Artículos científicos

 

Genotoxicidad de la furazolidona y la forma libre de su metabolito 3–amino–2–oxazolidona, mediante la prueba de micronúcleos en linfocitos humanos

 

Genotoxicity of furazolidone and the free form of the metabolite: 3–amino–2–oxazolidone, based on human lymphocytes micronucleus test

 

Evaristo Álvaro Barragán Hernández^* Luis Alonso Herrera Montalvo^* Luis Ocampo Camberos^** Héctor Sumano López^***

 

^* Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México.

^** Laboratorio de Citogenética, Instituto Nacional de Cancerología, Secretaría de Salud.

^*** Departamento de Fisiología y Farmacología Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México.

 

Responsable de correspondencia:
Héctor Sumano.
Correo electrónico: sumano@servidor.unam.mx.

 

Recibido el 25 de octubre de 2010.
Aceptado el 21 de mayo de 2011.

 

Abstract

The aim of this trial was to assess the genotoxic effects of the main metabolite of furazolidone (3–amino–2–oxazolidone–AOZ), which is usually protein–bound (PB–AOZ). Because PB–AOZ is not available as a tool for biomedical research, the synthetic free form of AOZ (F–AOZ) was used to challenge human lymphocytes in the genotoxic quantification test of induced micronuclei on human lymphocytes. The level of exposure of lymphocytes to F–AOZ was calculated by determining the residual quantity of the Bg–AOZ (from liver and muscle) by HPLC, derived from broilers fed furazolidone included at 0.11% and 0.22% in feed, and allowing a seven day withdrawal time. Then F–AOZ and furazolidone as positive genotoxic group were added at various concentrations higher than the residual level indication to the in vitro preparations diluted both in dimethyl sulfoxide (DMSO) as follows: for furazolidone (FZD) groups of 10 μM (225 mg/g), 1.0 μM (225 mg/g), 0.1 μM (22.5 mg/g), and 0.001 μM (0.225 mg/g), as well as a negative control group and positive control with DMSO 10–3 M (0.130 mg/g) and arsenic 10–3 M (0.747 mg/g), respectively; for F–AOZ 0.01 μM (1.020 mg/g); 0.102 μM; 0.0005 μM (0.051 mg/g); and 0.0001 μM (0.001 mg/g) were tested, having the same controls groups as for FZD. Results show that furazolidone from 10.0 μM through 0.1 μM possesses a well defined genotoxic effect. Association frequency, relative risk and ANOVA test showed a statistically significant effect vs the negative control group (P = 0.001; P = 0.03 and P = 0.04, respectively). For F–AOZ the same statistical tests showed that only 0.01 μM was capable of inducing a genotoxic effect. These results suggest that furazolidone as parent compound is potentially capable of inducing genotoxicity in consumers. In contrast, only the highest concentration of F–AOZ was shown to induce a similar effect. Yet this concentration is well above the expected residual concentration after a 7–day withdrawal period. These results do not support the use of furazolidone in humans as it is now accepted and reveals that F–AOZ is a considerably lower hazard to public health than the parent compound. Yet, lack of evidence of the effect of bound–AOZ in a similar setting precludes further comparisons, but these results suggest that it seems unlikely that PB–AOZ is a real risk to public health. Further studies are warranted.

Key words: furazolidone, 3–amine–2–oxazolidone, residues, genotoxicity, human lymphocytes, micronucleus test.

 

