Introducción

El trigo harinero (Triticum aestivum L.) es el alimento más consumido en el mundo, alcanzando récord de producción mundial en 2024 con 794 millones de toneladas ^{(FAO, 2024)}. Con esta creciente demanda, constantemente se están buscando nuevas tecnologías para aumentar su producción.

El trigo presenta amplia adaptabilidad debido a su gran diversidad genética al ser una especie alohexaploide, compuesta por 21 pares de cromosomas organizados en tres subgenomas: A, B y D, y expresados en forma diploide como 2n=6x=42 debido a la presencia de varios genes de apareamiento homologo ^{(Sears, 1952)}. El trigo se originó en el Medio Oriente y fue evolucionando a través de varios cruzamientos naturales entre especies silvestres relacionadas. Este camino evolutivo se ha replicado en distintas formas ^{(Villaseñor-Mir, 2015)}, convirtiéndose en una de las vías más exitosas de mejoramiento para la obtención de líneas y variedades con mayor producción y resistencia a enfermedades ^{(Mohamed et al., 2014)}.

Casos de éxito de introgresión genética se han presentado con varias especies de Aegilops para aumentar la capacidad del tolerar el estrés por sequía ^{(Baalbaki et al., 2006}; ^{Zaharieva et al., 2001)} y altas temperaturas ^{(Pradhan et al., 2011)}. Ae. cilindrica (DC), Ae. caudata (C) y T. boeoticum (Ab) poseen tolerancia al estrés por salinidad ^{(Ahmadi et al., 2018)}.

En otros campos de la agronomía, tales como el mejoramiento para el uso eficiente de nitrógeno, destacan las especies de Thinopyrum y Secale. Aquí, varios anfiploides mostraron mejor adaptación en cuanto a rendimiento y biomasa en condiciones de bajo contenido de N con respecto al trigo harinero ^{(Nehe et al., 2022)}.

Otros parientes silvestres más lejanos del trigo, particularmente del género Leymus, parecen ser una fuente de genes que determinan otros caracteres agronómicos de importancia económica, tal es el caso de la especie Leymus racemosus, NsNsXmXm, ^{(Fan et al., 2009)} tolerante a la sal y la sequía ^{(McGuire y Dvorak, 1981)} y resistente a diversas enfermedades ^{(Mujeeb-Kazi, 1983)}. Se ha encontrado además que esta especie produce un exudado radical relacionado con la inhibición biológica de la nitrificación en el suelo ^{(Subbarao et al., 2021)}.

La introgresión de caracteres de especies silvestres al trigo cultivado se realiza mediante la creación de anfiploides; primero, incorporando todo el genoma de la especie silvestre para después obtener líneas de adición o inhibición del apareamiento incorporando cromosomas completos o segmentos de cromosoma denominados translocaciones ^{(Qi et al., 1997)}, que con frecuencia acarrean efectos negativos o deletéreos. Las translocaciones se han utilizado como herramienta para añadir al genoma, en forma piramidal, genes o grupos de genes a la especie a mejorar, procedimiento que en trigo ha permitido formar variedades con buenas características agronómicas en ambientes donde se cutiva con factores limitantes bióticos y abióticos.

Debido a la importancia de las especies silvestres y parientes del trigo como fuentes de variabilidad genética, en este caso de Leymus racemosus, los objetivos del presente estudio fueron introgresar y caracterizar, en líneas de trigo harinero, la translocación de L. racemosus mediante técnicas citogenéticas y marcadores moleculares y determinar el efecto de dicha translocación sobre la resistencia a la roya de la hoja en comparación con el progenitor recurrente Borlaug 100.

Materiales y métodos

Resultados

Los estudios citológicos, con base en el cariotipo de bandeo cromosómico e hibridación fluorescente in situ del genoma, indicaron que todas las líneas CSMONO5B/ TA7646//*8 BORL100 tienen la translocación con doble terminal, ubicada en el brazo largo del cromosoma 5B, y su origen es el brazo corto del cromosoma 5#LrI de Leymus racemosus denominada T5Lr#1L.5BL (Figura 1).

