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Introducción
El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) ha sido fundamental en la dieta mesoamericana desde tiempos prehispánicos. En México es el segundo producto agrícola por superficie cultivada y número de agricultores, con gran impacto social y económico debido a su bajo costo y alto valor nutricional (Ramírez-Jaramillo et al., 2023; Romero-Arenas et al., 2013).
Phaseolus vulgaris L. se caracteriza por un alto contenido de proteínas y grasas, bajo nivel de carbohidratos, presencia de aminoácidos como triptófano y arginina, además de taninos y antocianinas (Alcázar-Valle et al., 2021). Sus beneficios se manifiestan en los sistemas circulatorio, inmunológico y digestivo, así como prevención de diabetes mellitus, síndrome metabólico y diversos tipos de cáncer (Alcázar-Valle et al., 2021; Fonseca et al., 2023).
El cultivo enfrenta retos por el cambio climático, poniendo en riesgo la seguridad alimentaria; la sensibilidad al calor afecta procesos como el transporte de carbohidratos (Soltani et al., 2019) y la disminución de riego reduce el rendimiento (Tapia et al., 2022).
Las leguminosas representan un desafío importante para establecerlas en condiciones de cultivo in vitro debido a factores como el necrosamiento en los tejidos, acumulación de fenoles, baja regeneración y pérdida de plantas en la aclimatación (recalcitrancia); además, la dependencia del genotipo limita la aplicabilidad de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro(Gatti et al., 2016). Esta tecnología contribuye a optimizar la calidad y garantizar la sostenibilidad en la producción agrícola; en un programa de mejoramiento genético resulta especialmente útil, al aumentar la velocidad de propagación de materiales valiosos, rescatando embriones e incorporando características deseables, aunque aún enfrenta retos técnicos y logísticos que deben ser superados (Abbas et al., 2021). Estudios recientes han demostrado que la adición de citocininas, como TDZ, es esencial para la inducción de yemas múltiples en ciertas variedades de P. vulgaris. A pesar de estos avances, la regeneración de plantas vía organogénesis directa sigue siendo un proceso complejo y variedad-dependiente (Gatti et al., 2016). Por lo anterior, la finalidad de esta investigación fue evaluar la germinación y la organogénesis in vitro de tres variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) Flor de Mayo, Negro Jamapa y Peruano, desde el establecimiento del cultivo aséptico hasta el alargamiento de brotes.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se utilizaron semillas del ciclo otoño 2024 de P. vulgaris L., variedades Negro Jamapa, Flor de Mayo y Peruano, proporcionadas por el Programa de Mejoramiento Genético de Frijol del PREGEP-Genética del Colegio de Postgraduados.
Medio de cultivo y condiciones de incubación
Se empleó el medio básico MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con sacarosa (30 g L-1) y solidificado con agar (Sigma-Aldrich®, 7.0 g L-1). El pH se ajustó a 5.7, y se esterilizó en autoclave horizontal (AESA® 300, México) a 121 °C y 1.5 kg cm-² de presión durante 20 min. Los frascos de vidrio se incubaron en fotoperiodo de 16/8 h luz/oscuridad, con lámparas LED de luz blanca fría y minisplit (Carrier) que mantuvo una temperatura de 25 ± 1 °C y humedad relativa de 40 %.
Establecimiento del cultivo aséptico: germinación in vitro
Efecto de diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio
Se evaluaron concentraciones de hipoclorito de sodio comercial (NaOCl, Cloralex®) (20 y 30 %) en la germinación in vitro de tres variedades de P. vulgaris. Las semillas se desinfectaron y se sembraron en frascos de vidrio de 250 mL con 30 mL de medio de cultivo MS. Se registró germinación (%) y contaminación por bacterias y hongos (%). El diseño experimental fue completamente al azar con 12 repeticiones. El análisis de los datos fue con la prueba de Whitney U.