Resumen

El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos genotóxicos del metabolito principal de la furazolidona 3–amino–2–oxazolidona (AOZ) que usualmente se encuentra unido a la proteína (AOZ–UP). Debido a que no se dispone para investigación biomédica de AOZ–UP, se utilizó la forma libre de AOZ (AOZ–L) como desafío genotóxico por medio de la técnica de cuantificación de micronúcleos inducidos en linfocitos humanos. El nivel de exposición de linfocitos a AOZ–libre fue establecido con base en la determinación por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) de los residuos de AOZ–UP encontrados en músculo e hígado de pollos, producidos en forma comercial, expuestos a furazolidona (FZD) por medio del alimento a dosis de 0.11% y 0.22%, permitiendo un tiempo de retiro de 7 días. Se conformaron dos grupos furazolidona (FZD) con las siguientes concentraciones de 10 μM (225 mg/g), 1 μM (225 mg/g), 0.1 μM (22.5 mg/g), y 0.001 μM (0.225 mg/g), así como el grupo testigo negativo sulfoxido de dimetilo (DMSO) 10–3 μM (0.130 mg/g) y el testigo positivo arsénico 10–3 μM (0.747 mg/g). Para AOZ–libre las concentraciones fueron 0.01 μM (1.020 mg/g); 0.001 μM (0.102 mg/g); 0.0005 μM (0.051 mg/g); y 0.0001 μM (0.001 mg/g) con los mismos grupos testigo. Los resultados muestran que la furazolidona a concentraciones de 1.0 μM y 0.1 μM posee un efecto genotóxico bien definido. El grado de asociación se calculó por medio del riesgo relativo y prueba de ANDEVA, que mostró el efecto estadísticamente significativo al compararlo con el grupo testigo negativo (P = 0.001; P = 0.03 y P = 0.04, respectivamente). Para AOZ–L las mismas pruebas estadísticas mostraron que sólo la concentración 0.01 μM era capaz de inducir un efecto genotóxico. Estos resultados sugieren que la furazolidona como sal pura es potencialmente capaz de inducir efectos genotóxicos en humanos, en los que no se apoya su uso. En contraste, sólo la concentración más alta de AOZ–L mostró un efecto similar, pero dicha concentración es mayor que la encontrada como residual a los siete días de retiro y puede considerársele como un peligro mucho menor para la salud pública que el compuesto progenitor. Dada la falta de evidencia científica del efecto genotóxico del AOZ–UP no se pueden realizar comparaciones adicionales con lo obtenido aquí para AOZ–L, pero parecería poco probable calificar a los residuos de AOZ–UP como peligros reales para la salud pública, por lo que se requieren pruebas adicionales.

Palabras clave: furazolidona, 3–amino–2–oxazolidona, residuos, genotoxicidad, limfocitos humanos, prueba de micronucleos.

 

Introducción

Se ha objetado el uso de nitrofuranos en animales productivos en todo el mundo.^1–5 Por ejemplo, la (FDA) Food and Drug Administration de los Estados Unidos de América considera que se debe prohibir su comercialización dado que pueden generar residuos carcinogénicos en tejidos animales.^1–6 El denominado Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JEFCA) los considera genotóxicos y capaces de aumentar la incidencia de tumores malignos en ratones y ratas.⁷ De tal suerte que el uso de dicha familia de antibacterianos para la producción de alimentos ha sido prohibido por la mayoría de los mercados importadores de alimentos. No obstante, el JEFCA puntualiza que la información sobre el efecto potencial carcinogénico de los metabolitos de los nitrofuranos, por ejemplo de la furazolidona y en particular del metabolito 3–amino–2–oxazolidona (AOZ), es incompleta, por lo que se requiere determinar si los residuos ligados a proteínas (AOZ–UP) son en realidad genotóxicos^.8–14 Desafortunadamente no hay formas de AOZ–UP disponibles para investigación. Se postula que pueden interferir con la seguridad alimentaria dado que pueden persistir en el animal destinado al consumo humano o sus productos por largos periodos después de finalizar el tratamiento, y porque existe el potencial de que, con la digestión, sean liberados de la proteína con la que vienen unidos, dando lugar a formas potencialmente tóxicas.^15,16 En contraste, hay evidencia que indica una baja toxicidad y genotóxica del AOZ–UP.¹⁵

