INTRODUCCIÓN

El tributilestaño (TBT) es un compuesto organoestañoso que se utilizó como principal aditivo en pinturas antiincrustantes desde la década de los años sesenta (^{Cruz et al. 2007}). Fue causante de una contaminación importante en ambientes marinos al ser un compuesto poco hidrosoluble y de carácter lipofílico que ocasionó una persistencia alta en el ambiente (^{Barreiro et al. 2004}, ^{Rodríguez-Romero 2010}). Esto produjo una bioacumulación del TBT en tejidos de invertebrados, peces, aves y mamíferos; particularmente en ostras este compuesto provoca una disminución en el grosor de su concha, mientras que en gasterópodos genera una disrupción endocrina conocida como imposex (^{Gibbs et al. 1987}, ^{Chacón et al. 2007}). La Organización Marítima Internacional (OMI) adoptó medidas para controlar los impactos ambientales relacionados con el uso del tributilestaño en pinturas para embarcaciones, estableciendo la prohibición total de su uso en el año 2003 y haciéndose efectivo hasta el 2008 (^{Bigatti et al. 2013}).

La toxicidad del compuesto y su gran persistencia en los ecosistemas, principalmente en sedimentos de puertos marítimos y zonas aledañas a ellos (^{de Castro et al. 2012}, ^{Bigatti et al. 2013}), provocó el interés en la comunidad científica por aquellos microorganismos con la capacidad de tolerar e incluso degradar dicho contaminante (^{Wuertz et al. 1991}, ^{Jude et al. 1996}, ^{Dubey et al. 2006}, ^{Cruz et al. 2007}, ²⁰¹⁵, ^{Mohamat-Yusuff et al. 2014}, ^{Ebah et al. 2016}, ^{Liu et al. 2019}). Las bacterias han sido señaladas como uno de los principales microorganismos con capacidad de degradación (^{Dubey y Roy 2003}, ^{Cooney et al. 1995}, ^{Mohamat-Yusuff et al. 2014}) y son consideradas como organismos potenciales para la biodegradación del TBT en sitios contaminados (^{Monteiro et al. 2021}).

La tolerancia de las bacterias al TBT está limitada a la capacidad de la especie porque se ha observado que el compuesto puede llegar a causar efectos negativos en ellas. Por ejemplo, ^{Dubey et al. (2006)} reportaron que la cepa bacteriana Pseudomonas aeruginosa 25W aislada del mar arábigo, es altamente resistente al TBT a una concentración de 50 μM, sin embargo, en concentraciones altas (500 μM) la bacteria presenta efectos transcripcionales, generando tensiones que darían lugar a una inhibición de la transcripción de genes involucrados en la traducción, post-traducción y degradación. Además, se ha reportado que especies de los géneros Alteromonas, Bacillus, Brevibacterium, Enterobacter, Kurthi, Pseudomonas, Pseudoalteromonas y Listeria tienen la capacidad de resistir una concentración de 3 mM, la más alta reportada de TBT para bacterias (^{Cruz et al. 2007}, ^{Monteiro et al. 2021}). Particularmente, se ha evidenciado que la mayoría de las bacterias tolerantes a compuestos organoestañosos son Gram negativas, posiblemente debido a que el grupo presenta mayor abundancia en ambientes marinos (^{Wuertz et al. 1991}, ^{Jude et al. 1996}, ^{Cruz et al. 2007}, ²⁰¹³).

El Puerto de Manzanillo se caracteriza por ser uno de los cuatro puertos más destacados en México y el más importante del litoral del Pacífico (^{ININVESTAM 2018}); registra un intenso tráfico marítimo por ser área de influencia para rutas nacionales e internacionales (^{ASIPONA 2018}). Debido a ello, el Puerto de Manzanillo es una zona potencial para la presencia de TBT y por consiguiente de bacterias con capacidad de tolerar tal contaminante. El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de tolerancia y la máxima concentración de tolerancia al TBT de las bacterias marinas heterótrofas aisladas del sedimento de la Bahía de Manzanillo, Colima, México. Los resultados aportarán información de línea base respecto a bacterias que toleran el TBT, las cuales podrían ser utilizadas para degradar el TBT en el Puerto de Manzanillo, como una estrategia de mitigación del contaminante y reducir los efectos dañinos en los ecosistemas marinos.