Figura 1 Preparaciones GISH de trigo-Leymus de cromosomas en metafase y presencia de la translocación en el cromosoma largo 5B de trigo y el brazo corto de Leymus racemosus 5#Lr. A: fluorescencia con DAPI color azul, FITC color verde para el genoma B y rodamina color anaranjado, B: fluorescencia con rodamina color anaranjado, C: fluorescencia con DAPI color azul, FITC color verde y rodamina color anaranjado, D: fluorescencia con rodamina, color rojo y FITC color verde. 

Caracterización por PCR específico de alelo competitivo por Sistema KASP™

Una vez completadas las reacciones KASP, los datos mostraron que con FAM (alelos positivos) y VIC (alelos negativos), ejes X y Y, respectivamente (Figura 2), una muestra que es homocigota para el alelo informado por FAM (azul) durante la reacción KASP se trazó cerca del eje X con una señal alta y ninguna señal VIC (rojo) y una muestra que es homocigota para el alelo informado por VIC solo generó fluorescencia VIC y los puntos se trazaron cerca al eje Y. Una muestra que es heterocigota (HET) presentó tanto el alelo reportado por FAM como el alelo reportado por VIC. La muestra generó la mitad de fluorescencia FAM y la mitad de fluorescencia VIC, lo que indica que las muestras son homocigotas para estos alelos. Los puntos de los datos se ubicaron en el centro de la trama representando mitad señal FAM y mitad señal VIC (datos verdes: Figura 2). Los marcadores que se probaron en este estudio fueron: IWA5537 (AE), S5B_47584429, BS00020412, wsnp_Ex_c5915_10378807, Jagger_ c505_141, Kukri_c45713_151, 278795963, 278797263, TaGSNE-SNPS1-59, TaGSNE-SNPS2-3889, AX-94539975, Kachu1075 y 5BL-SNP2; de éstos, los que mostraron presencia de la translocación en el cromosoma 5B de las líneas fueron wsnp_Ex_c5915_10378807, 278795963 y 278797263.

Figura 2 Resultados de fluorescencia KASP Marcador wsnp_Ex_c591510378807. 

Se observan líneas con la presencia de fluorescencia agrupadas en el lado de las abscisas (X) del plano de color rojo (Figura 2), demostrando que, efectivamente, contienen la translocación, y del lado de las ordenadas (Y) se observan las líneas que no presentan la translocación en este cromosoma (color azul).

Discusión

El proceso de incorporación de segmentos cromosómicos de Leymus racemosus, una especie silvestre muy distante del género Triticum, al trigo harinero fue exitoso; en este sentido, las técnicas citogenéticas que se sugieren en primera instancia para generar anfiploides con líneas monosómicas aseguran tal resultado. Este camino de producción de híbridos F₁ intergenéricos con introgresión cromosómica trigo-pariente silvestre ha sido usado de manera recurrente para mejorar cualidades del trigo harinero, que de origen está presente en el pariente silvestre; se pueden citar casos de éxito; por ejemplo, la tolerancia a estreses causados por la sequía, la salinidad del suelo y las enfermedades, entre otros ^{(Edet et al., 2018)}. Por otro lado, la formación de líneas de adición monosómicas o disómicas para generar anfiploides permite valorar el efecto de los segmentos de cromosomas provenientes de especies silvestres; tal metodología fue utilizada por ^{Mohamed et al. (2014)}, quienes examinaron 12 cromosomas con adiciones de la cruza Triticum-L. racemosus y dos líneas con sustitución para tolerancia al estrés térmico. Una vez aseguradas y confirmadas las líneas de adición, el siguiente paso fue obtener translocaciones, cruzando, como en este estudio, con líneas monosómicas. En este caso, para producir la translocación, se cruzó una línea de adición disómica de Leymus, la TA7646 ^{(Qi et al., 1977)} con la línea monosómica Chinese Spring mono 5B (2n-1=41); de esta manera, la translocación se provocó al recombinarse con el cromosoma 5B del trigo. Con un procedimiento similar, se pudo lograr que el gen que confiere resistencia a la fusariosis de la espiga, Fhb3, que se derivó de Leymus racemosus, se transfiriera al trigo, como la translocación T7AL.7Lr#1S ^{(Qi et al., 2008)}. Otro ejemplo de éxito fue la translocación de L. racemosus a la línea de trigo NAU614, que confiere tolerancia a la sequía, seleccionada de la M₃ de la cruza Mianyang11/DA5Lr#1, con 2n=42 cromosomas ^{(Chen et al., 2005)}; esta translocación fue designada como T6BL.6BS-5LR#1L. En la presente investigación, al realizar la cruza con la línea monosómica Chinese Spring mono 5B (2n-1=41), a la que le falta el cromosoma 5B, con la misma fuente de Leymus -T. aestivum DA5L#1, la translocación se ubicó en el brazo largo del cromosoma 5B, tal translocación lograda se designó como: T5BS.5BL-5LR#1L. Es posible que el segmento del cromosoma de L. racemosus (5Lr#1) sea el mismo que en los ejemplos anteriores, pero ubicado ahora, en el brazo largo del cromosoma 5B.