Aunque es evidente que existen dos corrientes de pensamiento con respecto a la peligrosidad de los nitrofuranos, el Codex Alimentarius no ha establecido un valor de ingestión diaria admisible (IDA), lo que ha generado que se propongan criterios a menudo extremos. Por ejemplo, para la Unión Europea, el límite de detección exigido para aceptar resultados analíticos es como máximo 1 ng/g (1 ppb) y se le denomina: límite mínimo de funcionamiento exigido. Si un método analítico no alcanza esta sensibilidad, no se le considera apto. En cuanto a Ridascreen®,^* es una prueba cuantitativa comercial basada en inmunoensayo que puede detectar 10 ppt (0.01 ppb). En contraste con la cifra anterior, en las pruebas de genotoxicidad en animales de laboratorio se utilizan dosis o concentraciones mucho más altas de estos potenciales carcinógenos y durante periodos de exposición relativamente cortos. Esto ha generado especulaciones sobre el valor predictivo del riesgo para los humanos expuestos a dosis mucho más bajas y durante periodos de exposición a menudo intermitente y de duración muy variable. En ese sentido, cabe destacar a la prueba de micronúcleos en linfocitos humanos. En esta prueba se utilizan linfocitos como marcadores de genotoxicidad y se extrapola, aparentemente con mayor certeza, a poblaciones humanas expuestas a xenobióticos.¹⁷ Esta prueba se basa en el rompimiento cromosómico, mutaciones heredables o inducción de mutaciones genéticas.¹⁸ Esto es, los micronúcleos son fragmentos de cromosomas o cromosomas completos aislados debido a una división mitótica o meiótica errónea que de manera espontánea quedan fuera del núcleo. Su presencia se incrementa significativamente cuando el organismo a estudiar se expone a agentes clastógenos y aneuploidogénicos, que ingresan a las células hijas después de la citocinesis.^19–20

Dada la aparente discrepancia en la información con lo que respecta a la genotoxicidad de los residuos de metabolitos de furazolidona (principalmente 3–amino–2–oxazolidona [AOZ], libre o unida a proteínas), se consideró necesario realizar un ensayo para evaluar el potencial que este metabolito en forma libre puede tener al respecto, y su comparación con el fármaco progenitor (furazolidona), utilizando una de las pruebas más sensibles: micronúcleos en linfocitos humanos, pero a concentraciones iniciales encontradas en vísceras y carne de pollo de engorda expuestos a dosis altas no tóxicas de furazolidona por largos periodos y elevando dichas concentraciones en múltiplos de log₁₀.

 

Material y método

Se emplearon 300 pollos de la estirpe Ross 308, divididos en tres grupos de 100 pollos cada uno. Las aves se sometieron a un ciclo de producción de forma convencional; a un grupo se le medicó inicialmente 28 días con dosis de 110 g de furazolidona/ton de alimento, y un segundo grupo se medicó a dosis de 220 g de furazolidona/ton de alimento por 10 días; se mantuvieron las dosis de 55g/ton en ambos grupos hasta la sexta semana de edad. Se formó un grupo testigo no medicado, manejado de la misma manera que los demás. Siete días antes del sacrificio se retiró el alimento medicado en ambos grupos.²¹

Una vez concluido el ciclo productivo de las aves de los 3 grupos se les sacrificó por métodos físicos de acuerdo con la NOM–009–Z00–1994²² y se obtuvieron muestras de masa muscular de pierna e hígado. Se les identificó y congeló a –20°C hasta su análisis. De cada grupo se muestrearon aleatoriamente 50 aves, incluyendo el grupo testigo.

La técnica analítica se basó en cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) de la forma desarrollada por Angellini et al.²³ y validada para la determinación de residuos de nitrofuranos en muestras de tejidos musculares estabilizadas a pH 6.0. Los residuos se extrajeron con acetonitrilo, se purificó la muestra por partición líquido–líquido entre el acetato de etilo y acetonitrilo, y se concentró el extracto. Los residuos del fármaco fueron disueltos en la fase móvil [(0.01 M tampón de acetato de sodio (pH 4.5)–acetonitrilo (70:30)], se filtró y se determinó por CLAR, para lo cual se empleó una columna C18 de fase inversa (Hypersil ODS) a 35°C, usando un detector de red UV–visible^** con arreglo de diodos y a 365 nm. Los tiempos de retención y el espectro ultravioleta de picos de las muestras se compararon con los de los patrones estándar de furazolidona^*** y AOZ.^**** La cantidad detectada del metabolito AOZ (unido a proteína) en el grupo dosificado a 110 g/ton fue de 0.108 mg/g ± 0.3 mg/g, y en el grupo que recibió 220 g/ton fue de 0.135 mg/g ± 0.178 mg/g. Este último grupo mostró una mayor cantidad de AOZ tanto en músculo como en hígado (P < 0.05). Estos datos sirvieron como valores directrices para realizar los bioensayos de micronúcleos (MN), utilizando el promedio encontrado de 0.464 mg/g como punto medio, aumentando y disminuyendo las concentraciones para los bioensayos con linfocitos. Para la furazolidona se usaron valores mayores y menores a una concentración media (2.25 mg/g) congruente con las que se lograrían en tejidos, dada una dosis terapéutica en humanos.