MATERIALES Y MÉTODOS

El área de estudio fue la Bahía de Manzanillo, Colima, México (19º03'08''N; 104º18'57''O), donde se seleccionaron tres sitios de muestro en función a la cercanía con el puerto: i) Carrizales está localizado al noroeste de la bahía y presenta el menor impacto antrópico al considerarse lugar de pesca tradicional y actividades turísticas, posee una cobertura de coral considerable con estructuras arrecifales con un espesor >3 m y extensión de 4 ha. (^{Chávez-Comparán y Macías- Zamora 2006}); ii) Punta Santiago se ubica en el centro de la bahía a seis kilómetros de la entrada al Puerto, la cual es un sitio impactado altamente por la pesca artesanal legal e ilegal, actividades turísticas, sedimentación generada por los aportes de la laguna de Juluapán y por contaminación de aguas residuales de la ciudad y del Puerto de Manzanillo; iii) La entrada al Puerto de Manzanillo es también un sitio impactado por aguas residuales, químicos y aceites de los barcos, así como por contaminantes que se encuentren en áreas de almacenaje (Fig. 1).

Fig. 1 Área de estudio y sitios de muestreo en la bahía de Manzanillo, Colima, México. 

Los muestreos se realizaron en los meses de julio del 2016 y enero del 2017. En cada sitio de muestreo se recolectaron muestras por triplicado de la capa superficial del sedimento a profundidades entre 5 a 10 m. La distancia entre las réplicas fue entre 5 a 8 m para garantizar su independencia. En este trabajo se consideró que la variación temporal no fue importante para la identificación de bacterias tolerantes al TBT, lo que permitió incrementar el número de réplicas.

Para obtener la mayor cantidad de aislados posibles en el laboratorio se realizaron dos técnicas de aislamiento bacteriano para cada réplica (o muestra): 1) Por agitación, donde cada muestra fue sometida a agitación constante en lapsos de un minuto con cuatro repeticiones por muestra. El líquido fue transferido a microtubos estériles de 1.5 mL. Posteriormente, las células fueron concentradas por centrifugación a 12 000 rpm durante dos minutos y el botón fue resuspendido en un 1 mL en agua de mar estéril. Después se realizaron diluciones seriales de 10^-3, 10^-4 y 10^-5 con agua de mar estéril para cada una de las muestras. Finalmente, se tomaron 100 μL de cada dilución y se sembraron por separado en medio Zobell marino. 2) Estampado en placa, donde una parte del sedimento fue transferida a una caja Petri estéril y con un algodón humedecido con agua de mar estéril se tomó sedimento de la placa y se estampó en otra caja de Petri con medio Zobell marino. El estampado se realizó varias veces en dirección de las manecillas del reloj a manera de dilución (^{Mincer et al. 2002}, ^{Becerril 2011}). En ambas técnicas, las bacterias fueron sembradas en medio Zobell marino: levadura (1 g), bactopeptona (5 g), cloruro férrico a 1 % (1 mL), agar (13 g), en 1 L de agua de mar filtrada a través de filtros de poro a 0.22 micras e incubadas de cinco a siete días a 28 ºC para favorecer el crecimiento bacteriano. Los aislados bacterianos obtenidos se criopreservaron en glicerol a 45 %.