Efecto de diferentes concentraciones y tiempos de inmersión de peróxido de hidrógeno
Las semillas de las tres variedades de frijol se colocaron en peróxido de hidrógeno (H2O2 30 %, Merck®) 0, 1 y 3 % v/v durante 0, 0.5, 1, 2 y 4 h; posteriormente, se sembraron en frascos de vidrio de 250 mL con 30 mL de medio de cultivo MS. Se midió germinación (%) y etapas fenológicas (Pinzón-Sandoval et al., 2024). Se utilizó un diseño completamente al azar con 15 repeticiones. El análisis estadístico se hizo con la prueba de Kruskal-Wallis (etapas fenológicas) y Whitney U (germinación).
Organogénesis directa
Inducción de brotes
Se extrajeron nudos cotiledonares, ejes cotiledonares, eje embrionario y cotiledones. Los explantes se cultivaron en medios básicos de MS y B5 (Gamborg et al. 1968), ambos adicionados con 72 µM de 6-benciladenina (BA). Los explantes se sembraron en frascos de vidrio de 45 mL con 10 mL de medio. El diseño experimental fue en bloques al azar generalizado (DEBAG) con cuatro bloques y dos tratamientos con 15 repeticiones. El análisis estadístico se efectuó con la prueba de Kruskal-Wallis. Las variables cuantificadas fueron número de brotes por explante (NBE) y necrosamiento del tejido (%).
Además, se evaluó, el efecto de 6-benciladenina (54, 72 y 90 µM) y tidiazurón (54, 72 y 90 µM) en la inducción de brotes de las tres variedades de Phaseolus vulgaris L. Se sembraron como explantes ejes y nudo cotiledonares en frascos de 45 mL con 10 mL de medio básico MS. Se empleó un diseño experimental DEBAG con dos bloques y seis tratamientos con 10 repeticiones. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza y la prueba de Tukey. Las variables cuantificadas fueron número de brotes por explante (NBE) y necrosamiento del tejido (%).
Multiplicación de brotes
Se sembraron como explantes ejes y nudos cotiledonares en medio MS adicionado con 6-benciladenina (54, 72 y 90 µM) y tidiazurón (54, 72 y 90 µM). Se cuantificó NBE, tamaño de brote (cm) y necrosamiento del tejido (%). Se empleó un DEBAG con 10 repeticiones. Los datos se examinaron mediante análisis de varianza y la prueba de Tukey. Se aplicó transformación raíz cuadrada a los datos de la cantidad de brotes.
Alargamiento de brotes
Se evaluó el efecto de sales inorgánicas del medio MS (50 y 100 %) y dosis de AG3 (0.0, 1.4, 2.8, 4.2, 5.6 y 7.0 µM). Se sembraron racimos de cinco a siete brotes como explantes en frascos de vidrio de 100 mL con 20 mL de medio MS. Se evaluó el tamaño de brote (cm) y necrosamiento del tejido (%). El diseño experimental fue completamente al azar con 12 tratamientos y dos factores. Los datos se analiaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis.
Resultados y discusión
Germinación in vitro
Efecto de diferentes concentraciones hipoclorito de sodio
El NaOCl comercial ha sido ampliamente utilizado en procesos de desinfección de semillas en cultivo in vitro; sin embargo, en trabajos como el de Salazar-Mercado et al. (2019) se reporta que es citotóxico en Pisum sativum, reduciendo crecimiento radicular e inhibiendo mitosis (> 50 %). Las concentraciones del 10 y 20 % de NaOCl no afectaron significativamente la germinación ni el desarrollo de plántulas, manteniendo la contaminación por debajo del 5 % en las variedades Negro Jamapa y Peruano, aunque se observó una alta incidencia de patógenos fúngicos en la variedad Flor de Mayo. Haliloğlu et al. (2023) reportaron el uso de hipoclorito de sodio en el proceso de desinfección efectiva de semillas de P. vulgaris utilizándolo durante 35 min al 1 % (lejía comercial 20 %)
Las concentraciones de NaClO para controlar la presencia de organismos nocivos como hongos y bacterias en esta investigación difieren entre variedades, esto concuerda con Aguilar-Rito et al. (2024), quienes en agave hallaron diferencias significativas entre especies ante el proceso de desinfección, indicando que la respuesta depende de factores genéticos y del tiempo de exposición.