Los bioensayos de MN se realizaron en el laboratorio de Citogenética del Instituto Nacional de Cancerología, conforme a lo descrito por Fenech.^24,25 Los linfocitos se obtuvieron a partir de sangre entera de 10 donadores voluntarios, clínicamente sanos, no fumadores ni consumidores de alcohol, con un rango de edad entre los 20 y 45 años. Se constató por anamnesis que no recibieron tratamiento durante los 30 días previos a la donación. Se formaron los siguientes grupos experimentales: a) Grupo furazolidona: con células de linfocitos humanos expuestas a las siguientes concentraciones de furazolidona: 10 μM (225 mg/g), 1 μM (225 mg/g), 0.1 μM (2.25 mg/g), 0.001 μM (0.225 mg/g). Se utilizó sulfóxido de dimetilo (DMSO) 10–3 μM (1.303 mg/g) como testigo negativo de grupo, y arsénico 10–3 μM (0.749 mg/g) como testigo positivo de grupo. b) Grupo AOZ–L: con células de linfocitos humanos expuestas a concentraciones de AOZ–no unido a proteína–libre:^***** 0.01 μM (1.029 mg/g); 0.001 μM (0.102 mg/g); 0.0005 μM (0.0510 mg/g); 0.0001 μM (0.001 mg/g). También se uso sulfóxido de dimetilo (DMSO) 10–3 μM (1.303 mg/g) como testigo negativo de grupo, y arsénico 10–3 μM (0.749 mg/g) como testigo positivo de grupo.

La evaluación de los MN se realizó en 1000 células bi–nucleadas (CBN), la lectura se efectuó por duplicado y enmascarando los tratamientos. Los criterios que se emplearon para identificar micronúcleos en CBN, son los aceptados en estudios internacionales20 y que se resumen a continuación:

Para identificar CBN la célula debe tener dos núcleos redondos u ovales, los núcleos no deben estar conectados por puentes de cromatina, los núcleos pueden estar en profase temprana, los núcleos deben tener un tamaño similar (no necesariamente idéntico), los núcleos pueden estar parcialmente sobrepuestos y tener citoplasma bien conservado, los micronúcleos deberán tener forma redonda u oval, tamaño 1/2 a 1/5 del tamaño de los núcleos, no deben ser refringentes, deben presentar igual color e intensidad que el núcleo principal, no deben tocar ninguno de los núcleos, deben presentar la misma condensación que los núcleos.

Los resultados se procesaron por medio del paquete estadístico STATA 11.01.^****** Se empleó la estadística descriptiva para calcular las medidas de tendencia central y de dispersión y se utilizó la estadística inferencial para medir el grado de asociación para inducir MN por medio del riesgo relativo y fracción etiológica, y se realizó un análisis de varianza para encontrar la dosis que produzca el efecto estudiado de acuerdo con lo sugerido por Hernández y López.²⁶

 

Resultados

En la Figura 1 se presentan como barras de frecuencia la media ± 1 desviación estándar (DE) del número de micronúcleos observados para los linfocitos tratados tanto con furazolidona como con AOZ–L, teniendo como referencia los grupos testigo. En esa misma figura se destacan mediante literales los valores que presentaron diferencias significativas.