RESULTADOS

Se obtuvo un total de 118 aislados bacterianos de los sedimentos de las tres localidades de Bahía de Manzanillo. Del total de aislados, 50 toleraron alguna concentración de TBT, 19 correspondieron a aislados del Puerto, 18 de Carrizales y 13 de Punta Santiago (Fig. 2a y 2b). De los 50 tolerantes al TBT se seleccionaron siete que presentaron la capacidad de crecer en las cinco concentraciones 420 μM, 820 μM, 1.26 mM, 2.5 mM, 3.75 mM, siendo esta última la concentración más alta para este trabajo. Los resultados del Andeva permutacional mostraron diferencias significativas en el número de aislados bacterianos resistentes al TBT en los factores de Sitio (Pseudo-F = 5.1949, p = 0.0335) y Concentración (Pseudo-F = 4.1653, p = 0.0394) con una explicación total del modelo del 66 %. Sin embargo, en las pruebas a posteriori no se encontraron diferencias significativas en ambos factores por el número bajo de permutaciones. De manera general, la concentración de 420 μM de TBT tuvo el mayor número de aislados tolerantes al TBT, mientras que las concentraciones de 2.5 mM y 3.75 mM tuvieron los valores más bajos (Fig. 2c). Cinco de estos aislados correspondieron a bacterias recolectadas del Puerto, una bacteria Pseudoalteromonas sp., dos de Vibrio alginolyticus y una correspondiente a V. toranzoniae y otro aislado P3MZ16.7. En cambio, las otras dos bacterias fueron aisladas de Carrizales, una fue Cobetia sp. y la otra Pseudoalteromonas sp. (Cuadro I).

Fig. 2 Bacterias tolerantes al tributilestaño (TBT). a) porcentajes de los aislados a diferentes concentraciones de TBT en los sitios de muestreo. b) y c) número de aislados bacterianos entre sitios y concentraciones de TBT, respectivamente. Se muestran los percentiles del 95 % y 5 % como barras de error, la caja representa los percentiles del 75 % y 25 %, y la mediana se muestra como una línea continua. 

DISCUSIÓN

La localidad del Puerto de Manzanillo es considerada, de manera indirecta, el sitio con el mayor grado de contaminación de TBT. Se sugiere que los puertos son fuentes de contaminación de compuestos de estaño debido a la alta actividad por el flujo de embarcaciones, tanto nacionales como internacionales, (^{Villegas et al. 2021}). Aunado a lo anterior, ^{Domínguez-Ojeda et al. (2015)}, demostraron una tendencia de aumento de los niveles de imposex (fenómeno causado por la presencia de compuestos organoestañosos) cerca a los puertos. Lo que indica que los puertos podrían estar siendo la fuente principal de contaminación de TBT.

Los sitios contaminados con TBT podrían actuar como un medio selectivo para bacterias resistentes a este agente (^{Wuertz et al. 1991}), caso que corroboramos en nuestro trabajo, donde el modelo indica diferencias entre el número de bacterias tolerantes entre los sitios. En el caso de la localidad Puerto se encontró un mayor número de bacterias tolerantes, algunas con la capacidad de resistir todas las concentraciones hasta 375 mM. Carrizales, el sitio más alejado del Puerto, también registró un número considerable de aislados tolerantes al contaminante. Caso contrario de la localidad de Punta Santiago, que registró el menor número de bacterias y ninguna de ellas con la capacidad de resistir las cinco concentraciones de TBT (Fig. 2b). Esto podría deberse a que este último tiene la menor concentración de este agente tóxico, a pesar de su cercanía al Puerto. La dinámica de las corrientes marinas en la Bahía de Manzanillo se caracteriza por dirigirse hacia el exterior de la Bahía de Santiago a través de Punta Juluapan para luego dirigirse al sureste, rumbo a Punta Campos (^{Lancin y Carranza 1976}), es decir, hacía el exterior de la Bahía de Manzanillo, lo que permite que los sedimentos no se acumulen en la Bahía de Santiago. Aunado a ello, ^{Ahumada-Martínez et al. (2018)} reportaron la presencia de moluscos con tumores debido a la presencia de monobutilestaño (MBT) en zonas cercanas al puerto de Manzanillo, siendo Carrizales una de ellas. Lo anterior explicaría porque encontramos la menor cantidad de aislados tolerantes a TBT en Punta Santiago a diferencia de las localidades como el Puerto y Carrizales.