Efecto de diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno y tiempos de inmersión
Los resultados mostraron que para la variedad Flor de Mayo (p = 0.06), Negro Jamapa (p = 0.12) y Peruano (p = 0.45) no hay una diferencia significativa en el crecimiento de las plantas entre las diferentes concentraciones del H2O2.
Al evaluar el efecto del tiempo de inmersión del H2O2 en el desarrollo de plántulas de Phaseolus vulgaris L. se determinó que la variedad Peruano mostró diferencias significativas (p = 0.0001859), lo cual fue confirmado por medio de la prueba de Tukey, que reveló que los tratamientos de 0 y 0.5 h de inmersión en H2O2 tienen valores significativamente más altos que el tratamiento de 4 h de inmersión en H2O2, lo que sugiere que inmersiones más prolongadas pueden desfavorecer el desarrollo de las plántulas.
Las interacciones entre el tiempo de inmersión y la concentración de H2O2 mostraron diferencias significativas para las variedades Flor de Mayo y Peruano, sugiriendo que entre 1 y 2 h de inmersión a 3 % de H2O2 el desarrollo fenológico de las variedades disminuye.
Un uso importante del H2O2 en el proceso de germinación es su implementación como agente escarificante, lo cual favorece el proceso de germinación, como es el caso de Acacia angustissima (Mill.) (Rincón-Rosales et al., 2003). Inmersiones prolongadas en H2O2 pueden limitar el desarrollo de las plántulas debido a la baja difusión de oxígeno, activando vías metabólicas anaeróbicas que producen menos ATP y generan compuestos que pueden oscurecer los tejidos (Veiga et al., 2024) hecho que puede traer como consecuencia que al realizar inmersiones prolongadas disminuya la germinación.
Organogénesis directa
Inducción de brotes
En la variedad Flor de Mayo (Figura 1) no hubo diferencias significativas en inducción de brotes entre medios de cultivo (p = 0.19, Cuadro 1), pero sí entre tipos de explante (p ≤ 0.05). El necrosamiento fue significativo entre medios de cultivo (p = 0.04) y tipos de explantes (p ≤ 0.05), siendo mayor en MS y cotiledón.
Figura 1 Inducción de brotes de tres variedades de Phaseolus vulgaris L. con 72 μM de 6-benciladenina. A) cotiledón de la variedad Flor de Mayo cultivado en medio B5, B) cotiledón de la variedad Flor de Mayo cultivado en medio MS, C) eje cotiledonar de la variedad Negro Jamapa cultivado en medio B5, D) eje cotiledonar de la variedad Negro Jamapa cultivado en medio MS, E) nudo cotiledonar de la variedad Peruano cultivado en medio B5, F) nudo cotiledonar de la variedad Peruano cultivado en medio MS, G) eje embrionario de la variedad Flor de Mayo cultivado en medio B5, H) eje cotiledonar de la variedad Negro Jamapa cultivado en medio MS, a las tres semanas de cultivo in vitro.
Cuadro 1 Evaluación del efecto de los medios de cultivo de 5 y de Murashige y Skoog (1962, MS) en la inducción y necrosamiento de brotes en tres variedades de Phaseolus vulgaris L. a las tres semanas de cultivo in vitro.
| Medio de cultivo | Brotes (Núm.) | Necrosamiento de brotes (%) |
| Variedad: Flor de Mayo | ||
| B5 | 1.68 a | 29.78 a |
| MS | 1.03 a | 44.57 b |
| Variedad: Negro Jamapa | ||
| B5 | 1.39 a | 47.75 a |
| MS | 0.44 b | 34.14 a |
| Variedad: Peruano | ||
| B5 | 1.36 b | 38.17 a |
| MS | 2.98 a | 27.74 b |
Medias con la misma letra en las columnas son estadísticamente iguales (Tukey, p ≤ 0.05).