Para los grupos tratados con furazolidona, las concentraciones que tuvieron el mayor grado de asociación con la producción de micronúcleos fueron 1 μM, 10 μM y 0.001 μM de furazolidona (22.5 μg/g, 225 μg/g y 0.225 μM). La concentración de 10 y 0.1 μM presentaron un riesgo relativo de 1.36, es decir los linfocitos expuestos a esta concentración tuvieron 36% más riesgo de desarrollar micronúcleos con respecto a los no expuestos. En ambas concentraciones se obtuvo una fracción etiológica de 0.267; es decir, el 26.7% del desarrollo de MN en la población expuesta se debe a esta concentración. La concentración 1 μM presentó un riesgo relativo de 1.45, es decir, aquellos linfocitos que se expusieron a la dosis de 1 μM tuvieron 45% más riesgo de desarrollar micronúcleos con respecto a los no expuestos, con una fracción etiológica de 0.313. En la concentración 0.1 μM el riesgo relativo fue de 1.09 con una fracción etiológica de 0.004 con base en estos datos dicha asociación se debió al azar. Mediante la prueba de Levene se detectó homogeneidad de varianzas (P = 0.01512), por lo que se hizo una prueba de ANDEVA (P < 0.001). Se concluye que hay diferencias estadísticamente significativas en los tratamientos, con base en ello se hizo la prueba de "t" de Student entre pares de datos, para saber qué tratamiento o tratamientos determinan las diferencias. Se detectó que sólo hay efecto de tratamiento en las concentraciones DMSO vs. 1.0 μM (P = 0.03) y DMSO vs. 0.1 μM (P = 0.04).

Con respecto al metabolito AOZ, se detectó que la concentración que mayor grado de asociación tuvo con la producción de micronúcleos fue la de 0.01 μM (1.029 mg/g), con un riesgo relativo de 2.51 y una fracción etiológica de 0.61. Para las concentraciones de 0.001 μM se obtuvo un RR de 2.33 con un fracción etiológica de 0.571, para concentración de 0.005 μM se obtuvo un RR de 1.44 con una fracción etiológica de 0.308 y para la concentración de 0.0001 se obtuvo un RR de 1.77 con una fracción etiológica de 0.437. Mediante la prueba de Levene se detectó homogeneidad de varianzas (P = 0.036) seguida de ANDEVA (P = 0.044). Las subsecuentes "t" de Student revelaron que sólo cuando se contrastaron DMSO con 0.01 μM de AOZ hubo diferencia estadísticamente significativa (P = 0.03).

 

Discusión

La técnica de micronúcleos con el bloqueo de la citocinesis por medio de la citocalasina B (Cyt–B) identifica a las células que se han dividido una vez en cultivo y de esta manera permiten estimar la frecuencia de micronúcleos generados únicamente bajo las condiciones del estudio.²⁵ Con esta metodología las células se observan como binucleadas debido al efecto inhibidor de la Cyt–B sobre la citocinesis, y sin alterar la cariocinesis. A esta técnica se le describe como una herramienta sensible para la detección de daño genético, además de ser rápida, de fácil aplicación a diferentes tipos celulares e incluso puede sustituir el análisis de aberraciones cromosómicas o intercambio de cromátidas hermanas.²⁰ Con la técnica de MN también es posible discriminar el origen de los micronúcleos entre clastogénicos o aneugénicos empleando anticuerpos anticinetocoro o bien sondas fluorescentes para centrómeros y telómeros, lo que da la posibilidad de discernir el mecanismo de acción de diversos agentes genotóxicos.⁷

Considerando la sensibilidad y especificidad de la prueba de MN es factible postular que los datos obtenidos confirman la capacidad de la FZD para inducir un efecto genotóxico bien definido en concentraciones de 0.1 y de 10 μM por 7 días (22.5 μg/g y 2250 μg/g) y en este sentido, los resultados de este ensayo coinciden con la mayoría de los autores^27–46 aunque utilizando diferentes metodologías. En contraparte, Enniga y Weterings⁴⁷ y Paik,⁴⁸ informan de resultados negativos a genotoxicidad evaluada mediante la prueba de micronúcleos, pero en linfocitos de ratones Swiss CD–1 o en ratones Swiss Webster, respectivamente y administrando FZD por vía oral a dosis de 100 a 500 mg/kg.⁴⁹