La concentración máxima tolerante para algunas de las bacterias al TBT en este trabajo fue de 3.75 mM, un valor similar a lo reportado por ^{Cruz et al. (2007)}, quienes encontraron 16 bacterias capaces de resistir una concentración de 3 mM, la mayoría de ellas aisladas del sedimento marino, y en menor proporción, de agua de mar. De igual forma, ^{Monteiro et al. (2021)} reportaron 157 aislados bacterianos tolerantes a 3 mM y dos con la capacidad de tolerar hasta 6 mM de TBT. Lo anterior hace evidente que las bacterias presentes de forma natural en los puertos pueden tolerar el TBT a niveles elevados y transformarlo en compuestos menos tóxicos, lo que contribuye a la restauración del ecosistema.

Las bacterias identificadas en este trabajo por su capacidad de tolerancia a cinco de las siete concentraciones de TBT, pertenecen a los géneros Cobetia, Pseudoalteromonas y Vibrio. El género Pseudoalteromonas ha sido reportado por presentar capacidad de resistencia a compuestos organoestañosos. ^{Mimura et al. (2008)} observaron en cultivos de medio liquido con cloruro de tributilestaño (TBT-Cl), moléculas de TBT absorbidas por las células bacterianas Pseudoalteromonas sp. en una concentración mayor a 10 µM. De igual forma ocurre para el género Vibrio, ^{Fukagawa et al. (1992)} reportaron la tolerancia de la bacteria Vibrio M-1, aislada de agua de mar, a una concentración de 125 µM de TBT-Cl; además, en cultivos en medio liquido con la misma concentración de TBT-Cl, esta bacteria evidenció su capacidad de degradar el TBT-Cl, al encontrar menor porcentaje del contaminante en los bioensayos realizados. A diferencia de la concentración de TBT antes mencionada, en este trabajo Pseudoalteromonas y Vibrio son capaces de resistir hasta 3.75 mM de TBT. En el caso de Cobetia, no se tienen registros de este grupo con relación a compuestos de estaño. Sin embargo, ^{Villela et al. (2023)} resaltaron la importancia de grupos bacterianos en la biorremediación de sitios contaminados por hidrocarburos, entre ellos Cobetia sp.

La capacidad que desarrollaron estás bacterias al tolerar la presencia de compuestos organoestañosos, las convierte en un recurso importante como indicadoras o incluso como potenciales biorremediadoras de sitios contaminados, ya que es muy probable que tengan la capacidad de degradar el compuesto a metabolitos menos tóxicos y así disminuir las concentraciones del compuesto en las áreas naturales. A pesar de que en la literatura no se tienen reportes de la degradación de compuestos organoestañosos por parte de los géneros Cobetia y Pseudoalteromonas, podría ser el caso de nuevas bacterias con un papel relevante en la biodegradación. Por ello es importante continuar con los estudios e incrementar el conocimiento sobre bacterias degradadoras del TBT, con la finalidad de crear estrategias de eliminación de sustancias químicas y tóxicas del ambiente marino.

CONCLUSIÓN

Los puertos marítimos son lugares tradicionalmente contaminados y, por consiguiente, son medios selectivos para bacterias con mecanismos desarrollados para la tolerancia y degradación de compuestos tóxicos. En este trabajo encontramos bacterias con la capacidad de tolerar diferentes concentraciones de TBT, siendo la más alta de 3.75 mM, destacando los géneros Cobetia, Pseudoalteromonas y Vibrio. Cabe mencionar que este trabajo representa uno de los primeros acercamientos respecto al conocimiento de bacterias tolerantes al TBT en México. A pesar de la prohibición del TBT hace 15 años, la persistencia del contaminante y de subproductos del mismo, siguen siendo motivo de preocupación. Es necesario seguir con los estudios para las bacterias que demostraron capacidad de tolerancia al TBT y evaluar su posible potencial de utilizar el compuesto como fuente de carbono, y así confirmar su capacidad para su uso en biorremediación ambiental para las zonas contaminadas.