En la variedad Negro Jamapa el necrosamiento no varió de manera significativa entre medios (p = 0.25), pero sí la generación de brotes (p = 0.01), siendo el medio B5 el más efectivo (Cuadro 1). El necrosamiento presentó diferencias significativas entre los tipos de explante (p ≤ 0.05) con los valores más altos en cotiledón (98.41 %) y nudo cotiledonar (67.38 %).
En la variedad Peruano para los tipos de medios hubo diferencias significativas en inducción de brotes (p = 0.02) y necrosamiento (p = 0.02), con la inducción de brotes más alta en el medio MS y la menor cantidad de necrosamiento en el medio B5. El eje cotiledonar y el nudo cotiledonar presentaron el porcentaje de necrosamiento más bajo.
La mayor cantidad de brotes se presentó en el eje cotiledonar y el nudo cotiledonar para las tres variedades (Cuadro 2).
Cuadro 2 Evaluación del efecto del tipo de explante en la inducción y necrosamiento de brotes en tres variedades de Phaseolus vulgaris L. a tres semanas de cultivo in vitro.
| Tipo de explante | Brotes (Núm.) | Necrosamiento de brotes (%) |
| Variedad Flor de Mayo | ||
| Cotiledón | 0.03 b | 89.17 b |
| Eje cotiledonar | 2.95 a | 12.40 a |
| Eje embrionario | 0.00 b | 18.48 a |
| Nudo cotiledonar | 3.67 a | 6.83 a |
| Variedad Negro Jamapa | ||
| Cotiledón | 0.00 b | 98.42 b |
| Eje cotiledonar | 1.35 a | 7.71 a |
| Eje embrionario | 0.00 b | 8.83 a |
| Nudo cotiledonar | 1.78 a | 67.39 b |
| Variedad Peruano | ||
| Cotiledón | 0.84 b | 40.32 b |
| Eje cotiledonar | 4.19 a | 37.21 a |
| Eje embrionario | 0.00 b | 33.86 b |
| Nudo cotiledonar | 3.84 ab | 18.00 a |
Medias con la misma letra en las columnas son estadísticamente iguales (Tukey, p ≤ 0.05).
En las tres variedades, ni las concentraciones de BA y TDZ ni su interacción con los tipos de explante afectaron significativamente la inducción de brotes. Flor de Mayo y Negro Jamapa presentaron mayor inducción de brotes en los ejes cotiledonares; en la variedad Peruano no se presentó diferencia significativa. Por otro lado, para las tres variedades el menor necrosamiento se registró en el eje cotiledonar (Cuadro 3).
Cuadro 3 Efecto del tipo de explante en inducción y necrosamiento de brotes en tres variedades de Phaseolus vulgaris L. a las tres semanas de cultivo in vitro.
| Explante | Brotes (Núm.) | Necrosamiento de brotes (%) |
| Variedad Flor de Mayo | ||
| Eje cotiledonar | 14.86 a | 12.61 a |
| Nudo cotiledonar | 8.04 b | 21.61 b |
| Variedad Negro Jamapa | ||
| Eje cotiledonar | 3.31 a | 13.42 a |
| Nudo cotiledonar | 2.26 b | 24.57 b |
| Variedad Peruano | ||
| Eje cotiledonar | 12.09 a | 12.02 a |
| Nudo cotiledonar | 11.52 a | 15.12 b |
Medias con la misma letra en las columnas no son significativamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.5).
Los resultados indican que la inducción de brotes no fue significativa cuando se utilizaron cotiledones como explantes, lo cual difiere de lo reportado en otras especies cercanas como voandzou (Vigna subterranea) (Koné et al., 2013), la diferencia con respecto a estos autores puede atribuirse a que en su investigación reportan resultados de organogénesis indirecta. Estos hallazgos pueden estar relacionados con la variabilidad genética y la respuesta diferencial a los reguladores de crecimiento vegetal en los diferentes tipos de explante, como se ha observado en estudios con otras especies vegetales (Song et al., 2021).