En contraste, sólo la concentración más alta de AOZ libre (1.029 mg/g) fue la que mostró la inducción significativa de MN. En este sentido coinciden Hoogenboom et al.,¹¹ quienes describen efectos mutagénicos del AOZ y formación de aductos en proteínas, empleando pruebas de mutagenicidad microsómica con cepas de Salmonella TA 1535 y TA 100 con activación metabólica de la fracción S9 de hígado de rata.

También obtuvieron una respuesta positiva en la prueba de aberraciones cromosómicas en linfocitos humanos y con eritrocitos en la prueba de micronúcleos en médula ósea de ratones tratados con AOZ ligado a proteína de alto peso, pero administrando cantidades exageradas mediante inyección intraperitoneal directa. Los autores concluyen que hay liberación y absorción sistémica de AOZ y que pudiera ser potencialmente mutagénica. Los resultados aquí obtenidos y los documentados por Hoogenboom et al.¹¹ contrastan con lo detallado por Scheres,⁵⁰ quien informa de resultados negativos a genotoxicidad utilizando AOZ libre pero con la prueba de Ames con y sin fracción S9 de hígado de rata, en Salmonella Typhimurium y en concentraciones de 100–500 μg/ml de AOZ.

Tanto lo obtenido en este ensayo como lo informado por Scheres⁵⁰ no pueden compararse con estudios que utilizan AOZ ligada a proteínas, como el de Auro et al.⁵¹ que evaluaron la genotoxicidad de alimento con residuos de AOZ–UP en peces ginogénicos. Ellos postulan que es poco factible considerar al AOZ ligado a proteína como un peligro en la cadena trófica. En ese sentido, es evidente entonces, que sería necesaria la determinación químico estructural de la forma en que AOZ se liga a diferentes proteínas y la dinámica con la que se libera, si ese es el caso posterior al proceso digestivo²⁷ para determinar su potencial peligrosidad.

Es de señalarse que sólo a tres veces más la concentración de AOZ registrada en la literatura como posible contaminante de productos cárnicos a los siete días,^50,52–54 se obtuvo genotoxicidad en este estudio. Esta situación tiene componentes artificiales dado que no sólo no está libre el AOZ en condiciones naturales, sino que, aun sin tiempo de retiro es improbable encontrar esas cantidades en tejidos. De tal suerte que aunque los resultados aquí expuestos sugieren genotoxicidad por AOZ–L, la tasa de exposición a este metabolito permite cuestionar si realmente es un peligro para la salud pública la fracción real de AOZ–UP y cuestiona, a la luz de salvaguardar la salud pública, la validez de rechazos en material cárnico exportado, generado por pruebas analíticas que detecten picogramos por gramo de tejido animal (ppt) por ejemplo el Ridascreen®.^******* Más aún, dada la genotoxicidad probada de la FZD, resulta contrastante que mientras en medicina veterinaria se condena su uso, en medicina humana se pueda prescribir este principio activo, lo que da lugar a cuestionar las medidas sanitarias, es decir, que se condene a desecho los productos cárnicos que contienen ppt de AOZ ligado con proteína y cuya genotoxicidad aún es debatible.

 

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Notas

^* ®Ridascreen. Nitrofurans (AOZ) R3703 r–biopharn, Germany.

^** Sonnteck, Inc. 125 Pleasant Avenue. Upper Saddle River NJ. USA 07458.

^*** SIGMA–ALDRICH, No de cat 46297–250MG Furazolidona.

^**** No. cat. 33347–50MG–R AOZ, VETRANAL analytical standard.

^***** SIGMA–ALDRICH No. Catalogo 33347.

^****** Stata Corp. 4905 Lakeway Drive, College Station, Texas 77845. USA.

^*******http://www.sceti.co.jp/medical/PdfFiles/rbo/R3701_Nitrofurame_AOZ.pdf