriles 4 y 5). Estos resultados son similares a los obtenidos en especies diferentes como mencionan Janarthanam et al. (2010) en Stevia rebaudiana, ya que encontraron los principales compuestos activos en células indiferenciadas cultivadas in vitro. Así mismo, López-Ramírez et al. (2021) mencionan que un análisis cromatográfico y espectrométrico, les permitió separar e identificar 22 compuestos en callos, 26 en plantas in vitro y 27 en plantas ex vitro de Yucca carnerosana Trel. De forma similar, Ali & Tariq (2013) mencionan que las plantas de Momordica charantia cv. Jaunpuri cultivadas en campo, mostraron mayor cantidad de metabolitos secundarios que los callos a partir de plántulas in vitro. Sin embargo, al emplear cotiledones como explantes para formar callo, observaron que los metabolitos secundarios obtenidos eran comparativamente similares con ligeras variaciones. Incluso, al comparar la extracción de metabolitos a partir de entrenudos de plantas crecidas en campo, con los obtenidos en cultivos de callo, en ambos casos se encontró el ácido alfa-eleosteárico, un ácido graso específico de Momordica sp. Todo ello sugiere que, la biosíntesis de metabolitos a partir de tejidos indiferenciados (callos) sí es posible, e incluso, pueden obtenerse otros metabolitos secundarios que no se encuentran en plantas silvestres o en campo, pero se debe contar con protocolos rigurosos para controlar su producción mediante el empleo de elicitores celulares y cultivos específicos (Baldi et al., 2007), e incluso, considerar que el éxito en ello puede depender del tipo de explante empleado (Ali & Tariq, 2013). Por ello, se sugiere que en estudios fitoquímicos posteriores se consideren callos, plantas diferenciadas in vitro y material vegetal silvestre.
Figura 6 Placa cromatográfica en capa delgada en la que se utilizó una mezla de CH2Cl2/MeOH, 7/3 (v/v) como eluyente, para comparar los metabolitos obtenidos en extractos de plantas silvestres vs extractos de callos in vitro de Euphrbia nutans Lag. HexS: Extracto hexánico de plantas silvestres, HexC: Extracto hexánico de callos, CH2Cl2S: Extracto con diclorometano de plantas silvestres, CH2Cl2C: Extracto con diclorometano de callos, MetS: Extracto con metanol de plantas silvestres, MetC: Extracto con metanol de callos.
Por otra parte, el análisis mediante RMN 1H reveló que los metabolitos secundarios obtenidos a partir de plantas silvestres en el extracto con hexano, fueron: β-sitosterol (1), estigmasterol (2), β-lupeol (3) y acetato de α-amirina (4); cuyas estructuras moleculares se muestran en la Figura 7. En el extracto de diclorometano se identificaron los metabolitos 1, 2, 3, y 24-metileno-cicloart-3β-ol (5), cuyas características espectroscópicas coincidieron con el un cicloartano, aislado e identificado, presente en Nervilia purpurea S. (Kikuchi et al., 1986). En el extracto metanólico, se identificaron los metabolitos 1 y 2; y se detectó un metabolito interesante de tipo iridoide (6), sus características espectroscópicas corresponden a la estructura general de un iridoide (El-Naggar & Beal, 1980), el cual no ha sido descrito en plantas de la familia Euphorbiaceae, por lo que este estudio es el primero en reportarlo, así como el primer estudio fitoquímico que se describe para la planta Euphorbia nutans Lag. (Aguilar-Jiménez et al., 2015). Así mismo, el análisis mediante RMN 1H del extracto con metanol a partir de callos, reveló sacarosa abundante; posiblemente porque el medio de cultivo fue adicionado con sacarosa, y las condiciones in vitro permitieron mayor biosíntesis de ella, entre otros metabolitos secundarios (Baldi et al., 2007; Sakunphueak & Panichayupakaranant, 2010; Pérez-Alonso & Jiménez, 2011) y no se inhibieron por tratarse de tejidos no diferenciados como menciona Kreis (2007), pues se ha demostrado la posibilidad de obtener metabolitos secundarios en células indiferenciadas (Janarthanam et al., 2010; Ali & Tariq, 2013; Aguilar et al., 2019). Así mismo, es importante realizar comparaciones fitoquímicas en igualdad de condiciones, y no argumentar que en cultivos in vitro no se obtienen los mismos metabolitos o las mismas cantidades, cuando se consideran partes botánicas diferentes, como frutos maduros vs callo u hojas in vitro (Albarrán-Mondragón et al., 2022), ya que los metabolitos secundarios de plantas no siempre se encuentran de forma generalizada, e incluso, pueden estar presentes sólo en partes muy específicas de ellas (Harborne, 1984). Por lo tanto, es importante ajustar las condiciones in vitro que permitan obtener respuestas deseadas a partir de cultivos diferenciados e indiferenciados (Pérez-Alonso & Jiménez, 2011).
Conclusiones
Fue posible la inducción de callo en segmentos nodales, de forma significativa solo en los medios de cultivo con ANA, independientemente de la citocinina empleada. Con el empleo de segmentos de lámina foliar con nervadura central hendida por la mitad, sin importar su posición en el medio de cultivo, se logró la máxima producción de callo friable con color verde limón y apariencia mucilaginosa.
Las placas cromatográficas, revelaron la presencia de los mismos metabolitos en extractos de callos in vitro y en extractos de plantas silvestres de Euphorbia nutans Lag. con algunas variaciones, que posiblemente correspondan a otros metabolitos secundarios presentes en callos. Finalmente, el análisis mediante RMN 1H permitió identificar seis metabolitos secundarios conocidos: β-sitosterol, estigmasterol, acetato de α -amirina, β-lupeol, 24-metilen-cicloartan-3β-ol y un metabolito tipo iridoide; confirmado que el cultivo de células indiferenciadas in vitro, también pueden realizar la biosíntesis de metabolitos secundarios.