Multiplicación de brotes
En Flor de Mayo no hubo diferencias significativas en número de brotes entre tipos de explantes (p > 0.05, Cuadro 4), pero sí en longitud, siendo mayor en el eje cotiledonar (0.36 cm). En Negro Jamapa y Peruano se presentó diferencia significativa entre explantes, con el eje cotiledonar con mayor cantidad de brotes y de mayor tamaño.
Cuadro 4 Efecto del tipo de explante de tres variedades de Phaseolus vulgaris L. en la multiplicación y longitud de brotes a las tres semanas de cultivo in vitro.
| Explante | Brotes (Núm.) | Longitud de brotes (cm) |
| Variedad Flor de Mayo | ||
| Eje cotiledonar | 20.20 a | 0.36 a |
| Nudo cotiledonar | 19.64 a | 0.19 b |
| Variedad Negro Jamapa | ||
| Eje cotiledonar | 3.63 a | 0.38 a |
| Nudo cotiledonar | 1.78 b | 0.28 b |
| Variedad Peruano | ||
| Eje cotiledonar | 20.20 a | 0.51 a |
| Nudo cotiledonar | 15.27 b | 0.35 b |
Medias con la misma letra en las columnas en las columnas no son significativamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.5).
En las variedades estudiadas BA y TDZ no presentaron diferencias significativas en el número de brotes, pero en Peruano BA aumentó la longitud de los brotes.
En la variedad Flor de Mayo no hubo diferencias significativas en número de brotes (p > 0.05), aunque el valor más alto se presentó en eje cotiledonar + 72 µM TDZ. La mayor longitud se observó con BA 54 µM y TDZ 90 µM en eje cotiledonar, y BA 90 µM en nudo cotiledonar (Cuadro 5).
Cuadro 5 Efecto de la interacción entre tipo de explante y 6-benciladenina (BA) o tidiazurón (TDZ) en la multiplicación y longitud de brotes de Phaseolus vulgaris L. variedad Flor de Mayo a las tres semanas de cultivo in vitro.
| Tipo de explante | BA | TDZ | Brotes (Núm.) | Longitud de brote (cm) |
| (µM) | ||||
| Eje cotiledonar | 54 | - | 20.89 a | 0.42 a |
| 72 | - | 20.29 a | 0.31 abc | |
| 90 | - | 19.14 a | 0.33 abc | |
| - | 54 | 20.00 a | 0.29 abc | |
| - | 72 | 23.14 a | 0.37 ab | |
| - | 90 | 17.88 a | 0.40 a | |
| Nudo cotiledonar | 54 | - | 22.14 a | 0.23 abc |
| 72 | - | 22.33 a | 0.16 bc | |
| 90 | - | 14.60 a | 0.46 a | |
| - | 54 | 16.56 a | 0.13 bc | |
| - | 72 | 19.80 a | 0.12 c | |
| - | 90 | 21.00 a | 0.19 abc | |
Medias con la misma letra en las columnas no son significativamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.5).
La variedad Peruano presento valores significativos que concordaron con lo reportado por Kwapata et al. (2010), quienes mencionaron que el medio más eficiente tuvo 2.5 mg L-1 BA, generando 20 brotes en promedio por explantes, mientras que el de 2.5 mg L-1 TDZ proporcionó una respuesta significativamente menor. Estos resultados también coinciden con los de Zarinjoei et al. (2014), quienes describieron que para la multiplicación de brotes de Gleditsia caspica, el tratamiento más efectivo consistió en un medio MS suplementado con BA 4.4 μM.