El desarrollo de las líneas CSMONO5B/ TA7646/ /8*BORL100 con presencia de 5Lr#1 de Leymus, fue por siete retrocruzas hacia el progenitor recurrente Borlaug 100; aquí, fue necesario verificar en los segregantes de cada F₁ la presencia de la translocación. Debido a lo laborioso que resulta la identificación citológica de plantas segregantes positivas a la translocación en cada retrocruza, en esta investigación, se propuso facilitar el proceso de identificación, optando por el uso de un marcador molecular asociado con la translocación. Estudios previos han indicado asociación de la translocación T5AS/5LrL con los marcadores PCR: BE591127, BQ168298 y BE591737 ^{(Wang y Zhang, 2019)}. Otros marcadores sugeridos utilizando PCRbase son BE586744-STS, BE404728-STS y BE586111STS, específicos para identificar la translocación 7Lr#1S de Leymus y así agilizar la selección asistida. ^{(Qi et al., 2008)}. Partiendo de un universo puntual más amplio de marcadores que muestran la presencia de la translocación en el cromosoma 5B, se encontró y se recomienda, con base en los resultados de este estudio, que para identificar y utilizar la translocación en este grupo de línea específicas, el marcador con la serie wsnp_Ex_c5915_103 es útil.

Durante cada ciclo de recuperación de las líneas positivas para la translocación, la identificación-selección citológica-citogenética de plantas fue por la presencia de la translocación, y no por su comportamiento agronómico, por lo que pruebas preliminares de rendimiento durante el ciclo OI22-23 indicaron que los genotipos 925 y 901 del Cuadro 1 mostraron rendimientos superiores al testigo Borlaug 100 de 7.5 y 6.5 % respectivamente, pero también se identificaron líneas con rendimientos menores que el progenitor recurrente en 21 y 31 % en los genotipos 910 y 938 del Cuadro 1, respectivamente (datos sin publicar). Lo anterior indica que la translocación T5BS.5BL-5LR#1L no tiene efectos negativos en el rendimiento como se ha reportado en el caso de otras translocaciones como en la línea portadora de Sr26 (Australian Eagle Sr26) que mostró un efecto negativo en el rendimiento de grano de 12 %. ^{(Rai et al, 2019)}.

La translocación T5Lr#1L.5BL tampoco manifestó efectos altamente positivos como es el caso de otras translocaciones más pequeñas; por ejemplo, el brazo completo de una translocación (T4DL·4JsS) de Thinopyrum intermedium muy eficaz contra el Virus del Mosaico de las Venas del Trigo (WSMV), pero conllevaba una disminución sustancial del rendimiento en ausencia del virus; sin embargo, un genotipo recombinante más corto de esta translocación (rec213) tuvo un efecto favorable (≤ 12.6 %) sobre el rendimiento de grano ^{(Guttieri et al., 2023)}, o la translocación de 2NvS de Ae. ventricosa que confiere resistencia a múltiples enfermedades, está dando beneficios de rendimiento per se, incluso en la ausencia de la enfermedad ^{(Gao et al., 2021)}.