Se observó que tanto el tipo de explante como la concentración de los reguladores de crecimiento influyeron significativamente en la longitud de los brotes. Estos resultados se asemejan con los de Oros et al. (2024), quienes en Passiflora evaluaron cuatro tipos de explantes (segmento internodal, fragmento foliar, sépalos y receptáculo floral) con distintas combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal 2,4-D (2 mg L-1 ), BA (0.5 y 1 mg L-1 ) y Kin (0.5 y 1 mg L-1).
Alargamiento de brotes
En Flor de Mayo no hubo diferencias significativas en longitud de brotes entre concentraciones de sales MS, pero sí en necrosamiento (p = 0.04), siendo menor con 100 % de sales inorganicas (28.87 %) (Cuadro 6).
Cuadro 6 Efecto de la concentración de sales inorgánicas del medio de Murashige y Skoog (1962) en el alargamiento y necrosamiento de brotes en tres variedades de Phaseolus vulgaris L. a las tres semanas de cultivo in vitro.
| Medio MS (Sales inorgánicas, %) | Longitud de brotes (cm) | Necrosamiento de brotes (%) |
| Variedad Flor de Mayo | ||
| 50 | 0.28 a | 32.06 b |
| 100 | 0.29 a | 28.87 a |
| Variedad Negro Jamapa | ||
| 50 | 0.26 b | 59.53 b |
| 100 | 0.46 a | 39.44 a |
| Variedad Peruano | ||
| 50 | 0.34 b | 45.18 a |
| 100 | 0.47 a | 40.95 a |
Medias con la misma letra en las columnas no son significativamente diferentes (Tukey, P ≤ 0.5).
En Negro Jamapa las concentraciones de sales inorgánicas MS influyeron en la longitud promedio de brotes (p ≤ 0.05), siendo mayor con 100 % de sales minerales (0.46 cm). El necrosamiento no fue significativo (Cuadro 6).
En la variedad Peruano las concentraciones de sales inorgánicas MS afectaron significativamente la longitud de brotes (p = 0.03), siendo mayor el 100 % de sales MS, con una longitud promedio de 0.43 cm. El necrosamiento no fue significativo (Cuadro 6).
Los resultados obtenidos en esta investigación coinciden con los de Varisai et al. (2006) y Zarinjoei et al. (2014), los cuales utilizaron una concentración de sales del 100 % en el alargamiento de brotes de P. vulgaris L.
Conclusiones
La desinfección y cultivo in vitro de semillas de Phaseolus vulgaris L. reveló que el hipoclorito de sodio (NaOCl) es un agente efectivo para la desinfección, con concentraciones óptimas de 30 % en la variedad Flor de Mayo y 20 % en Negro Jamapa y Peruano. El uso de peróxido de hidrógeno (H2O2) no aportó beneficios en la germinación bajo las condiciones evaluadas. Se constató que la viabilidad de las semillas de las tres variedades permaneció alta en cultivo in vitro, mostrando un desarrollo exitoso en el medio Murashige y Skoog (MS), tanto al 50 como al 100 % de concentración de sales inorgánicas; además, estas variedades evidenciaron una significativa capacidad morfogénica para organogénesis directa en explantes de nudo cotiledonar y eje cotiledonar. La respuesta a reguladores de crecimiento vegetal como 6-benciladenina (BA), tidiazurón (TDZ) y BA combinado con ácido 1-naftalenacético (ANA) fue similar en todas ellas. La concentración de 4.2 µM de ácido giberélico (AG3) propició el mayor alargamiento de brotes, aunque su eficacia varió entre las variedades. Asimismo, el medio MS al 100 % favoreció un crecimiento mayor de los brotes y redujo el necrosamiento en comparación con el medio al 50 %. En términos morfogénicos, Flor de Mayo y Peruano demostraron mejor rendimiento en la inducción, multiplicación y elongación de brotes que Negro Jamapa. Finalmente, se evidenció la recalcitrancia de P. vulgaris L., y las diferencias significativas entre las variedades en condiciones in vitro sugieren la necesidad de desarrollar protocolos específicos para cada una de ellas.