La obtención de líneas F₆ con rendimientos numéricos superiores o iguales al testigo Borlaug 100, sugiere la posibilidad de mejora si durante la identificación de plantas con la translocación, citogenéticamente o con el marcador aquí identificado, realizar selección en variedades o líneas avanzadas (F₈, F₉) para rendimiento o con base en los caracteres propios que aporta el género Leymus, tales como tolerancia a la sal y la sequía ^{(McGuire y Dvorak, 1981)}, resistencia a diversas enfermedades ^{(Mujeeb-Kazi et al.,1983)}, entre otros.

Numerosas evidencias indican que una selección adicional conduce a mejores resultados ^{(Li et al., 2007)}, tal es el caso con las introgresiones que incluyen Sr36/Pm6 de T. timopheevii, Lr28 de Ae. espeltoides y Sr38/Lr37/ Yr17 de Ae. ventricosa, ampliamente utilizadas en todo el mundo en variedades comerciales; o con la translocación 1RS.1BL, que en un tiempo se encontró en el 10 % de la diversidad genética mundial de trigo ^{(Balfourier et al., 2019)}. Igual situación ocurre para calidad; en este caso, destaca la translocación de T. aestivum-H. villosa 6VS.6AL ^{(Li et al., 2007)}.

Las líneas obtenidas de Borlaug 100 con la translocación presentaron la misma calificación de susceptibilidad a roya de la hoja que el progenitor recurrente; es decir, para este caso particular la translocación no tuvo efecto en los niveles de resistencia en estado de plántula, y lo mismo ocurrió en planta adulta debido a que los genes de resistencia que Borlaug 100 posee ^{(Ye et al., 2022)} son efectivos en planta adulta, por lo que Borlaug 100 y las líneas con la translocación fueron altamente resistentes en condiciones de campo.

Queda pendiente la exploración de la resistencia para otros casos de enfermedades propias del trigo harinero, en el entendido de que existen ejemplos de translocaciones provenientes de especies silvestres que confieren resistencia a plagas y enfermedades en algunos casos y no para otros ^{(Mohler et al., 2023)}. Se cita el caso de las introgresiones T01 (T4BS·4BL-7Lr#1S+T4BL7Lr#1S·5Lr#1S) y T14 (T6BS·6BL-7Lr#1S+T6BL·5Lr#1S) que fueron evaluadas para resistencia a fusarium de la espiga (Fusarium spp.), donde con la adición disómica 7Lr#1 fueron consistentemente resistentes, mientras que la adición disómica 5Lr#1 fueron susceptibles a la cenicilla polvorienta (Blumeria graminis f. sp. tritici) ^{(Qi et al., 2008)}. Las líneas obtenidas de Borlaug 100 con la translocación en un futuro inmediato serán probadas en contra de otras enfermedades, incluyendo la fusariosis de la espiga y para caracteres propios que aporta el género Leymus, como el caso especial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN). IBN es la capacidad natural de ciertas especies de plantas para liberar inhibidores de la nitrificación a través de exudados de las raíces que suprimen la actividad nitrificante, reduciendo así la nitrificación del suelo y la emisión de N₂O a la atmosfera. La actividad de BNI se localizó en el brazo corto del cromosoma Lr#3Nsb (Lr#n) de L. racemosus, mismo que ha sido transferido al trigo como T3BL.3NsbS, donde el brazo 3BS del cromosoma 3B del trigo fue reemplazado por 3NsbS de L. racemosus^{(Subbarao et al., 2021)}. Es posible que la translocación T5Lr#1L.5BL de L. racemosus también tenga inhibición biológica de la nitrificación (IBN) pero no se ha determinado con precisión, aunque se tienen evidencias de cierta actividad.

Conclusiones

Los marcadores moleculares mediante KASP™ y la técnica GISH identificaron y caracterizaron, de manera precisa, la introgresión-translocación de Leymus racemosus en las líneas recobradas BC7F6 de Borlaug 100. Los análisis de GISH de cromosomas somáticos en metafase confirmaron la presencia de la doble translocación terminal Triticum-L. racemosus denominada T5Lr#1L.5BL. Pruebas preliminares de rendimiento indicaron que la translocación no tuvo efectos negativos en el rendimiento de grano y tuvo efectos positivos en la resistencia a la roya de la hoja causada por el hongo Puccinia triticina. Para identificar y utilizar la translocación se sugiere el usó del marcador wsnp_Ex_c5915-103.